PL122289B1 - Process for preparing novel antibiotic - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku, oznaczonego symbolem C—15003.W wyniku badan skriningowych próbek gleby i innych materialów wyizolowano mikroorganizmy 5 wytwarzajace nowy antybiotyk. Mikroorganizmy te naleza do rodzaju Nocardia, a ich hodowla w odpowiedniej pozywce prowadzi do nagromadze¬ nia w niej antybiotyku.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza- io nia antybiotyku C—15003 skladajacego sie z jed¬ nego, dwóch lub trzech zwiazków o wzorze przed¬ stawionym na rysunku, w którym R oznacza grupe o wzorze —CO—CH/CH^, —CO—/CH2/2— —CH3 lub —CO—CH2—CH/CH3/1, polegajacy na 15 prowadzeniu fermentacji imkroorganizmu Nocar¬ dia nr C—15003 (IFO U3726) wyitwamzajacego an¬ tybiotyk, w pozywce zaiwierajacej zródlo przy¬ swajalnego wegla i azotu, a nastepnie wyodreb¬ nieniu z pozywki wytworzonego antybiotyku. . 20 W tekscie opisu, dla wygody zwiazek, w którym R oznacza grupe o wzorze —CO—CH/CH3/2 okre¬ sla isie nazwa „antybiotyk C—16003 P—3" luib w skrócie symbolem „C—15003 P—3", zwiazek, w któ¬ rym R oznacza grupe o wzorze —CO—/CH^—CH3 25 okresla sie nazwa „antybiotyk C—15003 P—3'" luib w skrócie symlboiem „C—115003 P—3'" a zwiazek w którym R oznacza grupe o wzorze —CO—CH2— —CH/CH8/2 oznacza sie nazwa „antybiotyk C—15003 P^4" liuib w skóncie symbolem „C^1500Q P^4". 30 2 Antybiotyk wytwarzany sposobem wedlug wy¬ nalazku zawierajacy jeden, dwa lub trzy zwiaz¬ ki o wzorze przedstawionym na rysunku, w któ¬ rym R ma wyzej podane znaczenie, okresla sie czasem jako antybiotyk C^15003, co nie powinno byc mylace ,poniewaz okreslenie to odnosi sie do mieszaniny aotybiotycznej, której nie rozdzielono na poszczególne zwiazki oznaczone podanymi wy¬ zej symbolami.Mikrobiologiczna charakterystyke szczepu wy¬ twarzajacego antybiotyk C—15003, szczepu actino- mycete C—115003, [wyizolowanego z gleby i innych materialów w wyniku badan skriningowych, okreslono sposobami analogicznymi do zapropo¬ nowanych przez Schrilinga i Cottlieba (Interna¬ tional Journal of Systematic Bacterioiogy 16, 313^340 /1966/). Wyniki obserwacji prowadzonych w temperaturze 28QC, w ciagu 21 dni sa naste¬ pujace: 1) Charakterystyka. morfologiczna. Grzybnia we¬ getatywna rozprzestrzenia sie dobrze i rozwija w rozgalezienia, zarówno na agarze jak i w po¬ zywce plynnej. Wiele sposród strzepków ma sred¬ nice 0,8 do 1,2 \nm, a w pewnych przypadkach moga one dzielic sie na fragmenty przypomiina- jaoe bakterie paleczkowe lub na krótkie odgale¬ zienia. Szczep daje dobre wzrosty na róznych po¬ zywkach taksonomicznych z grzybnia powietrzna nalozona na grzybnie wegetatywna, choc czesto przyjmuje postac tworów podobnych do koramii 122 289122 289 (50—200X200—1000 ^im), na których nastepuje dal¬ szy wzrost powietrzny. Grzybnia powietrzna cze¬ sto jest falista, a czasami napotyka sie konfigu¬ racje proste lub w postaci luznej spirali.Mikroporowate badania starszych hodowli wy¬ kazuja, ze jedynie w nielicznych przypadkach komórki koinidalne wystepuja w lancuchach, na-, tomiast zawiesiny komórkowe uzyskane z powierz¬ chni takich hodowli wykazuja w badaniach mi¬ kroskopowych wiele tworów w ksztalcie wydlu¬ zonej elipsoidy (0,8—1,2 ^mX4,8—6,9 jon) i elipsoi¬ dalnych (0,8—1,2X1,0—2,0 (jum), przypominajacych artrospory.Obserwacje . pod mikroskopem elektronowym wykazuja; ze powierzchnia powyzszych tworów jest ;gladka. 2); Skladniki, komórek. Szczep hodowano na wsttzasarce, w zmodyfikowanej pozywce ISP nr 1, w temperaturze 28°C, w ciagu 66 do 90 godzin.Po zakonczeniu hodowli komórki zbierano i prze¬ mywano. Sposobem B. Beckera i innych (Applied Microibiology 12, 421 (1964)) i sposobem M. P. Le- chevaliera (Journal of Laiboratory and Oinical Medicine 71, 934 (1968)) powyzsze cale komórki badano oa obecnosc kwasu dwuaminopimeilAnowe- go i sk'ad icukrow. Stwierdzono, ze kwas dwiuiamd- nopimelajnowy jesit konfiguracji mezo i zinaleziono plamy odpowiadajace giadaktozie i arabinozie. 3) Charakterystyka na pozywkach taksonomicz¬ nych. Szczep wykazal stosunkowo dobry wzrost na róznych pozywkach, z grzybnia wegetatywna bezbarwna do jasnozóltej w poczatkowych fazach hodowli i jasnozóltawobrazowa do zóltawobrazo¬ wej w fazach pózniejszych. W róznych pozywkach taksonomicznych szczep produkuje rozpuszczalne pigmenty, zólte do zóltawobrazowych. Grzybnia powietrzna jest proszkowata i zwykle daje umiarkowany wzrost, barwy bialej do zóltej luib jasmozoltawobrazowej. Charakterystyke szczepu w róznych pozywkach taksoniomiicznyich przedsta¬ wiono w tablicy 1.Tablica 1 Charakterystyka hodowlana szczepu C—15003 na pozywkach takS'onoimiicznych A) Agar sacharozowo-azotanowy Wizrost: (G): bujny, barwa jasmozólta, melonowa (3 ua)* do bursztynowej (3 1 c)*, tworza sie ciala podobne do koreimii Grzybnia powietrzna (AM): skapa, barwy bialej Rozpuszczalny pigment (SP): brak lub jasnozólta- wobrazowy B) Agar gUiceryinowo-azotanowy: C): umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 cm)*, tworza sie ciala podobne do koremii AM: umiarkowana, barwy bialej SP: brak (C) Agar glukozowoHaspiaragdnowy: C: umiarkowany, barwa