DE60202684T2

DE60202684T2 - Pflanzenpräparat zur Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Schwierigkeiten

Info

Publication number: DE60202684T2
Application number: DE60202684T
Authority: DE
Inventors: Santu Bandyopadhyay; Keshab C. Roy; Mitali Roy; Bikash C. Pal; Ranjan Bhadra; Krishna Das; Samir Bhattacharaya
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2022-08-10
Also published as: CN1652805A; EP1414475B1; JP4460286B2; EP1414475A2; US20020086068A1; JP2005501079A; WO2003013564A3; AU2002326139B2; DE60202684D1; CN100488533C; WO2003013564A2; US6773728B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Pflanzenpräparat zur Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Schwierigkeiten. Diese Erfindung bezieht sich auf eine pflanzliche Formulierung, die nützlich für die Blockierung der Aktivität von 5-Lipoxygenase ist, die zur Inhibition der Synthese von Leukotrien, zur Unterdrückung der Herstellung von IL4 und zur Erhöhung der Abgabe von IFN Gamma führt. Insbesondere beschreibt diese Erfindung das Verfahren der Trennung, die physikochemische Charakterisierung und die Auswertung der biologischen Antwort von Extrakten oder bioaktiven Fraktionen, die von Extrakten beliebiger Pflanzenteile einschließlich Blättern, Rinden, Wurzeln und Samen der Pflanzen M. koenigii und P. betle erhalten wurden, um deren Rolle bei der Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Schwierigkeiten zu ermitteln.

Ein respiratorisches Problem besteht aus milden bis zu äußerst schweren Schwierigkeiten beim Atmen, zusammen mit anderen Unannehmlichkeiten, wie z. B. Stenoseatmung („wheezing"), Husten, Brustanspannung („chest tightness") und ähnlichem. Trotz Vorsichtsmaßnahmen, Kampagnen für das öffentliche Bewusstsein und Überwachungssystemen ist die Bevölkerung, die respiratorische Schwierigkeiten hat, überall auf der Welt im Ansteigen begriffen. Dies trifft in fortgeschrittenen westlichen Ländern zu, insbesondere unter Kindern. Für die Verwendung von Pflanzenpräparationen aus M. koenigii wurde die Linderung und mögliche Heilung von Asthma bereits von den Anmeldern in deren PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/IN/00102 dargelegt, die am 16. Oktober 2000 eingereicht wurde. In der vorliegenden Erfindung wird eine doppelte Strategie eingeschlagen.

Die respiratorische Krankheit ist das Ergebnis von pathophysiologischen Symptomen, die von einer Anomalie des Immunsystems herrühren. Das unmittelbare Symptom beinhaltet bronchiale Konstriktion, Entzündung der Atemwege und Schließen des Luftweges durch Schleimabsonderung. Die symptomatischen Arzneimittel bieten eine Linderung bereits durch die vorübergehende Entspannung der bekümmerten unglücklichen Symptome.

Das bedeutet, dass der Extrakt von Murrya koenigii in Kombination mit dem Extrakt, der von Piper betle erhalten wurde, überraschende Ergebnisse gezeigt hat. Gemäß der früher eingereichten, unveröffentlichten PCT-Patentanmeldung zeigte der Extrakt aus Betle-Blättern eine Erhöhung an IFN-y von Zellen vom TH1-Typ und eine Abnahme von IL-4 aus Zellen vom Typ Th2. Dies ist offensichtlich eine effektive Maßnahme zur Behandlung von Asthma, da die Verschiebung der Reaktion vom Typ Th2 zum Typ Th1 offensichtlich die Abgabe von IgE aus Mastzellen verringern wird, was ein wesentlicher Manipulator („major manipulator") des asthmatischen Zustands ist. Daher ist das frühere Auffinden der Anmelder, gefolgt von der Einreichung der PCT-Patentanmeldung PCT IN 00/00127 in direkter Übereinstimmung mit der vorliegenden Einreichung von kombinierten Extraktion zu beliebigen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle als einer neuen Medizin zur Behandlung von atopischem Asthma.

Die Grundursache für respiratorische Probleme wird von den Entwicklern symptomatischer Arzneimittel nicht gut angegangen. Mit dem Auftauchen des gegenwärtigen Wissens wird es jetzt weitgehend akzeptiert, dass Leukotriene als Hauptspieler bei der Entwicklung von Symptomen von respiratorischen Problemen gefunden wurden.

