-
Antileukämische Ansamakrolide Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen
der Formel:
worin R eine Methyl-, Äthyl- oder Isopropylgruppe badeutet.
-
Die erfindungsgemässen Verbindungen zeichnen sich durch eine überraschend
hohe antileukämische Wirkung aus und werden wie folgt gewonnen: Getrocknete Wurzeln,
Stengelholz und insbesondere getrocknete früchte von Maytenus ovatus werden in einer
Hammermühle vermahlen und mit 95%igem Äthanol zweckmässig in einem Soxhlet-Extraktionsapparat
extrahiert. Das Äthanol wird im Vakuum verdampft und der Rückstand zwischen Essigester
und Wasser verteilt. Der Essigesterextrakt wird zwischen10%igem wässrigen Methanol
und Petroläther verteilt.
-
Von der wässrig-methanolischen Fraktion wird das Lösungsmittel entfernt
und der Rückstand der Säulenchromatographie an Kieselgel, zweckmässig Ki eselgel
vom Typ Stilic AR unterzogen. Das produkt der Chromatographie wird acetyliert, zweckmässig
durch Behandeln mit Essigsäureanhydrid in Pyridin und erneut der Säulenchromatographie
an Kieselgel sowie anschliessend der präparativen Dünnschichtchromatographie nacheinander
an Aluminiumoxid, Silicagel und Silic AR unterzogen. Man erhält dabei ein hoch angereichertes
Konzentrat. Frühere Versuche, aus diesem Material bereits ein Endprodukt zu isolieren
und es aus alkanolischen Lösungen umzukristallisieren, waren nicht erzolgreich .
Wurde Methanol verwendet, so erhielt man ein IIethylderivat,und mit äthanolischen
Lösungen entsprechend ein Äthylderivat. Zur erzielung einer analysenreinen Probe
von Maytansin war es erforderlich, durch Umsetzung mit 3-Brompropanol in Toluolsulfonsäure
das 3-Brompropylmaytansin herzustellen. Sorgfältige Hydrolyse mit 2n-Salzsäure in
wässrigem Methanol ergab dann das Maytansin selbst, das dazu verwendet wurde, ein
Konzentrat aus den chromatographischen Behandlungsstufen in Äther/Methylenchlorid
anzuimpfen.
-
Während die weiter unten angegebenen verfeinerteren Reinigungsverfahren
die Herstellung von 3-Brompropyl-maytansin
überflüssig gemacht haben,
so hat die Anwesenheit des schweren Bromatoms in diesem Derivat j jedoch den Vorteil,
dass dadurch die kristallographische Röntgenstruktur-Analyse der Verbindung ermöglicht
wird.
-
Maytansin wurde gegenüber Sanc om 180, dem Lewis'schen Lungenkarzinom
und gegenüber Leukämie n-1210 und P-388 in Mäusen sowie gegenüber dem intramuskulären
-Earzinom Walker 256 in Ratten geprüft. Die dazu benutzte Methode ist in Oancer
Chemother. Rep. 25, 1 (1962) beschrieben. Bei diesen Versuchen erwies sich Naytansin
als bedeutsamer l'n- vivo-Tumor-Inhibitor.
-
Maytansin erwies sich gegenüber der lymphocytischen Leukämie P-388
als in einer Dosis von 20 bis 100 Mikrogramm/ kg wirksam. Bei einem ln-vivo-Versuch
gegenüber Zellen, die von einem Karzinom des menschlichen Nasen-Rachenraums (KB-Zellen)
staminten, ergab sich eine Cytotoxizität (ED50) in einem Bereich von 10 4 bis 10-5
µg/ml. Eine Wirkung bei ähnlichen Dosen gegenüber P-588 ergab sich bei der Verwendung
von fiaytanprin und Maytanbutin, die zwar ebenfalls in den Derivaten von riaytanus
ovatus vorhanden sind, jeaoch in grösserer Menge in den äthanolischen Extrakten
von maytanus Buchananii, die auf genau die gleiche Weise, wie bei der Isolierung
von Maytansin angewandt, gereinigt werden.