jasnej nagietki (3 pa)* do jasmozóltej (2 pa)* SP: jasnozólty (2 pa)* AM: skapa, barwy bialej (D) Agar glicerynowe-asparaginowy: G. umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii AM: iskapa, (barwy bialej 5 SP: brak i(E) Agar skrobiowy: G: umiarkowany,, barwy kosci sloniowej (2 ca)*, do pszenicznej (2 ca)*, tworza sie ciala podobne do koremii 10 AM: obfita, barwy kosci sloniowej (2 ica)* SP: brak (F) Agar odzywczy: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej (2 ca)*, twonza sie ciala 15 podobne do koremii AM: skapa, barwy bialej SP: brak (G) Agar z jiablozianem wapnia: G: lumuairkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* 20 do pszenicznej (2 ca)* tworza sde ciala podobne do koremdii AM: umiarkowana, barwy bialej do kosci slonio¬ wej (2 ca)* SP: brak 25 (H) Agar z ekstraktem z drozdzy i z ekstraktem slodowym: G: umiarkowany, barwy bursztynowej <3 lc)* do jaanozóiltej (3 la)* tworza sie ciala podobne do koreimii 30 (I) Agar z maka owsiana: G: umiiarkowiany, barwy (kosci sloniowej (2 ca)* do zólcieni kolonialnej <2 ga)*, tworza sie ciala podobne do koremii AM: skapa, barwy bialej do jiasnozóltej 35 SP: brak lazem G: umiarkowany, barwy zólcieni kolonialnej (2 ga)* 40 AM: brak SP: zólcien kodoniaiLna (2 ga)* (K) Agar tyrozynowy: G: umiarkowany, barwy kosci sloniowej (2 ca)* do jasnozóltej melonowej (3 ca)*, tworza sie cia- 45 la podobne do koremii AM: umiarkowana, barwy bialej do kosci slonio¬ wej (2 ca)* SP: wielbladzi (3 ie)* 50 *) Oznaczenie barw wedlug Color Hommony Ma¬ nual, wydanie czwarte (Container Corporation of America, 1958) 4) Charakterystyka fizjologiczna. Charakterysty- 55 ke fizjologiczna szczepu przedstawiono w tablicy 2. Zakres temperatury wzrostu: 12—38°C. Dobry wzrost powietrzny ma agarze (ISP nr 2) wystepu¬ je w zakresie temperatur 20—35°C 60 Tablica 2 Fizjologiczna charakterystyka szczepu G—'15003 zakres temperatury dla wzrostu 12—38°C zakres temperatury dla wzrostu powietrznego 20^35°C •5 uplynnienie zelatyny dodatnie122 289 6 hydroliza skrobi: redukcja azotanów: peptonizacja mleka: koagulacja mleka: rozklad kazeiny: wytwarzanie pigmentów maleinoi- dowych rozklad tyrozyny: roziklad ksantyny: rozklad hipoksantyny: tolerancja na lizonym: tolerancja nia chlorek sodu: dodatnia dodatnia dodatnia ujemna dodatni ujemne (agar z pe- petoneim, ekstraktem z drozdzy i zelazem) dodatnie (agar ty- rozynawy) dodatni ujemny ujemny dodatnia 2*/o (5) Wykorzystanie zródel wegla. Wykomysitanie róznych zródel wegla badano stosujac pozywke opisana przez Pridhamia i Goifeblieba (Jourmal ocf Bacteriology 56, -107 (1&5S) i pozytwke podsitaiwowa o tym samym skladzie + O^/o ekstraktu z dro¬ zdzy.Uzyskane widmo przedstawiono w tablicy 3.Utylizacja zródel Zródlo wegla D-ksyloza L-ainabinoza D-glukoz/a D-gaHaktoza F-fruktoza L-ramnoza D-mannoza sacharoza rafimoza i-inozytol D-mannitol gfl/iceryna Tablica wegla pnzez skrobia rozpuszczalna laktoza maltoza trehialoza kontrola 3 szczep nr C--15003 Wzrost + + -H + + + + + j+ + + + + + ± — + + — + ± + + +• + + + + + + + +,+ + + ± — + + + + + + ^_ *) pozyiwika podstaiwowa + 0,1% ekstraktu z dro¬ zdzy Skala ocen: + + + wzrost obfity, ++ /wzrost do¬ bry, + wzrost, ± wzrost slaby, — brak wzrostu <6) Dalsza charakterystyka. Komórki zbierano sposobem opisanym w 2), a DNA preparowano sposobem analogicznym do opisanego przez J. Mar- mura i innych (Journal of Molecular Biology, 3, 208, 1961).Zawartosc G—C (guanina-cytozyna) w DNA wy¬ nosi okolo 71 mol0/*.Wybarwianie Grama grzybni wegetatywnej szczepu jest dodatnie.Powyzsza charakterystyke szczepu mor C—15003 10 15 20 25 30 35 40 - 45 50 55 porównano z odpisanymi w dzielach S. A. Wska¬ zana „The Actinomycetes" tom 2 (The Williams and Wiillkins Co., 19G1) i R. E. Buchanana i N. E.Gibbemza „Bergey's Mannjuel of Deteirminative Ma- cteriology wydanie ósme, 1074 oraz w innej lite¬ raturze.Szczep C—15003 nalezy do grupy III rodzaju Nocardia, a z faktu, ze opisana charakterystyka nie odpowiada zadnemsu ze szczepów znanych wy¬ nika, ze szczep C—15003 jest mikroorganizmem nowego gatunku.Szczep C—15003 zdeponowano w Fermentation Be- search Imstitute, Agency ef Industrial Science and Teahnology (FSRM) z numerem 3992 i w Imstitute for Fermentation, Osaka (IFO) z numerem 1FO 1-3726 oraz w The Amerdjcen Type Culture Cofllec- tion (ATCC), Maryland, USA, z numerem 31281.Jako pozywke do hodowli szczep/u Nocardia nr C^15003 wytwarzajacego antybiotyk C—15003 mozna stosowac jakakolwiek pozyiwke plynna lub stala, zawierajaca skladniki odzywcze wykorzysty¬ wane przez szczep. W celu uzyskania wysokiej wydajnosci korzystnie jest stosowac jpozywke ply¬ nna. Pozywka musi zawierac zródla wegla i azotu przyswajrane i metabolizowane przez szczep, sklad¬ niki nieorganiczne, sliadowe sikladniki odzyiwcze itp. Jako przyklady zródel wegla mozna wymienic glukoze, sacharoze, maltoze, dekstryne, skrobie, gliceryne, mannit, sorbit, itp., tluszcze i oleje (np. olej sojowy, olej smalcowy, olej kurzy dtp.) i inne.Zródlem azotu moze byc np. ekstrat miesny, su¬ szone droizdze, maka sojowa, mamok kukurydziany, pepton, kazeina, maka z nasienia