Die wesentlichen Symptome des respiratorischen Problems können in frühe und späte Reaktionen aufgeteilt werden. Die frühe Reaktion geschieht innerhalb von Minuten nach einer Aussetzung gegenüber Allergenen und beteiligt vor allem Mediatoren wie z. B. Histamin, Leukotriene und Prostaglandin D2. Die Effekte dieser Mediatoren führen zu einer Verengung der Bronchien („bronchocontriction") und einer Ansammlung von Schleim. Die späte Reaktion geschieht Stunden später und beteiligt zusätzliche Mediatoren, einschließlich IL-4, IL-5, IL-6 und TNF-alpha, den chemotaktischen Eosinophil-Faktor („eosinophils chemotactic factor") (ECF) und der Blutplättchenaggregationsfaktor („platelet aggregation factor") (PAF). Die gesamten Effekte dieser Mediatoren bestehen darin, dass entzündende Zellen einschließlich Eosinophile und Neutrophile erneuert werden. Diese Zellen sind in der Lage, eine signifikante Verletzung von Gewebe zu bewirken, indem sie giftige Enzyme abgeben. Diese Ereignisse führen zum Verschluss der bronchialen Lumen mit Schleimprotein und zellularen Ablagerungen, wodurch die Grundmembran („basement membrane") verdickt wird, dem Aufbau von Flüssigkeit und einer Hypertrophie des glatten Bronchialmuskels. Es bildet sich oft ein Schleimstopfen, der sich an der Bronchialwand anlagert. Der Schleimpfropfen enthält Cluster von abgelösten Epithelzell-Fragmenten, Eosinophilen, einigen Neutrophilen und Spiralen von Bronchialgewebe, die als Curschmann's Spirale bekannt sind (Immunology, J. Kuby; W. H. Freeman & Co., New York; 3. Auflage 1997). In Hinblick auf die gegenwärtigen Mechanismen in Bezug auf die Erscheinungsformen von bronchialem Asthma/bronchialen respiratorischen Problemen betont die moderne Strategie für die Entwicklung von Arzneimitteln die folgenden Annäherungen:

Diese beinhalten i) Inhibierung der Leukotrien-Synthese durch Blockierung der Aktivität des 5-Lipoxygenase-Enzyms (Legqis RA et al New England J. Med. 323:, 645, 1990). Die Bildung von Leukotrienen hat ihren Ursprung in der Oxidation von Arachidonsäure. Daher führt die Inhibierung dieser Reaktion zur Inhibierung der Leukotrien-Synthese. Darüber hinaus wurden Antagonisten für Leukotrien-Rezeptoren ebenfalls als eine Anti-Leukotrien-Therapie bei Asthma/respiratorischen Problemen eingeführt (Tien F.C., Medical J. Aust. 171: 378, 1999). Das gegenwärtig lizenzierte Arzneimittel Zelutin, das auf der Inhibierung der Oxidation von Arachidonsäure basiert, wurde bereits ausschließlich auf dem US-Markt eingeführt. Jedoch ist seine Verwendung aufgrund seiner Hepatotoxizität („hepatotoxicity") eingeschränkt. Dieses Arzneimittel ist nicht für Kinder unter 14 Jahren empfohlen. Darüber hinaus müssen Patienten, die andere Arzneimittel einnehmen, überwacht werden, wenn sie Zelutin als Anti-Asthma-Arzneimittel einnehmen. (ii) die Neutralisation von IgE entweder durch anti-IgE-Antikörper (vermenschlicht, „humanized") oder durch Blockieren des hochaffinen IgE-Rezeptors, FcεR-I (Heusser C., Jardiu P. Current Oppinio Immunol., 9: 805, 1999). Da die Unterdrückung von Th2-Cytokinen zu einer Verringerung der IgE-Produktion führt, basiert eine zusätzliche Annäherung auf der Inhibition dieser Th2-Cytokin-Synthese und einer Erhöhung der Bildung von Th1-Cytokinen (Chung K.F.; Barens P.J. Thorax 54: 825, 1999).

Im Gegensatz hierzu wurde eine anti-asthmatische Zubereitung auf Basis von M. koenigii an Kinder bis zu einer unteren Altersgrenze von 7 Jahren und an Achtzigjährigen und noch Älteren ohne irgendeine nachteilige Reaktion ausprobiert.