-
Von den aktiven Substanzen können Lösungen in Wasser hergestellt werden,
das mit beispielsweise Äthanol, Glycerin, essbaren Polyolen, wie Glycerin, Polyäthylenglykolen
oder Propylenglykol, und dgl. verdünnt sein kann. Dispersionen können mit Glycerin,
flüssigen Polyäthylenglykolen und Gemischen daraus sowie mit Ölen hergestellt werden.
-
Unter gewöhnlichen Aufbewahrungs- und Verwendungsbedingungen enthalten
diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen
zu verhindern.
-
Pharmazeutische Islittel, die die aktiven Bestandteile enthalten,
können in der Form vorliegen, die sie zum Injizieren geeignet macht, d. h. in Form
steriler, wässriger Lösungen oder Dispersionen und steriler Pulver zur sofortigen
Herstellung von sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen. In sämtlichen
Fällen muss die zur Verwendung gelangende Form steril und so weit flüssig sein,
dass eine leichte Einspritzbarkeit erzielt wird. Ferner muss das Präparat unter
den Herstellungs und Aufbewahrungsbedingungen stabil sowie gegen den Befall mit
Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, geschützt sein. Die geeignete Fliessfähigkeit
kann aufrechterhalten werden, indem man beispielsweise einen bberzug von beispielsweise
Lecithin verwendet, indem man die erforderliche Teilchengrösse im falle von Dispersionen
aufrechterhält und indem man oberflächenaktive Stoffe verwendet, beispielsweise
ein Kondensationsprodukt von Äthylenoxid mit Fettsäuren oder Fettalkoholen, Partialester
von Fettsäuren und Hexitallhydrid und Kondensationsprodukte von Polyoxyäthylen und
den Estern. Die Verhinderung der Einwirkung von Diikroorganismen kann durch die
Anwendung verschiedener antibakterieller und antifungaler Mittel bewirkt werden,
wie beispielsweise von Parabens, Chlorbutanol, Benzylalkohol, Phenol, Sorbinsäure,
Themerosal und dgl. In vielen Fällen wird die Mitverwendung von isotonischen ittteln,
wie beispielsweise von Zuckern oder Natriumchlorid, vorgezogen. Eine verlängerte
Absorbierbarkeit der einzuspritzenden Mittel kann durch die Verwendung von Abssorptionsverzögerern,
wie beispielsweise Aluminiuinmonostearat und Gelatine, bewirkt werden.
-
Sterile, injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem man die aktive
Komponente in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel zusammen mit
den verschiedenen anderen oben genannten, nötigenfalls erforderlichen Bestandteils
einbringt und anschliessend eine Ziltersterilisierung durchführt. Im allgemeinen
werden Dispersionen hergestellt,
indem man das zuvor sterilisierte
aktive Material in einen sterilen Träger einbringt, der das Dispersionsmittel und
die anderen nötigenfalls erforderlichen Bestandteile der oben genannten Art enthält.
-
Die bevorzugte Verfahrensweise zur Herstellung der oben erwähnten
sterilen Pulver, die sich zur Herstellung der sterilen, injizierbaren Lösungen eignen,
besteht im Gefriertrocknen, wobei aus der zuvor sterilgefilterten Lösung ein Pulver
aus dem aktiven Bestandteil und den gewünschen Zusatzstoffen erhalten wird. Die
Pulver können auch durch Verwendung eines Gases, wie beispielsweise von Äthylenoxid,
sterilisiert und anschliessend zusammen mit den nötigenfalls erforderlichen Zusatzstoffen
und in der geeigneten Teilchengrösse in den Pulverhauptbestandteil eingebracht werden,
woraus später durch Zusatz geeigneter Dispersionsflüssigkeiten, die selbstverständlich
selbst ebenfalls steril sein müssen, das injizierbare Mittel rekonstituiert werden
kann.
-
In die erfindungsgemässen Mittel können weitere aktive Bestandteile,
wie beispielsweise llechorethamin-hydrochlorid, 5-Bis-(2-chloräthyl)-amino-uracil,
Triäthylenmelamin Actinomycin C oder Cycloheximi<i,eingearbeitet werden.