bawelny, odpa¬ dowa melasa, mocznik, sole amonowe (np. siar¬ czan amonu, chlorek amonu, azotan amonu, octan amonu iitp.) i inne.Pozywka moze ponadto zawierac sole sodiu, po¬ tasu, wapnia, magnezu, zelaza, manganu, cynku, kobaltu, niklu, itp., sole kwasu fosforowego, kwasu borowego itp. oraz sole kwasów orgamdicznyich, jak octany i propioniany.Do pozywki mozna równiez dodac róznych ami¬ nokwasów, jak np. kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, alanina, glicyna, lizyna, metionina, prolina itp., peptydów, np. dwupeptydów, trójpep- tydów itp., witamin np. Bi, B2, kwasu nikotynowe¬ go, Bi2, C, E itp., kwasów nukleinowydh, np. pi- ryny, pirymidyny i ich pochodnyclh dtp. w ceki doprowadzenia pH do pozadanej wartosci mozna do pozywki dodac rmeorganicznych lub organicz¬ nych 'kwasów, zasad, buforów itp.Jako czynniki przeciwdztiialajace pienieniu moz¬ na stosowac w pozywice odpowiednie ilosci olejów, tluszczów, srodków rjowierzchniowo czynnych itp.Hodowle mozna prowadzic stacjonarnie, na wstrzasarce, podpowierzchiniowo-aerobowe i w innych warunkach. W celu uzyskania wysokiej wydajnosci korzystnie jest oczywiscie prowadzic hodowle podipowierzchniowo-aeiroibowa.Warunki hodowli sa oczyiwiscie zalezne od wla¬ sciwosci fizycznych i skladu pozyiwki, szczepu, spo¬ sobu hodowli i innych czynników, jednak zwy¬ kle korzystnie jest prowadzic inkubacje w tempe¬ raturze 20—35°C, przy poczatkowej wartosci pH 7,0 lub zblizonej.\ x 7 Szczególnie pozadana jest temperatura 23—<30°C .w przejsciowym etapie hodowli, z poczatkowa wartoscia pH 6,5 do 7,5. Gzias inkubacji równiez jest zmfteony, w zaleznosci od wyzej wymienio¬ nych czynników. Zaleca sie prowadzac inkubacje do uzyskania maksymalnej wartosci miana poza¬ danego antybiotyku.W przypadku hodowli na wHtrzasarce lub pod- powierzichniowej-aerabowej, czas dmitaubacji wy¬ nosi zwykle od okolo 48 do 144 godzin.Aktywnosc antybiotyku oznacza sie stosujac jaiko oinganiiizni testowy Tetrahymema pyritanmis W. Powyzszy organizm hoduje sie na pozywce te¬ stowej (20 g proteozy-pepitoinu ktu z drozdzy (Difco), 2 g glukozy, 1000 ml wody destylowanej i 10 ml 1 M buforu fc«ifbranowego —pH 7,0)) w 28°C w ciagu 44 do 48 godzin, a akty¬ wnosc antybiotyku oznaozia metoda seryjnych roz- cienczen, mierzac metnosc hodowli oraz technika chromatografii cienkowarstwowej (TLC), dalej opisanymi.Nowy antybiotyk C^h15003 P—3, P—3* A/lub P—4 jest wytwarzany i akumuluje sie w brzeczce ho¬ dowlanej zarówno pozakoniórkowo jak i wew- naltirzkomórkiowo.Powyzsze substancje wykrywa sie równiez chro- matogirafia cienkowarstwowa. Przez saczenie lub wirowanie brzeczke fermentacyjna rozdziela sie na komórki i ciecz, a ciecz ekstrahuje ta sama objetoscia octanu etylu. Komórki zalewa sie ta sama iloscia 70% wodnego acetonu, miesza w cia¬ gu godzony w temperaturze 20°C i odsacza zawie¬ sine. Z przesaczu od|pedza sie aceton, a otrzyma¬ ny roztwór wodny ekstrahuje octanem etylu.Kazdy z ekstraktów zateza sie do 1/100 objetosci poczatkowej i poddaje chromatografii cienkowar¬ stwowej na plytkach z zelem krzemionkowym (Merck, RFN, Kieselgel 60 F^, warstwa giruibosci 0,25 mm, wymiary plyty 20X20, uklad rozpuszczal¬ ników chloroform-metanol 9:1). Aktywnosc okresla sie na podstawie intensywnosci plam wykrywanych przez napromieniowanie swiatlem nadfioletowym 2537 nm.Poniewaz C—115003 P^3, P^3' i/lub P—4, wytwo¬ rzone w (ten sposób w hrzeszce fermentacyjnej sa zwiazkami iipofflowyimi i obojejtnymi, mozna je do¬ godnie odzyskac metodami wyodrebnienia i oczy¬ szczania zwykle stosowanymi do odzyskiwania ta¬ kich metabolitów.Przykladowo, mozna zastosowac sposoby czy¬ niace uzytek z róznicy rozpuszczalnosci antybio¬ tyku i zanieczyszczen frakcjonowanie wykorzy¬ stujace róznice w powinowactwie adsorpcyjnyim na róznych adsorbentach, jak wegiel aktywny, makropoirowaite zywice niejonowe, zel krzemion¬ kowy, tlenek glinu iitp., usuwanie zanieczyszczen za pomoca zywic jonitowych itp., oddzielnie lub w odpowiedniej kombinacji lub powtórzeniach.Poniewaz, jak wspomniano, C^15003 P—3, P—3* i P—4 wystepuja zarówno w plynie jak i w ko¬ mórkach, antybiotyk wyodireibnia sie i oczyszcza za pomoca adsorbentu, jezeli takowy jest stoso¬ wany, badz to bezposrednio badz tez po ekstra¬ kcji rozpuszczalnikiem w przypadku plynu lub po 8 ekstrakcji rozpuszczalnikiem w przypadku komó¬ rek. Ekstrakcje rozpuszczalnikiem mozna przepro¬ wadzic np. (1) z brzeczki hodowlanej przed od¬ dzieleniem komórek (2) z komórek i plynu uzy- 5 skanego przez saczenie, wirowanie lub innymi spo¬ sobami. Niezalezna ekstrakcje plynu i komórek mozna korzystnie przeprowadzic nizej opisanym sposobem.Rozpuszczalnikami odpowiednimi do ekstrakcji io plynu sa nie mieszajace sie z woda rozpuszczal- niJki organiczne, jak estry kwasów tluszczowych, np. octan, etylu i octan amylu, alkohole, np. bu¬ tanol, chlorowcowane weglowodory, np. chloro¬ form i ketony, np. keton matyioizobutyilowy. 15 Ekstrakcje przeprowadza sie przy odczynie bli¬ skim obojetnemu, korzystnie plyn hodowlany do¬ prowadzony do wartosci pH 7 ekstrahuje sie octa¬ nem etylu. Eksitrakt przemywa sie woda i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. 