Die Extrakte wie auch die Fraktionen von Extrakten von M. koenigii, die ausgehend von sämtlichen Pflanzenteilen einschließlich Blättern, Rinden, Wurzeln und Samen erhalten wurden, werden daher geprüft, um die bioaktiven Fraktionen zu bestimmen. Diese basieren auf deren Potential, die Herstellung von Leukotrienen zu inhibieren. Zusätzlich werden die Fraktionen auch auf die Verschiebung der Th2-Antwort in Richtung des Th1-Typs hin untersucht. Thi- und Th2-Antwort werden über die Erzeugung von y-Interferon (Th1) bzw. von IL-4 (Th2) gemessen. Einige Fraktionen von M. koenigii zeigten die Inhibierung der durch 5-Lipoxygenase vermittelten Oxidation von Arachidonsäure, was die Blockierung der Synthese von Leukotrienen und eine bemerkenswerte Erhöhung der Erzeugung von y-Interferon anzeigt, das wiederum die Erzeugung von IL-4 unterdrücken würde. Andererseits führen die meisten der Fraktionen des Extraktes aus P. belle-Blättern zu einer Erleichterung der Verschiebung von der Th2-Typ Reaktion zum Th1-Typ. Daher inhibierte eine Mischung von ausgewählten Extraktfraktionen dieser beiden Pflanzen M. koenigii und P. betle vorwiegend die Synthese von Leukotrien und verschob die Th2-Antwort in Richtung auf den Th1-Typ und wird daher als eine einzigartige synergistische Zusammensetzung zur Behandlung, Linderung und Heilung von bronchialen respiratorischen Problemen vorgeschlagen. Daher ist eine zweiseitige Strategie das Hauptziel dieser neuen Zusammensetzung und kann als die beste Modalität der Behandlung von bronchialen respiratorischen Problemen von Patienten angesehen werden.

Aufgaben der Erfindung

Die Hauptaufgabe der Erfindung ist es, die bioaktiven Fraktionen bereitzustellen, die aus den Extrakten der Blätter von Murraya koenigii und Piper betle erhalten wurden.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen pharmazeutischen Zusammensetzung, welche eine Kombination von Extrakten umfasst, die sich von den Blättern von Murraya koenigii und Piper betle ableiten.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen Zusammensetzung, welche eine Kombination von bioaktiven Fraktionen umfasst, die sich von Pflanzenteilen von Murraya koenigii und Piper betle ableiten, zur Behandlung von respiratorischen Problemen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine neue Zusammensetzung bereitzustellen, die eine Kombination von bioaktiven Fraktionen bereitzustellen, die von Murraya koenigii und Piper belle Pflanzenteilen abgeleitet sind zur Behandlung von respiratorischen Problemen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Extrakt aus den Blättern oder anderen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle bereitzustellen, der nützlich zur Linderung, Behandlung und der Heilung von respiratorischen Problemen ist.