-
Besonders vorteilhaft ist es, die erfindungsgemässen Mittel in Dosierungseinheiten
herzustellen, damit sie leicht verabreicht werden können und eine Dosierungsgleichmässigkeit
erzielt wird. Dosierungseinheiten im vorliegenden Sinne bestehen aus diskreten Einheiten
zur Behandlung von Tieren und Menschen, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge
aktiven Materials, die zur Erzielung des gewünschten therapeutischen Effektes berechnet
ist, zusammen mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger enthält. Die Einzelheiten
der Dosierungseinheiten hängen unmittelbar von (a) den Eigenschaften des aktiven
Materials und den im einzelnen
zu erzielenden therapeutischen Wirkungen
und (b) von den Begrenzungen ab, die detn Kompoundieren eines solchen ektiven Materials
für die Behandlung von Krankheiten in Lebewesen mit geschwächter Gesundheit gesetzt
sind.
-
Die Dosierung des hauptsächlichen aktiven Bestandteils für die Behandlung
der genannten Krankheiten hangt von dem Alter, dem Gewicht und dem Zustand der zu
behandelnden Lebewesen, ferner von der Schwere des Erankheitsfalles im einzelnen
sowie von der im einzelnen angewandten norm des aktiven Mittels und der Verabreichungaweise
ab. Eine Dosis von etwa 20 bis 100 µg/kg bzw. eine tägliche Gesactdosis von etwa
0,4 bis etwa 5 mg werden im allgemeinen auf einmal oder in einzelnen geringeren
Anteilensvexabfolgt.
-
Das hauptsächliche aktive Mittel wird zur bequemen und wirksamen Verabfolgung
in wirksamen Mengen mit einem geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Träger in der
oben beschriebenen Dosiseinheitsform kompoundiert. Eine Dosiseinheit kann den hauptsächlichen
aktiven Bestandteil in Mengen von etwa 0,1 bis 5 mg je Einheit enthalten. Anders
ausgedruckt, kann der aktive Bestandteil in einem Anteil von etwa 0,01 bis etwa
0,1 Gew.teilen je 100 Vol.teile des flüssigen Mittels vorhanden sein.
-
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispiel: näher erläutert.
-
3eispiel 1 Extraktion und Isolierung von Maytansin aus Maytenus ottatus
Extraktion aus Pflanzenmaterial mit 95%igem Äthanol: 1 kg getrocknete Früchte von
Maytenus ovatus wurden in einer Hammermühle (Montgomery Ward 25,4 cm (10 Zoll))
vermahl en. Das gemahlene Pflanzenmaterial wurde in einem Soxhlet-13xtraRtionsapparat
mit 8 1 95%igem Methanol 6 Stunden lang extrahiert. Anschliessend wurde es erneut
mit 8 1 frischem, 95%igem Äthanol 15 Stunden lang extraeluiert. Nach einer dritten,
24 Stunden dauernden Extraktion desselben Materials mit 8 1 frischem, 95%igem Äthanol
wurden sämtliche Lösungen vereinigt.
-
Verteilung des Äthanolextraktes: Der Extrakt von 1 kg Pflanzenmaterial
in 95%igem ethanol wurde im Vakuum bei 40 bis 500 C zu einem dunklen Gummi.
-
(A) konzentriert. Fraktion A wurde mit 300 ml Essigester und 150 ml
Wasser versetzt und das Gemisch sehr heftig mit einem mechanischen Rührer 12 Stunden
lang gerührt,-da die Fraktion A ein sehr viskoses, unlösliches Material enthielt
Die Suspension wurde filtriert, wobei die Filterpapiere mehrmals ersetzt werden
mussten, da die Filtriergeschwindigkeit durch viskoses, unlösliches Material verringert
wurde. Das unlösliche Material wurde weitere zweimal mit 100 ml Essigester und 50
ml Wasser versetzt und filtriert. Die Phasen der vereinigten Filtrate wurden voneinander
getrennt und die wässrigen Lösungen zweimal mit 50-ml-Anteilen Essigester gewaschen.