20 Do koncentratu dodaje sie niepolarnego rozpu¬ szczalnika, jak eter naftowy lub heksan, uzysku¬ jac surowy produkt I, zawierajacy zwiazek czyn¬ ny.Poniewaz w chromatografii cienkowarstwowej wykrywa sie szereg plam poza odpowiadajacymi antybiotykowi C—15003, produkt I poddaje sie procesowi oczyszczania. Uzyteczne sa rutynowe pmocedury, zwlaszcza chromatografia adsorpcyjna na takich zwykle stosowanych adsorbentach jak zel krzemionkoiwy, makroporowate niejonowe zy¬ wice adsórpcyjne itp.Najkorzystniejszym adsorbentem do oczyszcza¬ nia surowego produktu I jest zel krzemionkowy.Chrornaitogram mozna rozwijac poczatkowo eterem naftowym i heksanem, a elucie antybiotyku C— —45003 prowadzic dodajac rozpuszczalnika polar¬ nego, jak octan etylu, aceton, etanol lub metanol.W typowym procesie z zastosowaniem jako nos¬ nika zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05— —0,2 mm) clhiromatogriafie kolumnowa prowadzi sie mieszanina heksanu z octanem etylu o wzrasta¬ jacym stezeniu drugiego skladnika. Eluat zbiera sie i bada chromatografia cienkowarstwowa, a frakcje zawierajace C^15003 laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncenitratu do¬ daje sie eteru naftowego lub heksanu, uzyskujac surowy produkt II.Poniewaz produkt ten nadal zawiera zanieczy- 50 szczenia, oczyszcza sie go dalej, np. na drugiej kolumnie z zelem krzemionkowym, stosujac (inny uklad rozpuszczalników". Stosowany do tego celu uklad rozwijajacy moze skladac sie z chlorowco¬ wanego weglowodoru, jak dwuchlorometan lub 55 chloroform, z dodatkiem rozpuszczalnika polarne¬ go, jak alkohol, np. etanol lub metanol, keton, np. aceton lub keton me/tyloetylowy itp.W powyzszy sposób wyodrebnia sie antybiotyk C—16003. Kolejnosc ukladów rozpuszczalników dla ao pierwszej i drugiej kolumny mozna odwrócic, a jezeli to jest konieczne, lacznie z powyzszymi ukladami mozna uzyc innych, zwyklych rozpu¬ szczalników organicznych.W przypadku oczyszczania surowego produktu 65 ii za pomoca makroporowatej zywicy adsorpcyj-122 289 9 10 nej, elucje antybiotyku C—15003 przeprowadza sie mieszanina wody z nizszym alkoholem, niz¬ szym ketonem lub astrem.Nizszym alkoholem moze byc np. metanol, eta¬ nol, propanol lub butanol, a nizszym ketonem np. aceton lub keton metyloetyiowy. Bstrem moze byc np. octan etylu. W typowej procedurze, surowy produkt II rozpuszcza sie w 60% wodnym meta¬ nolu i adsorbuje na kolumnie z sombentem Dieion HR—10 (Mitsubishi Kasei K. K.). Kolumne prze¬ mywa sie 70% wodnym metanolem, a nastepnie eluuje 90% wodnym metanolem, uzyskujac anty¬ biotyk C^15003.W kazdym z wyzej opisanych procesów frakcje zawierajace antybiotyk C—15003 laczy sie i od¬ parowuje pod zmniejszonym cdsaiieniem. Do su¬ chego produktu dodaje sie 5 do 8 objetosci octanu etylu i pozostawia mieazaniine w spoczynku, co ipowoduje wydzielenie krysztalów antybiotyku C—15(003, Krysztaly te zawieraja C^15003 P^3, P—3' i P^.Zwiazki oddziela sde od siebie stosujac adsor¬ bent, jak wyzej wspomniane. Frakcjonowana edu- cje mozna przeprowadzic, np. stosujac zel krze¬ mionkowy Lub makirpporowiata niejonowa zywice i wyzej podane rozpuszczalniki. Jezeli stosuje sie np. zel krzemionkowy, to 'rozwijanie prowadzi sie heksanem, octanem etylu lub mieszanina chloro- form-meibanol, uzyskujac kolejno C—15003 P—4, P—3', Pi—3. Po analizie chromatografia cienJkowar- sittwowa, ifrakcje zawierajace C—115003 P—4, P—3* 5 i P—3 zateza sie pod zmniejszonym .cisnieniem, a do koncentratu dodaje octanu etylu.W ten sposób odpowiednie zwiazki uzyskuje sie w postaci krysztalów. Pinzy stosowaniu jako adsorbentu makroporowatej zywicy niejonowej, 10 elucje prowadzi sie giradientoiwio, stosujac mie¬ szanine alkoholu, ketonu lub estru z woda, o zmiennym udziale skladników.Przykladowo, eflucje gradientowa z zastosowa¬ niem 601% wodnego metanolu i 95% wodnego me- 15 tanoliu z dodatkiem 5% chlorku sodu, uzyskuje sie C^15003 P^3, P^3' i P—4 w wyzej podanej ko¬ lejnosci. Po zebraniu i detekcji z zastosowaniem chromatografii cienkowiarsitwowej, kazda z grup aktyfwnych frakcji odparowuje sie pod zmmiejszo- 2o nym cdsnieniem i krystalizuje z octanem etylu.Wydzielone krysztaly zawieraja octan etylu jako rozpuszczalnik krystalizacji, a po suszeniu nad pieciiotlenkiem fosforu w temperaturze 70°C w ciagu 8 godzin wykazuja wlasciwosci fizyczne i 25 chemiczne przedstawione w tablicy 4. 