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolation von bioaktiven Fraktionen aus den Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle bereitzustellen, die nützlich für die Linderung, Behandlung und Heilung von respiratorischen Problemen sind.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine vereinfachte Methode zur Isolation von bioaktiven Fraktionen aus allen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. bette bereitzustellen, die biologische Aktivitäten aufweisen, die für die Behandlung, Linderung und Heilung von respiratorischen Problemen relevant sind.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pflanzliche Präparation bereitzustellen, die Extrakte umfasst, die sich aus Blättern von M. koenigii und P. betle ableiten, oder Extrakte, die aus anderen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle erhalten wurden, wobei die besagten Extrakte sehr gut verträglich für den menschlichen Verbrauch (Einnahme) sind und in der Lage sind, für die Behandlungen, Linderung und Heilung von respiratorischen Problemen verwendet zu werden.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein vereinfachtes schnelles und nicht teures Verfahren für die Herstellung einer Zusammensetzung bereitzustellen, die biologische Aktivitäten besitzt, die für die Behandlungen, Linderung und Heilung von respiratorischen Problemen geeignet sind.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Preparation einer pflanzlichen Zusammensetzung bereitzustellen, die aktive Faktoren und bioaktive Fraktionen umfasst, die aus allen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle abgeleitet sind, worin die besagten Faktoren und bioaktiven Fraktionen sehr gut verträglich für den menschlichen Verbrauch und die Behandlungen, Linderung und Heilung von respiratorischen Problemen sind.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, jede der bioaktiven Fraktionen einzeln oder als Kombination von allen Pflanzenteilen von M. koenigii und von P. betle-Blättern, die eine inhibitorische Aktivität der durch 5-Lipoxygenase vermittelten Oxidation von Arachidonsäure haben und die Verschiebung der Antwort vom Typ Th2 zu einer Antwort vom Typ Th1 fördern, zu untersuchen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, jeden der aus Blättern oder anderen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle-erhaltenen Extrakte einzeln und als Kombination in Hinblick auf die inhibitorische Aktivität der durch 5-Lipoxygenase vermittelten Oxidation von Arachidonsäure und das Hervorrufen der Verschiebung von einer Antwort vom Typ Th2 in Richtung des Typs Th1 zu untersuchen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die durch 5-Lipoxygenase vermittelte Oxidation von Arachidonsäure in einem menschlichen Vollblutsystem außerhalb des Organismus (ex vivo) in Gegenwart von Fraktionen von M. koenigii und P. betle einzeln und als Kombination zu prüfen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die durch 5-Lipoxygenase vermittelte Oxidation von Arachidonsäure außerhalb des Organismus in Systemen mit angereicherten menschlichen polymorphonuklearen Neutrophilen (PMN) in Gegenwart von Fraktionen aus M. koenigii und P. betle einzeln und als Kombination zu prüfen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die durch 5-Lipoxygenase vermittelte Oxidation von Arachidonsäure in einem menschlichen Vollblutsystem ex vivo in Gegenwart von Blätterextrakten aus M. koenigii und P. betle oder von Extrakten ihrer anderen Pflanzenteile einzeln oder in Kombination zu prüfen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Erzeugung von intrazellulären Cytokinen durch Durchflusscytometrie nachzuweisen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, intrazelluläres IFN-gamma und IL-4-Profil als bekannte Marker für die Antwort vom Typ Th1 bzw. Th2 in menschlichem Vollblut ex vivo mit den Fraktionen aus allen Pflanzenteilen von M. koenigii und P. betle einzeln oder in Kombination bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine pflanzliche Formulierung bereit, die für die Blockierung der Aktivität von 5-Lipoxygenase nützlich ist, was zu der Inhibition der Leukotrien-Synthese, der Unterdrückung der Erzeugung von IL4 und der Erhöhung der Abgabe von IFN-gamma führt.

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung eine pflanzliche Formulierung zur Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Schwierigkeiten bereit. Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten aus den Blättern oder irgendwelchen anderen Pflanzenteilen oder Samen der Pflanzen M. koenigii und P. betle und deren ausgewählter Mischung bereit, um die biologische Antwort zu ermitteln, damit deren Rolle für die Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Leiden ermittelt wird.

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung eine pflanzliche Zusammensetzung bereit, die bioaktive Fraktionen umfasst, die aus den Blättern oder irgendwelchen anderen Pflanzenteilen oder Samen der Pflanzen M. koenigii und P. betle und deren ausgewählter Mischung erhalten wurden, zur Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Schwierigkeiten. Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung, physikochemischen Charakterisierung und Ermittlung der biologischen Antwort von bioaktiven Fraktionen bereit, die aus den Extrakten von beliebigen Pflanzenteilen einschließlich Blättern, Rinden, Wurzeln und Samen der Pflanzen M. koenigii und P. betle erhalten wurden, um deren Rolle für die Behandlung und Heilung von bronchialen respiratorischen Schwierigkeiten zu ermitteln.

Kurze Beschreibung der begleitenden Zeichnungen

1 beschreibt die durchflusscytometrische Bestimmung von intrazellulärem IFN-gamma in menschlichen mononuklearen Zellen ex vivo nach einer Cokultur mit Phorbolmysistatacetat (PMA) und Calciumionophor (Ionomycin) in der Gegenwart oder Abwesenheit von bioaktiven Fraktionen, die aus M. Koenigii (MK03, MK04, MK05) und P. betle (JB01C) erhalten wurden. Unsere Daten zeigen an, dass die bioaktiven Fraktionen MK03, MK04, MK05 und JB01C die Erzeugung von IFN-gamma erhöhten.

2 beschreibt die durchflusscytometrische Bestimmung von intrazellulärem IL-4 in ex vivo menschlichen Neutrophilen nach der Cokultur mit LPS in der Gegenwart oder Abwesenheit der Fraktionen MK03, MK04, MK05 und JB01C. Unsere Daten zeigen an, dass die Fraktion JB01C von P. betle die IL-4 erzeugenden Zellen merklich verringert. Auf der anderen Seite hatten die Fraktionen MK03, MK04, MK05 von Murraya koenigii nur marginale Effekte auf die Inhibierung der Erzeugung von IL-4. Interessanterweise verringert die Kombination der bioaktiven Fraktionen MK03, MK04, MK05 von Murraya koenigii und der bioaktiven Fraktion JB01C von P. betle drastisch die Erzeugung von IL-4.