Die vereinigten Essigesterlosungen wurden mit .50 ml Wasser gewaschen und im Vakuum
bei 4Ö bis 50°Ceingedampft. Der Riickstand, ein dunkler Gummi, wurde zwischen 150
ml 10 0% Wasser/Methanol und 150 ml Petroläther v'om Siedepunkt 60 bis 68° C
(Skellysolve
B)verteilt. Die wässrig-methanolische Phase wurde zweimal mit je 50 ml Petroläther
extrahiert und die vereinigten Petrolätherphasen mit 30 ml 10 % Wasser/ Methanol
gewaschen. Verdampfen des Petroläthers ergab ein dunkelgrünes bl (B). Die vereinigte
wässrig-methanolische Fraktion wurde sorgfältig bei 40 bis 50°Cim Vakuum zu einem
dunklen Gummi (C) eingedampft. Diese Eindampfung wurde durch häufigen Siedeverzug
erschwert.
-
Säulenchromatographie von Fraktion C an Silic AR: 100 g der Fraktion
C wurden in 200 ml 30 % Methanol/Chloroform gelöst und mit dem Doppelten des Gewichtes
an Silic AR von einer Teilchengrösse von 74 bis 149 Mikron (100 bis 200 mesh) oder
Silicagel von einer Teilchengrösse von 44 bis 210 Mikron (lerch 70 - 325 mesh) versetzt.
Nach dem Schütteln des Gemisches wurde das Lösungsmittel bei 40 bis 500 -C im Vakuum
verdampft. Der Rückstand wurde gründlich im Vakuum getrocknet und auf eine Säule
aus dem 8fachen der Gewichtsmenge der Fraktion C von Silic AR oder Silicagel in
Chloroform gegeben. Der Oberteil der Säule wurde mit einem Stab aufgewirbelt, falls
die Elutionsgeschwindigkeit durch Feinmaterial verringert wurde.
-
Fraktionen 1 bis 5 wurden mit Chloroform, Fraktionen 6 bis 15 mit
5c% Methanol/Chloroform und Fraktionen 16 bis 18 mit Methanol( 1) eluiert. Fraktionen
7 bis 10 (D) wurden vereinigt und mit Acetanhydrid/Pyridin versetzt.
-
Umsetzung der Fraktion D mit Acetanhydrid/Pyridin: Eine Lösung der
Fraktion D in der doppelten Gewichtsmenge Pyridin wurde mit dem 5fache der Gewichtsmenge
von Fraktion D an Acetanhydrid 15 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Verdampfung
des Acetanhydrii und Pyridins bei 40 bis 500 C im Vakuum ergab ein dunkles Öl.
-
Säulenchromatographie des Acetylierungsproduktes an Silic AR und anschliessend
an Aluminiumoxid: Das-dunkle Öl wurde in der geringsten Menge Chloroform gelöst
und die Chloroformlösung über eine Säule von dem -5fachen der Gewichtsmenge von
Fraktion D an Silic AR oder Silicagel in Chloroform gegeben. Fraktionen 1 bis 5
wurden mit Chloroform, Fraktionen 6 bis 10 mit 5 % Methanol/Chloroform und Fraktionen
11 bis 13 mit Methanol (*1) eluiert.
-
Fraktionen 7 bis 10 (E) wurden in der geringsten Menge Methylenchlorid
gelöst und an dem 5fachen der Gewichtsmenge der Fraktion E von neutralem Aluminiumoxid
(Woelm, Grad 1) chromatographiert. Fraktionen 1 bis 3(*2) wurden mit Methylenchlorid,
die Fraktionen 4 bis 8 mit 30 % Methanol/Chloroform und Fraktionen 9 bis 11 mit
Methanol(*1) eluiert. Die Fraktionen 5 bis 8 wurden vereinigt (F).
-
Verteilung der Fraktion F zwischen Essigester und 2n-Salzsäure: Eine
Lösung der Fraktion F in Essigester (10 ml/g der Fraktion }) wurde mit 2 rnl/g der
Fraktion Fankalter 2-n-Salzsäure extrahiert. Die Essigesterphase wurde zweimal mit
2-n-Salzsäure (1 mlJg der Fraktion F) extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen
wurden mit Essigester (1 ml/g Fraktion t) gewaschen, mit Natriumbicarbonat basisch
gemacht und mit Essigester extrahiert, wobei man die Alkaloidfraktion H erhielt.