1 1 Temperatura tchnienia <°C) 1 SJkreoalnosc wlasciwa wg 1 Analiza elementarna Znaleziono: (%) 1 Analiza elementarna Obliczono (%) 1 Widmo absorpcji w nadfiolecie nm (e) (w metanolu) 1 Widmo absorpcji 1 w podczerwieni (cm-1) KBr 1 Widmo magnetycznego (rezonansu jadrowego (ppm) 100 MHz w CDCI3 Widmo masowe (m/e) Tablica 4 Antybiotyk C^15003 P—3 C32H4SC1NZ09 = 635,169 2 \ 190—192 —136° ± 10° (c = 0,375 CHCI3) C 60,06 H 7,04 N 4,33 a 5,37 C 60,51 .H 6,82 N 4,41 Cl 5,58 233 (30250), 240 (przegiecie 28450), 262 (27640), 280 (5750) 288 (5700) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1245, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 1,27 (d) (3H) 1,28 (d) (3H) 573, 485, 470, 450 P^3' C32H43CIN2O9=635,169 3 182^185 134° ± 10° (c = 0,11 CHCI3) 60,09 7,02 4,34 5,99 60,51 6,82 4,41 5,58 233 (30155), 240 (przegiecie) 252 <27600), 280 (5750) 288 (5700) 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, L080, 1038 1,06 (t) (3H) 573, 485, 470, 450 P^l C33H45CINZ09=649,196 4 177—180 —142° ± 10° (c = 0,522 CHCI3) ¦60,65 7,05 4,25 5,23 61,05 6,99 4,32 5,46 233 (29900), 240 (przegiecie 28240) 1 252 (27590), 280 (5712), 288 (5680) | 1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 | 1,03 (d) (6H) ' 587, 485, 470, 45011 122 289 12 c.d. tablicy 4 ¦1 Rozpuszczalnosc Reakcje barwne: 2 3' 4 Nierozpuszczalny w eterze naftowym, heksanie i wodizie, slabo rozpuszczalny w benzenie i eterze, rozpuszczalny w chloroformie, octanie etylu, ace¬ tonie, etanolu, metanolu, pirydynie, cztarowodo- rafuranie i dwiHnetylosultfotlenku Dragendorfa: dodatnia Beilsteiina: dodatnia dodatnia dodatnia dodatnia dodatnia Nia podstawie wyzej podanego wzoru sumarycz¬ nego i dalej przedstawionej czynnosci pa^eciwimi- krobowej i przeciwnowotwarowej, porównano antybiotyk C—15003 ze znanymi grupami antybio¬ tyków.W literaturze nie znaleziono wyraznej grupy podobnej do antybiotyku C^15003, jednak poszu¬ kiwanie substancji o absorpcji w nadfiolecie po¬ dobnej do wykazywanej przez C—15003 posród zwiazków pochodzenia roslinnego i innych orga- niicznyah zwiazków pochodizeniia naturalnego do¬ prowadzilo do grupy maylanacyny, a na podsta¬ wie wzorów sumarycznych przyjeto, ze antybio¬ tyk C—15003 nalezy do zwiazków z grupy lmay- tamacyny, zawierajacych dwa atomy azotu. May- taniacyna zostala otrzymana jako skladnik roslin¬ ny i opisana w Journal of American Chemical Society 97, 5294 (1975). Widmo masowe maytana- cyny jest nastepujace: M+^(a) M+^(a+b) 545 485 (a) = HaO + HNCO 485^CH3 485—Cl 470 450 (b) = R—COODH Obecnosc pasim m/e 485, 470 i 450 w widmach masowych C^15003 P^3, P^3' i P—4 przekonuje, ze powyzsze zwiazki maja szkieletowa strukture identyczna jak maytanacyna, a od maytanycyny rózni je grupa acylowa w polozeniu 3. Z powyz¬ szego wynika, ze antybiotyk C—16003 jest nowym zwiazkiem.Przy degradacji C—15003 P—3, P^3' i P—4 zasadami i analizie chromatografia gazowa uwol¬ nionych kwasów ikanboksylowych znaleziono od¬ powiednio kwas izomaslowy, maslowy i dizowale- rianowy.Czynnosc biologiczna A) Czynnosc przeciwmikrohowa Stosujac jako pozywke agar tryptykazowo-so- jowy (BBL), metoda krazków bibuly oznaczono stezenia hamujace wzrost nizej podanych mikro¬ organizmów.Krazki bibuly (Toyo Scisakushe, typ cienki, sre¬ dnica 8 mm) zaiimpiregnowiano 0,02 ml roztworu C—tl(5003 P-r-3, P^3' i P^4 o stezeniu 300 |xg/ ml i umieszczono na plytce zaszczepionej mikro- oiiganizmem, w celu okreslenia minimalnego ste¬ zenia hamujacego. Antybiotyki nie wykazaly czyn¬ nosci w stosunku do nastepujacych mikroorganiz¬ mów: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aerugiinosa, Staphyloco- ccus aureus, Bacdllus subtolliis, Bacillus cereus, 15 20 30 35 40 50 60 Klebsieila pneumoniiae, Serraitia imarcescens, My- cobacterium avium.Na plytach agarowych o skladzie: 3,5 g wodoro- fosforanu sodu, 0,5 g dwuwodoroifosifioranu potasu 5 g ekstraktu z drozidzy (Difco), 10 g glukozy, 15 g agaru, 1000 ml wody destylowanej (pH 7,0). Mini¬ malne stezenie hamujace wzrost Talaramyces ave- Baneus wynioslo 3 \ug/mL dla C^15003 P^3 i P—3' i 1,5 |jg/nil dla C^15003 P—4.W badaniach dzikiego szczepu Tetrahymena py- oifoimiis. Na pozywce o skladzie 2,0 g proteozy- -peptynu (Difco), 1 g ekstraktu z drozdzy, 2 g glu¬ kozy, 1000 ml wody destylowanej i 10 ml 1 M buforu fosforanowego (pH 7,0), przy hodowli pro¬ wadzonej w 28°C w ciagu 44 do 48 godzin, meto¬ da seryjnych rozoienczen, stwierdzono, ze hamo¬ wanie wzrostu nastepuje przy stezeniu 1 ^g/ml dla C—15003 P—3 i P—3' i 0,5 fjig/ml dla C—15003 P—4.Czynnosc przeciwgrzybowa przedstawiono w ta¬ blicy 5. Jak wynika z tej tablicy, C—15003 hamuje wzrost mikroorganizmów powodujacych choroby roslin. Badania przeprowadzono metoda krazko¬ wa, umieszczajac krazki bibuly impregnowane 0,02 ml roztworu C—15003 o stezeniu 1000 ng/ml na plytach zaszczepionych mikroorganizmami.Tablica 5 Badany organazim 1 Altermaria ikikuchiama Fusicladiium levieri Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Pyricularia oryzae Elsinoe fawcetti Fusardium oxyspo- rum f. ouciumeri- num Nr IFO 2 7515 6477 5273 —. 