3 beschreibt die durchflusscytometrische Bestimmung von intrazellulärem IFN-gamma und IL-4 in ex vivo menschlichen mononuklearen Zellen nach der Cokultur mit Phytohemmaglutinin in der Gegenwart oder Abwesenheit von Extrakten, die von M. Koenigii und P. betle erhalten wurden. Unsere Daten zeigen an, dass der Extrakt aus P. betle die IFG-gamma-positiven Zellen erhöhte und die IL-4-positiven Zellen merkliche verringerte. Der Extrakt von M. Koenigii hatte IL-4-positive wie auch IFN-gamma-positive Zellen verringert. Die Kombination dieser beiden Extrakte erhöhte die IFN-gamma-positiven Zellen auf die Kontrollebene („control level") und hielt immer noch einen verringerten Grad an IL-4-Positivität aufrecht.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Einsatz als Leukotrien-Inhibitor, IL4-Synthese-Inhibitor und als Immunmodulator vom Typ Th1 bereit, wobei die Zusammensetzung wirksame Mengen an lyophilisierten, wässrigen oder alkoholischen Extrakten, die aus den Blättern von Piper betle (PB) und von Murrya koenigii (M.k.) erhältlich sind, oder an bioaktiven Fraktionen, die von diesen Extrakten abgeleitet sind, mit wahlweise ein oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Inhaltsstoffen, umfasst.

In einer Ausführungsform werden die aus der Pflanze Murrya koenigii (M.K.) erhaltenen bioaktiven Fraktion als MK03, MK04 und MK05 bezeichnet.

In einer noch weiteren Ausführungsform dieser Erfindung werden die aus der Pflanze Piper betle (PB) erhaltenen bioaktiven Fraktionen als JB01A, JB01B und JB01C bezeichnet.

Eine noch weitere Ausführungsform bezieht sich auf die verwendeten pharmazeutisch verträglichen Inhaltsstoffe, die unter Nährstoffen wie Proteinen, Kohlenhydraten, Zucker, Talg, Magnesiumstearat, Zellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatinepaste und/oder Trägermaterialien, Arzneistoffträgern, Verdünnungsmitteln oder Lösungsmitteln ausgewählt sind.

Eine noch weitere Ausführungsform bezieht sich auf die Verabreichung der genannten Zusammensetzung durch Inhalation, oral, intravenös, intramuskulär, auf subkutanen Wegen oder beliebigen anderen geeigneten Wegen.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform erfolgt die orale Verabreichung in Form von Kapseln, Sirup, Konzentrat, Puder oder Körnchen und die auf oralem Wege verabreichte Menge ist größer als diejenige beim intravenösen Weg.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform ist der Anteil des M.K-Extraktes gleich oder größer als die Menge des Extraktes von Piper betle.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform liegt das Verhältnis des Extraktes von Piper betle (PB) zum Extrakt aus M.K im Bereich von 1:1 bis 1:5.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zusammensetzung mit einem Dosierungsgrad zwischen 1 bis 20 mg/kg des Körpergewichtes wenigstens einmal am Tag über eine Dauer von wenigstens 4 Wochen verabreicht.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform besteht die Zusammensetzung aus den bioaktiven Fraktionen MK03, MK04 und/oder MK05.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform besteht die Zusammensetzung aus den bioaktiven Fraktionen JB01C, MK03, MK04 und/oder MK05.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform ist die Menge der intravenös verabreichten bioaktiven Fraktionen geringer als diejenige der oralen Verabreichung.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform ist der Anteil an bioaktiven Fraktionen von M.k. gleich oder größer als derjenige der bioaktiven Fraktion von Piper Betle.

In einer noch weiteren Ausführungsform liegt das Verhältnis der aus dem Betle-Extrakt erhaltenen bioaktiven Fraktionen zu den aus dem M.K-Extrakt erhaltenen bioaktiven Fraktionen im Bereich von 1:1 bis 1:5.

Bei einer anderen Ausführungsform wird die Zusammensetzung mit einem Dosierungsgrad zwischen 0,5 bis 10,0 mg/kg des Körpergewichts wenigstens einmal am Tag über eine Dauer von vier Wochen hinweg in Abhängigkeit von den Atmungsbedingungen verabreicht.