Die vereinigten Essigesterphasen wurden mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen
und im Vakuum bei 40 bis 50° C eingedampft, wobei man eine aktive Fraktion G(*3)
erhielt.
-
Präparative Dünnschicht-Chromatographie auf Aluminiumoxidplatten:
Die Fraktion G wurde weiter durch präparative Dünnschicht-Chromatographie an Aluminiumoxid
wie folgt gereinigt.(*4):
200 bis 300 mg der Fraktion G/Platte
(Merck, 1,5 mm x 20 ca x 20 cm) wurden bis zu einer Höhe von 15 bis 17 cm unter
Verwendung von 7 % Methanol/Essigester als Entwicklungsflüssigkeit wandern gelassen.
Nacn der Entwicklung und Verdampfung des Lösungsmittels wurde die dem Maytansin
entsprechende Zone herausgekratzt und wiederholt mit 30 % flethanol/Chloroform extrahiert.
Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde
in Methylenchlorid gelöst, zur Entfernung von Aluminiumoxid filtriert und zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wurde erneut der präparativen Dünnschicht-Chromatographie
an Aluminium/auf die gleiche Weise wie oben unterworfen, wonach man Fraktion I erhielt.
-
Präparative Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagelplatten: Fraktion
1 wurde der präparativen Dünnschicht-Chromatographie an Silicagel in folgender Weise
unterzogen(* Weise Etwa 100 mg der Fraktion I wurden je Platte (Merck, 2,0 mm x
20 cm x 20 cm) 15 bis 17 cm unter Verwendung von 3 % Methanol/Essigester als Entwickl
ungsflüssigkeit wandern gelassen.
-
Auf dieser Stufe wurde Maytansin von mehreren verwandten aktiven Verbindungen
getrennt. Zweckmässigerweise wurden zwei Hauptfraktipnen gesammelt. Fraktion J bestand
aus rohen Maytansin und Fraktion K aus den anderen aktiven Verbindungen, die höhere
Ef-Werte als ria'ytansin besassen.
-
Die aktiven rsterialien wurden von dem Silicagel durch wiederholte
Extraktion mit 10 Vo Methanol/Chloroform eluiert.
-
Fraktion K enthielt Maytanprin und Maytanbutin, die, wie weiter unten
beschrieben, isoliert wurde
Präparative Dünnschicht-Chromatographie
an Silic, AR-Platten: Fraktion J wurde durch präparative Dünnschicht-Chromatographie
an SilicAR in der folgenden Weise weiter gereinigt, wonach man die maytansin-reiche
Fraktion L (*6) erhielt: 5 bis 6 mg Fraktion J je Platte (Mallinckrodt SilicAR,
O,25'mm x 20 cm x 20 cm); Entwicklungslösungsmittel: 5 ß Methanol/Essigester; Entwicklungshöhe;
15 bis 17 cm; Extraktionslösungsmittel: 10 % Methanol/Chloroform.
-
Umkristallisierung von Maytansin: Fraktion L wurde in der geringsten
Menge llethylenchlorid gelöst, und die liethylenchlorid-Lösung wurde mit dem gleichen
Volumen sthyläther und anschliessend mit n-Hexan bis zur leichten Trübung versetzt.
Ein Impfkristall von Naytansin wurde hinzugegeben und die Lösung bei Raumtemperatur
mehrere Stunden lang stehengelassen. Es bildeten.
-
sich Tafeln, die abfiltriert und auf dieselbe Weise umkristallisiert
wurden. Mehrere Umkristallisierungsgänge waren erforderlich, um reines Maytansin
(n) zu erhalten.
-
Eine weitere Menge Maytansin wurde aus den dutterlaugen gewonnen.
-
Fussnoten: *1 Jede Fraktion wurde mit einem Säulenvolumen eluiert.
-
Die Lösungen wurden bei 40 bis 500 C im Vakuum eingedampft und die
Rückstände einzeln gewogen.
-
*2 Fraktionen 2 und 3 können einige aktive Verbindungen enthalten
und sollten für weitere Untersuchungen abgetrennt werden.