8417 —• Pozy¬ wka 3 PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* Go¬ dzi¬ na 4 48 9(0 48 48 m 48 Sre¬ dni¬ ca ha- imo- wia- nia 5 38 68 65 53 65 2013 cd. tablicy 5 1 Guignardia lari- cina CochlMoborus miyabeanius Diaporthe cditri Gaibfoerella zeae Scflerotinia siclerotioruim Venitirria pLrtijna PeMicuiariia sasakii Pythium ¦aphanideanmaitujm Botirytis ciinerea Aspergillus ndger | Penicilliufn 1 chrysc^enium i Rhizopus nfiigrdcans Sacchanamyces cerevdsdae Rhodoitorula rubra Trdichópihyton rubrum Trichophyton mantagarophytes Gandida albkans Camddda utilis Cryptococcus neoformains 2 7888 5277 9170 8850 9395 6189 9253 7(03,0 — 4066 4626 6188 0209 0907 5467 7522 0563 0619 0410 1 3 PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* PSA* GB** GB** GB** GB** GB** 4 48 48 48 48 90 48 48 48 48 48 48 4)8 48 48 46 48 48 48 48 5 12 60 55 37 65 50 50 58 i 43 0 35 25 0 28 318 38 0 0 43 * PSA: agar ziemniaczano-siachariazowy * GB; agar odzywczy z glukoza B) Czynnosc przeciwinowotworowa Badano czynnosc terapeutyczna C-15003 P-3, P-3' i P-4 (podawanych dootezewinowo w ciagu 9 kolejnych dni) nia bialaczke P388 u myszy (1X10* komórek/zwierze, mysz, transplantacja do¬ otrzewnowa).Wyniki wskazuja, ze w sensie przedluzenia zy¬ cia powyzsze zwiazki maja czynnosc przeciwino¬ wotworowa 200% w dawice 0,00625 mg/kGndofoa.C) "Toksycznosc W próbie toksycznosca ostrej na mysizach, obej¬ mujacej dootrzewnowa iniekcje C—15003 P—3, P—3' i P—4, wszystkie powyzsze antybiotyki wy¬ kazaly wartosc LD50 powyzej 0,313 mgyikg.Jak wyzej wspomniano, antybiotyk C—15003 wykazuje wysoka czynnosc hamowania wzrostu grzybów i pierwotniaków, w zwiazku z czym jest wartosciowym czynnikiem przeciwgrzybowym i piizeciwpieirwotniakowyjm.Ponadto, poniewaz antybiotyk C^15003 prze¬ dluza zycie dotknietych nowotworem ssaków (np. myszy), oczekuje sie, ze bedzie on uzyteczny rów¬ niez jako lek przeciwnowotworowy.Antybiotyk C—15003, bedac czynnikiem ' prze¬ ciwgrzybowym i przeciwpierwotaiakowym, moze 2 289 14 byc z korzyscia stosowany do modyfikacji ekolo¬ gii bakteryjnej w glebie, osadzie czynnym, zwie¬ rzecym plynie ustrojowym itp.Tak wiec, w przypadku izolacji cennych foak- 5 term z próbek gleby lub gdy nalezy ocenic dzia¬ lanie bakterii niezaleznie od dzialania grzybów i pierwotniaków w zwiazku z operacja i analiza ukladu osadu czynnego, stosowanego w obróbce wody odpadowej, antybiotyk C—0.5003 mozna sto- 10 sowac do uzyskania wybiórczego wzrostu flory bakteryjnej, z hamowaniem wzrostu towarzysza¬ cych w próbce grzybów i pierwotniaków. W ty¬ powym przypadku próbke dodaje sie do cieklej lub isftalej pozywki, zawierajacej w 1 ml 0,1 mi 15 roztworu antybiotyku w 1% metanolu w wodzie o stezeniu 10 do 100 yugjfinn.Antybiotyki C—15003 mozna równiez stosowac jako czynnik ptrzecawimikrobowy do leczenia cho¬ rób roslin, powodowanych przez milkrooiiganiizmy 20 wymienione w tablicy 5.W typowym przypadku antybiotyk C—15003 stosuje sie w postaci roztworu w 1% metanolu w wodzie, o stezeniu 0,5—5 (jug/iml. Anitybiotyk C—-15003 mozna stosowac przykladowo do zwalcza- 25 nia czerwonawobrazowej zgnilizny otoczki, zwarze- niia, plamistosci lisci spowodowanej Helminthospo- ri'um i rdzy otoczki roslin ryzu.Wynalazek jest ilustrowany ponizszymi przykla¬ dami. Jezeli nie zaznaczono inaczej, „czesci" ozna- 30 czaja czesci wagowe, stosunek miedzy ,,czeslCialmd,, a „czesciami objetosciowymi" odpowiada stosunko¬ wi miedzy „gramami" a „-miiliMtrami", a „%" od¬ nosi i&ie do „wagi/objetosc".Przyklad I. Hodowle szczepu Nocardia 35 C^15003 (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281) na agarze z ekstraktem z drozdzy i ekstraktem slodo¬ wym szczepi sie fermentor o objetosci 200 czesci, zawierajacej 40 czesci oibjetosciowych pozywki ho¬ dowli posiewowej (2% gliukozy, 3% skrobi rozpu- 40 szazalneg, 1% isuirowej maki sojowej, 1% naimoksu kiukurydzianeigo, 0,5% poliipeptomai, 0,3% NaO, 0,5% GaC03, pH 7,0.Zaszczepiona pozywke iintaubuje sie w tempera¬ turze 28°C w ciagu 48 godzin, otrzymujac inokulum. 45 0,5 czesci objetosciowych tak otrzymanego inoku¬ lum przenosi sie do fermentora o pojemnosci cze¬ sci objetosciowych, zawierajacego 40 czesci obje¬ tosciowych pozywki fermentacyjnej, zlozonej z 5% dekstryny, 3% namoku kukurydzianego, 0,1% po- 50 lipeptoniu i 0,5% CaC03 pH 7,0) i w temperaturze 28°C, w ciagu 90 godzin prowadzi fermentacje, o- trzymujac inokulum (hodowle posiewowa).Z oznaczenia metoda seryjnych rozcienczen, z zastosowaniem jako organizmu testowego Tetrahy- 55 mena pyriformis i antybiotyku C—15003 P—3 jiako standardu, miano hodowli wynosi 25 ng/tmi.Przyklad II. 10 czesci objetosciowych inoku¬ lum (posiewu) otrzymanego w przykladzie I prze¬ nosi sie do fermentom o objetosci 2000 czesci, za- 60 wierajacego 500 czesci objetosciowych pozywki ho¬ dowli posiewowej (jak powyzsza) i inkubuje w temperaturze 28°C w ciagu 48 godzin. 500 czesci objetosciowych otrzymanej hodowli przenosi sie do tanku z nierdzewnej stali o pojemnosci 50 000 85 czesci oibjetosciowych, zawierajacego 30 000 czesci15 122 289 16 objetosciowych pozywki hodowli posiewowej i pro¬ wadzi fermentacje w .temperaturze 28^0, przy na¬ powietrzaniu (30 000 czesci objetosciowychyminute), mieszaniu (280 obwtó(w/miiriuitey!l/2DT/), pod we¬ wnetrznym aisnieniem (0,980-102 kPa), uzyskujac hodowle posiewowa. Hodowla ta posiewa sie zbior¬ nik z ndemdzewiniej stali o opjemnosci 200 000 czesci objetosciowych, zawierajacy 100 000 czesci objeto¬ sciowych pozywki fermentacyjnej, podobnej do sto¬ sowanej w przykladzie I, stosujac anokuilum. w ob¬ jetosci 10% pozywki.Zaszczepiana pozywke dinkubuje sie w tempera¬ turze 28°C, przy napowietaainiu (100 000 czesci ob¬ jetosciowych/minute), mieszaniu (200 obrotcWiminu- te/l/2DT), pod wewnetrznym cisnieniem 0,980 ^lO2 kPa), w ciagu 90 godzin. Z oznaczenia sposobem opdisanyim w przykladzie I, miano hodowli wynosi 25 n6/lml Przyklad III. 95 000 czesci objetosciowych ho- dowM otrzymanej w przykladzie II zadaje sie 2000 czesci sorbentu Hyifilo-supercelR (Jones and Man- vtille Pirodujcts, USA). Po dokladnym wymieszaniu saczy sie na filtrze cisnieniowym, uzyskujac 85 000 czesci objetosciowych przesaczu i 32 000 czesci wil¬ gotnych komórek. Przesacz (85 000 czesci objetos- cdowych) miesza sie i ekstrahuje 30 000 czesci oc¬ tanu etylu.Powyzszy zabieg powtarza sie. Ekstrakty laczy sie, dwukrotnie przemywa 30 000 czesci objetos- cdowycn wody, suszy dodatkiem 500 czesci bezwod¬ nego siarczanu sodu i pod zmniejszonym cisniendem zaiteza do 200 czesci objetosciowych. Do koncen- traitu dodaje sie eteru naditowego i odsacza wy¬ tracony osad (53 czesci).Powyzszy surowy produkt I miesza sie z 100 czesciami objetosciowymi octamu etylu i odsacza czesci merozpuszczone. Przesacz miesza sie z 10 czesciami zelu krzemionkowego (Merck, RFN, 0,05—0,2 mm) i pod zmniejszonym cisnieniem od* pedza octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z zelem krzemionkowym (400 czesci ob¬ jetosciowych). Elucje prowadzi sie 500 czesciami objetosciowymi heksanu, 500 czesciami objetoscio¬ wymi mieszaniny heksannootan etylu (3:1), 500 czesciami objetosciowynid mieszaniny heksan-octan etylu (1:1), 500 czesciami obje^ciowymi miesza¬ niny heksan-ootan etylu (1:3), 500 czesciami ob¬ jetosciowymd octanu etylu, 1000 czesci objetoscio¬ wych mieszaniny octan efyiu^metanol (50:1) i 1000 czesci objetosciowych mieszaniny octan etylu-me- tanoi (25: 1), zbierajac wyciek frakcjami po 100 czesci objetosciowych.Z kazdej frakcji 1 czesc objetosciowa odparowuje sie do sucha, a do pozostalosci dodaje 0,1 czesci ob¬ jetosciowej octanu etylu. Wyitracona mieszanine nanosi sie na plyte szfldama, powleczona warstwa zelu krzemionkowego (Merck, RFN, F^, 0,25 mm, 20X20), w odleglosci 2,5 cm od dolnej krawedzi i na dlugosci okolo 17 cm rozwija ukladem roz¬ puszczalników octan etylu-rneftanol (19 :1). Po roz¬ winieciu przeprowadza sie detekcje w swietle nad¬ fioletowym (2537 nm).Itaakcje czynne nr 23—28 o Rf 0,0—0,66 zibiera sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci po okolo 20 czesci objetosciowych. Do koncemtratów dodaje sie po 150 czesci objetoscio¬ wych eteru naftowego, otrzymujac 15 czesci suro¬ wego produktu II.Przyklad IV. Pirzy mieszaniu, 32 000 czesci 5 wilgotnych komórek uzyskanych w przykladzie III ekstrahuje sie 50 000 czesci objetosciowych 70% wodnego acetonu, w ciagu 3 godzin, a nastepnie odsacza na Mtrze cisnieniowym.Operacje ekstrakcji 50 000 czesci objetosciowych 10 70% wodnego acetonu i saczenia powtarza sie.Przesacz laczy sie i pod zniniejszonym cisnieniem odpedza z nich aceton. Uzyskany uklad wodny przepuszcza sie przez kolumne z 5000 czesci obje¬ tosciowych sorbantu Diaion HP—10 (Mitsubishi Ka- 15 sei K.K.). Kolumne przemywa sie 2000 czesci obje¬ tosciowych wody i 50% wodnego metanolu a na¬ stepnie eluuje 15 000 czesci objetosciowych wod¬ nego meitanolu.. Wyciek odparowuje sie pod zmniejszonym cis- 20 mieniem do 3000 czesci objetosciowych i wstrzasa z 3 000 czesci objetosciowych octanu etylu. Powyz¬ sza procedure powitarza sie. Ekstrakty organiczne laczy sie, przemywa woda, suszy dodaniem bez¬ wodnego siarczanu sodu i pod zmniejszonym ci- 25 snieniem odparowuje do 200 czesci objetosciowych.Po dodaniu eteru naftowego odsacza sie wytra¬ cony osad (28 czesci). Powyzszy produkt .oczyszcza sie na kolumnie z zelem krzemionkowym, otrzy¬ mujac 8,0 czesci surowego produktu II. 30 Przyklad V. W 10 czesciach objetosciowych octanu etylu rozpuszcza sie 1,5 czesci surowego produktu II otrzymanego w przykladzie III, a roz¬ twór dokladnie miesza z 4 czesciami zelu krze¬ mionkowego (Merck, RFN, 0,05^0,2 mm). 35 Pod zmniejszonym cisnieniem odpedza sie octan etylu. Pozostalosc nanosi sie na góre kolumny z 300 czesciami objetosciowymi zelu krzemionkowego, po czym przemywa kolumne wpierw 500 czesciami objetosciowymi chloroformu, a nastepnie edouje 40 kolejno 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny chloroformnmeitanol (50:1), 500 czesciami objeto¬ sciowymi mieszaniny cMorofbrm-metanol (20:1) i 500 czesciami objetosciowymi mieszaniny chloro- form-etanol (10:1). Wyciek zbiera sie frakcjami 45 po 25 czesci objetosciowych.Po 0,5 czesci objetosciowych kazdej z (frakcji od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Do koncentratu dodaje sie 0,05 czesci objetosciowych octanu etylu, a mieszanine poddaje criixmatogra[fii 50 cienkowarstwowej (uklad rozwijajacy: chlorotorm- -metanol 9:1).Itaakcje nr 39 i 40 absorbujace przy 2537 nm w strefie o Rf 0,50—0,60 zbiera sie i pod zmniejszo¬ nym cisnieniem odparowuje do sucha. Do pozosta- 55 losci dodaje sie 2 czesci objetosciowe octanu etyilu i pozostawia mieszanine w spoczynku, otrzymujac 0,150 czesci krysztalów antybiotyku C—15003.Powyzsze krysztaly antybiotyku C^15003 (0,150 czesci) rozpuszcza sie w 15 czesciach objetoscio- 60 wych metanolu, a do roztworu dodaje 0,300 czesci chlorku sodu i 15 czesci objetosciowych wody. Ko¬ lumne upakowuje sie 200 czesciami objetosciowymi sorbentu Diaion HP-10 (Mitsubishi Kasei K.K) i