-
*3 Die Einwirkung von Mineralsäuren auf aktive Fraktionen muss auf
ein Minimum herabgedrückt werden, da eine gewisse Empfindlichkeit bemerkt wurde.
-
*4 In diesem System betrugen die Rf-Werte für Maytansin
und
andere aktive Verbindungen etwa 0,5.
-
*5 Der Rf-Wert für Maytansin war in diesem System etwa 0,2.
-
t6 Der Rf-Wert für Maytansin in diesem System lag bei 0,2 bis 0,3.
-
Beispiel 2 Gemäss den Verfahrensschritten von Beispiel 1 wurde die
Reinigung in grossem Masstab unter Verwendung von 100 kg Früchten durchgeführt,
wobei die im folgenden angegebenen Ausbeuten erhalten wurden: Früchte 100 kg Fraktion
A B C 1,9 kg D 570 g E F 41 g G H I 5,4 g J 0,6 g K 2,4 g L 0,2 g n 30 mg Al2O3-
Platten 200 Silicagelplatten 54 SilicAR-Platten 100 Beispiel 3 (3-Brompropyl)-maytansin:
Ein Teil des Konzentrats von Fraktion L wurde bei Raumtemperatur mit 3-Brompropanol-1
und Toluolsulfonsäure in Methylenchlorid versetzt, wonach man den Carbinolaminäther
(3-Brompropyl)-maytansin
(4) C37H51 BrClN3O10 vom Schmelzpunkt 176 bis 178° C erhielt. IR-Maxima (KBr): 5,76,
6,01, 6,-34, 8,42, 9-,29/u.
-
Beispiel 4 Analysenreines Maytensin: Zersetzen von 3-Brompropyl-maytansin
mit 2-n-HCl in wässrigem Methanol ergab ein kristallines Hydrolyseprodukt, das dazu
verwendet wurde, um eine' Lösung aus Konzentrat A in Äther/Methylenchlorid anzuimpfen
und auf diese Weise Maytansin (1) zu erhalten (0,2 mg/kg Pflanze, 0,00002 %): C34H46ClN3O10;
Schmp. 171 - 172° C; [α]#- 145° (c 0,055, CHCl3); UV max (Äthanol): 233 (#
29,800), 243 (scharf, # 27,100), 254 (# 27,200), 282 ( # 5,690), 290 nm (# 5,520);
IR (KBr): 5,75, 5,80, 6,02, 6,34, 8,42, 9,26; Massenspektrum: m/e 630.2680, C33H43ClN2O8
[M-61 (H2O + HNCO8)] = 630.2708; NMR (CDCl3): # 9.13 (3H, s, C4-CH3), 8,66 (3H,
d, J=6, Hz, C6-CH3), 3,63 (3H, d, J=7 Hz, C2'-CH3), 8,31 (3H, breites s, Cl4-CH3),
7,85 (3H, s, C2'N-COCH3), 7,79 (1H, dd, J2,2= 15, J2,3= 3Hz, C2-H), 7,35 (1H, dd,
J2,2= 15, J2,3 = 12 Hz, C2-H), 7,11 (3H, s, C2'N@CH3), 6,96 (1H, d, J5,6= 9 Hz,
C5-H), 6,87 (1H, d, J15,15= 13 Hz, C15-H), 6,78 (3H, s, ClN-CH3), 6,62 (3H, s, C10-OCH3),
6,50 (1H, d, J10 11=9 Hz, C10-H), 6,47 (1H, s, OH), 6,33 (1H, d, J15,15= 13 Hz,
C15-H), 6,01 (3H, s, C2O-OCH3), 5,72 (1H, m, C7-H), 5,21 (1H, dd, J2 3= 12, 3 Hz,
C3-H), 4,65 (1H, 9, J=7 Hz, C2'-H), 4,34 (1H, dd, J10,11= 9, J11,12=15 Hz, C11-H),
3,76 (1H, breites, s, C9N-H), 3,58 (1H, dd, J11,12= 15, J12,13= 11 Hz, C12-H), 3,30
(1H, breites d. J12,13= 11 Hz, C13-H), 3,25, 3,16 (2H, Dubletts, J17'21 = 1,5 Hz,
C17-H, C21-H), 9,20-7,50 (3H, C6-H, C8-H2).