równowazy 600 czesciami objetosciowymi 50% wod- •5 nego metanolu, zawierajacego 5% NaCl. Wyzej spo-17 122 289 18 rzadzony roztwór przepuszcza sie przez kolumne, która nastepnie eluuje sie gradiemitowo za pomoca 1500 czesci objetosciowych 6P°/o wodnego metano- lu, zawierajacego 5% NaiCI i 1500 czesciami objeto¬ sciowymi 95°/a wodnego metanolu.Wyciek zbiera sie frakcjami objetosci po 15 cizesoi objetosciowych, a kazda z frakcji analizuje chro- matogiradna cienikoiwianstwowa na zelu krzemionko¬ wym. Frakcje 145—153 zawieraja C—15O03 P—3, frakcje 167—180 zawieraja C—15003 P^3' i P—4, k a fnakcje 185—490 zawieraja C—15003 P—4.Kazda z grup frakcji odparowuje sie i rozpusz¬ cza dodaniem 50 czesci objetosciowych wody i 100 czesci objetosciowych octanu etylu. Roztwór wisitrzasa sie w TOEdzieliaciau, warstwe wodna od¬ rzuca, a warstwe octanu etylu przemywa woda w dwóch porcjach po 50 czesci objetosciowych, suszy nad bezwodnym siarczanem -sodu, zateza i pozosta¬ wia w spoczynku. W powyzszy sposób z kazdej z grup frakcji otrzymuje sie krysztaly, które odsacza sie i suszy. Frakcji C—15003 P—3 uzyskuje sie 0,070 czesci, frakcji C—15003 P—3'+P^l 0,018 cze¬ sci a frakcji C—15003 P^-4 0,015 czesci.. Mieszane krysztaly C^15003 P^3' i P—4 (0,018 czesci rozpuszcza sie w 0,3 czesciach objetoscio¬ wych octanu etylu i nanosi na plyte powleczona zelem krzemionkowym (Merck, RFN, zel krzemion¬ kowy 60 F264 0,25 mm, 20X20), w linii odleglej o 0,2 cm od dolnej krawedzi.Plyte rozwija sie ukladem octan etylu-metanol (19: 1). Po rozwinieciu na dlugosci Okolo 18 cm zeskrobuje sie absorbujace w 'nadfiolecie pasma o Rf 0,68 (P^l) i Rf 0,65 (P—3') i kazda z nich od¬ dziela dwukrotnie ekstrahuje octanem etylu, za¬ wierajacym niewielka ilosc wody. Ekstrakty prze- • mywa sie woda, suszy nad bezwodnym siarczanem sodu, zateza pod zmniejszonym cismiendem i pozo¬ stawila w spoczynku. Z frakcji o Rf 0,68 uzyskuje sie 0,010 czesci krysztalów C—15003 P—4, a z fraikclji o Rf 0,65 0,003 czesci krysztalów C—15003 P^3'.Przyklad VI. 1000 czesci objetosciowych ho¬ dowli z przykladu II szczepi sie tank z nierdzew¬ nej stalli o objetosci 200 000 czesci, zawierajacy 100 000 czesci objetosciowych pozywki hodowli po- siewowej, a zaszczepiona pozywke inkubuje w tem¬ peraturze 28°C, przy napowietrzaniu (100 000 czesci objetosciowyc^minute) i mieszaniu (200 obrotów/ /minute), w ciagu 48 godzin* otrzymujac hodowle posiewowa. Te hodowle posiewowa przenosi sie do tanku z nierdzewnej stali o pojemnosci 2 000 000 * czesci objetosciowych, zawierajacego 1 000 000 cze¬ sci objetosciowych pozywki fermentacyjnej jak uzyta w przykladzie I, a wiec stosujac posiew w ilosci 10% pozywki produikcyjnej.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C 10 przy napowietrzaniu (1000 000 czesci objetoscio¬ wych/minute), mieszaniu (120 obrotów/minute/1/3 DTV) i cisnieniu wewnetrznym (1 kg/cm2), w ciagu 90 minut. Otrzymana hodowla ma miano 20 jim/ml, z oznaczenia sposobem opisanym w przykladzie I.W Do 900 000 czesci objetosciowych wyzej otrzymanej hodowli dodaje sie 900 000 czesci objetosciowych acetonu, miesza w ciagu godziny i dodaje 20 000 czesci Hyfllo-Siuipercel (Jones & ManviMs, USA).Calosc miesiza sie dalej, a nastepnie przesacza 20 przez filltr cisnieniowy. Do 1T0OO00 czesci objeto- siciiowych otrzymanego przesaczu dodaje sie 500 000 czesci objetosciowych wody i w aparacie Podbiel- niaka (Podbielniak, Inc. USA) ekstrahuje mieszani¬ ne 1 000 000 czesci objetosciowych octanu etylu. Eks- 25 trakt przemywa sie woda, suszy dodaniem bezwod¬ nego siairczanu sodu i zateza pod zmniejszonym ci¬ snieniem. Do koncentratu dodaje sie eteru nafto¬ wego, wytracony osad odsacza i suszy. W powyzszy sposób otrzymuje sie 68 czesci surowego produktu 30 I, który oczyszcza sie jak w przykladach III, IV i V, otrzymujac 9,5 czesci 0^15003 P—3, 0,300 czesci C—15003 P^3' i 2,5 czesci C^15003 P^l. 35 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku ozna¬ czonego symbolem C—15003, skladajacego sie z jednego, dwóch (Lub trzech zwiazków o wzorze 4° przedstawionym na rysun/ku, w którym R oznacza grupe o wzorze -^CQ—CHA2H3/2, —CO—/CH^—CH3 lub -^CO—CH2—CH/CH3/2, znamienny tym, ze pro¬ wadzi sie fermentacje mikroorganizmu Nooardia nr C^15003 (IFO 13726) wytwarzajacego antybio- 45 tyk, w pozywce zawierajacej zródlo przyswajalnego wegla i azotu, po czym wyodrebnia sie z pozywki wytworzony antybiotyk.122 289 CHO ? ^ ?° HO CHj OCHj YizOr Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, 519/83 Cena 100 zl PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku ozna¬ czonego symbolem C—15003, skladajacego sie z jednego, dwóch (Lub trzech zwiazków o wzorze 4° przedstawionym na rysun/ku, w którym R oznacza grupe o wzorze -^CQ—CHA2H3/2, —CO—/CH^—CH3 lub -^CO—CH2—CH/CH3/2, znamienny tym, ze pro¬ wadzi sie fermentacje mikroorganizmu Nooardia nr C^15003 (IFO 13726) wytwarzajacego antybio- 45 tyk, w pozywce zawierajacej zródlo przyswajalnego wegla i azotu, po czym wyodrebnia sie z pozywki wytworzony antybiotyk.122 289 CHO ? ^ ?° HO CHj OCHj YizOr Drukarnia Narodowa, Zaklad Nr 6, 519/83 Cena 100 zl PL PL PL