-
Beispiels Zusammenfassung der Röntgenbeugungsdaten bei der Analyse
von Maytansin Die 3-Brompropyl-maytansin-Kristalle gehören dem orthorhombischen
System mit Raumgruppe P2 12121 und a = 24,239 (4), b = 16,044(4), c = 10,415(2)
# an. Die Elementarzelle enthält vier Formeleinheiten von C37H51BrClN3O10 und ergibt
eine berechnete Dichte von 1,34 g/cm3, die in vernünftiger Obereinstimmung mit der
beobachteten Dichte von 1,30 g/cm³ steht. Durch Röntgenbeugungsmessung unter Verwendung
von monochromatischer CuEa-Strahlung, Scintillationszählung und Analyse der Impulshöhe
erhielt man 952 unabhängige Intensitäten, die sich signifikant vom Hintergrund abhoben.
-
Die Struktur wurde durch die Schweratommethode aufgeklärt.
-
Verfeinerung der Strukturparameter wurde durch die Blockdiagonalmethode
der kleinsten Quadrate unter Verwendung von anisotropen, thermischen Parametern
lediglich für das Bromatom und nach seiner Identifizierung im Molekül für das Chloratom
erzielt, wobei für R der Wert 0,101 erhalten wurde.
-
Die Aufstellung der absoluten Konfiguration wurde unter Berücksichtigung
der anomalen Streuung der Brom- und Chloratome vorgenommen. Wenn in den Strukturfaktor
# f't eingeschlossen wurde, ergab die Berechnung der beiden alternierenden Enantiomeren
für R einen Wert von 0,103 und 0,101, was eine signifikante Differenz auf dem 99%-Niveau
bedeutet. Bestätigung der Konfiguration wurde durch Vergleich der beobachteten Intensität
für 23 Friedel-Reflex-ionspaste erzielt. In jedem Falle lag der Unterschied in der
Intensität in guter tbereinstimmung mit dem rur das gewahlte Enantiomere berechneten
Wert.
-
Die absoluten Konfigurationen sind 35, 4S, 5S, 6R, 75, 9S, 10R, 2'5.
-
Die Substituentenverteilung über die verschiedenen Bindungsachsen
zeigt eine nahezu vollständige Minimierung der intråmolekularen hbstossungen, so
dass anscheinend keine starken intermolekularen Kräfte für das Zustandekommen-der
beobachteten Konformation des Moleküls verantwortlich sind.
-
Der berechnete ESD-Wert für eine Atomstellung beträgt etwa 0,025 #,
was einem Wert für den Bindungsabstand von etwa 0,04 # und für den Bindungswinkel
von etwa 30 entspricht.
-
Die Abweichung der quadratischen Mittelwerte (r.m.s. deviation) für
äquivalente C-C Entfernungen liegt näher an 0,06 #, was vermuten lässt, dass die
von den Matrizen der kleinsten Quadrate berechneten Fehler unterbewertet sind.
-
Thermische Parameter iln Makrozyklus sind physikalisch sinnvoll zwischen
2,6 und 8,0 22, jedoch weisen die Substituentengruppen stärkere thermische Schwingungen
mit dem Bromatom auf, das einen äquivalenten isotropen thermischen Parameter von
11 92 besitzt.
-
Die Hauptpeaks in den Massenspektren von 1 bis 3 sind in der folgenden
Tabelle angegeben; die Zusammensetzung der Ionenfragmente wurde mit Hilfe eines
hochauflösenden Massenspektrome ters bestimmt. aus den Massenspektren ist ersichtlich,
dass die Verbindungen (2) und (3) ähnlich wie, Verbindung (1) Ansamakrolid-Strukturen
besitzen mit der ausnahme von unterschieden in den R-Gruppen der Esterseitenketten.
-
Tabelle Massenspektraldatena M+-(a) M+-(a+b) 485-(CH3) 485-(Cl) [(b)-(OH)]+
[(b)-(COOH)]+ 630 485 470 450 128 100 644 485 470 450 142 114 658 485 470 450 156
128 C3H8N+ C2H6N 58 44 58 44 58 44 a (a) = H2O + HNCO;
Die Beziehung zwischen den drei Verbindungen wurde durch Vergleich ihrer NMR-Spektren
bestimmt. So unterscheiden sich die NMR-Spektren der Verbindungen (2) und (3) von
dem Spektrum der Verbindung (1) lediglich in den Signalen, die den endständigen
R-CO-Gruppen ents prechen. Die NMR-Signale für die Propionylgruppe von Verbindung
(2) [#8,82 (3H, t, J-7), 7,63 (1H, m), 7,59 (1H, m)] zeigt die Nicht-Aquivalenz
der Methylenprotonen, was durch Spinentkopplungsstudien bestätigt wurde. Die NMR-Signale
für die Isobutyrylgruppe von Verbindung (3) [#8,88 (3H, d, J=7), 8,81 (311, d, J=7),
7.20 (1H, m)] deuteten auf die Nicht-Äquivalenz der beiden flethylgruppen hin, was
ebenso durch die Ergebnisse von Spin-entkopplungs- und Lösung mittelverschiebungsstudien
gestützt wird. Die Signale für
C-2' N-CH3 von Verbindung (3) [#7,13
(3/4 H, s), 7,08 (2-1/4 H, 5)7 weisen- darauf hin, dass die Rotationsgeschwindigkeit
um die Carbonyl-Stickstoffbindung durch sterischen Einfluss der Isopropylgruppe
und des" aromatischen Rings verringert ist.
-
Maytanprin und llaytanbutin weisen eine antileukämische Aktivität
gegenüber der lymphocytischen Leukämie P-388 von der gleichen Grössenordnung wie
Maytansin auf.
-
Beispiel 6 Isolierung von Maytanprin und l;laytanbutin: Der alkoholische
Extrakt von Stengeln von Maytenus Buchananii (Loes.) Wilczek, die in Kenya gesammelt
waren, wurde nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 fraktioniert, wobei man ein hochangereichertes
Konzentrat erhielt. Präparative Dünnschicht-Chromatographie an Kieselgel ergab Maytansin
(1) (0,00015 %), entsprechend der Fraktion L sowie zwei Zonen von höheren Rf-Wert
entsprechend Fraktion K. Reinigung von Fraktion K durch }'lüssigkeits-Chromatographie
unter hohem Druck ergab Maytanprin (2) (0,00012 %\? C35H48ClN3O10 vom Schmp. 160
- 1700 C, [α]# - 1250 (c 0,0559, CHCl3) und Maytanbutin (3) (0,00009 %) C36H50ClN3010
vom Schmp. 170 - 1710 C, [α]#- 1220 (c 0,0492, CHCl3). Die IR- und W-Spektren
der Verbindungen (2) und (3) waren mit denen der Verbindung (1) nahezu identisch.
-
Fliesschema für die Extraktion und Isolierung von Maytansin aus Maytenus
ovatus und Maytenus Buchananii
| 95% Äthanol extrakt (A) |
| Essigester II 0 un1ösliche |
| i2 uaterialien |
| Petroläther (B) 10% H2O-CH3OH (C) |
| 1 SilicAR-Säulenchr1omatographie |
| CHCl3 5% MeOlI-CHC1 CH3OH |
| (D) 3 |
| (1) Umsetzung mit Ac2O und Pyridin |
| (2) SilicSw chromatogra?hieSilic-Sau1enchromatogrsphi e |
| 7 |
| CHClS5 5% CH30H-CHCl3 CH3OU |
| Al 20 3-Säul enchromatogrsphi 6 |
| CH2Cl2 3050 CI3 OH-CHC13 01130H |
| rc. 3 (v) |
| I |
| Essigester (G) EI+ (H) |
| präparative »unnschichtchromato- |
| graphi e |
| (i) A1203 |
| (2) Al3 (1) |
| (3) Silicagel (J)(E) |
| 4) SilicÄR |
| (4) ilicAR (L) (L1 |
| Umkri stallisi eren |
| Maytansin (s zytanprin (ei2) |
| ytanbuti (n3) |