In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die für einen Zeitraum von wenigstens vier Wochen bis zu drei Monaten verabreicht wird.

Eine noch weitere Ausführungsform bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die eine Kombination der bioaktiven Fraktionen MK03, MK04 und MK05 ist, die aus den Blättern von Murrya Koenigii erhalten wurde, zur Blockierung der Aktivität von 5-Lipooxygenase, was zu der Inhibierung der Synthese von Leukotrien, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 und zum Immunmodulator vom Typ Th1 führt.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Kombination der bioaktiven Fraktionen MK03, MK04 und MK05 ist, die aus den Blättern von Murrya Koenigii erhalten wurde, und von JB01C ist, das aus den Blättern von Piper betle erhalten wurde, die zum Blockieren der Aktivität von 5-Lipooxygenase, zur Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 und zur Steigerung der Abgabe von Gamma Interferon führt.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die genannte Zusammensetzung zur Behandlung bronchialer Atemzustände verwendet.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die genannte Zusammensetzung zur Behandlung von Säugetieren und Tieren verwendet.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die Zusammensetzung zum Verschieben der Th2-Reaktion zur Th1-Reaktion verwendet.

Bei einer weiteren Ausführungsform wird die genannte Zusammensetzung zur Inhibierung der durch 5-Lipooxygenase vermittelten Oxidation der Arachidonsäure in mit Neutrophilen angereicherten Bestandteilen des Vollblutes verwendet.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die besagte Zusammensetzung zur Steigerung der IFN-Gamma-Reaktion und zur Herabsetzung der IL-4-Reaktion im Vollblut ex vivo verwendet.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die besagte Zusammensetzung zur Steigerung der IFN-Gamma-Reaktion im einkernigen menschlichen Vollblut ex vivo verwendet.

Bei einer noch weiteren Ausführungsform wird die besagte Zusammensetzung zur Herabsetzung der IL-4-Reaktion in peripheren einkernigen Zellen des menschlichen Vollbluts verwendet.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine pflanzliche Zusammensetzung bereit, die zum Blockieren der Aktivität von 5-Lipoxygenase nützlich ist, was zu der Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Herstellung von IL4 und zur Steigerung der Abgabe von IFN-gamma führt, wobei diese Zusammensetzung eine wirksame Menge der aus den Blättern von Piper betel und Murrya koenigii erhaltenen Extrakte oder von lyophilisierten Extrakten von Piper betel (PB) und Murrya koenigii (M.K) umfasst.

Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, worin die als MK03 bezeichnete bioaktive Fraktion, die aus den Blättern von Murrya Koenigii erhalten wurde, zum Blockieren der Aktivität von 5-Lipooxygenase, die zu der Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 führt, die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

(a) der getrocknete Feststoff weist einen Schmelzpunkt zwischen 98 und 100 °C auf und ist löslich in DMSO;
(b) die Dünnschichtchromatographie zeigt in einem der Lösungsmittelsysteme Chloroform und Methanol (19:1) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,48;
(c) die HPLC-Analyse zeigt unter Verwendung der analytischen Säule Intersel ODS-3 und dem Lösungsmittelsystem Methanol einen einzigen Ausschlag (Peak) mit einer Verzögerungszeit von 8,5 min bei einer Flussrate von 0,5 ml/min, wobei der Nachweis bei 210 nm durchgeführt wurde. HPLC: Säule ODS-3 (4,6 × 250 mm), Flussrate 0,5 ml/min; Peak bei 210 nm; Verzögerungszeit 3,5 min; Lösungsmittelsystem Methanol;
(d) ¹³C-NMR ppm (125 MHz, CDCL3): 153,34, 153,29, 148,94, 140,73, 134,78, 131,58, 128,61, 124,22, 120,36, 119,97, 118,23, 118,02, 117,39, 116,63, 108,36, 104,39, 97,16, 78,03, 40,68, 25,67, 25,60, 22,70, 17,53 und 15,97; und
(e) die Fraktion „MK03" scheint eine reine stickstoffhaltige Verbindung zu sein.

Eine noch weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, worin die als MK04 bezeichnete bioaktive Fraktion, die aus den Blättern von Murrya Koenigi erhalten wurde, zum Blockieren der Aktivität von 5-Lipooxygenase, die zur Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 führt, die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

a. dunkel gefärbtes gummiartiges Material, welches in Dimethylsulfoxid löslich ist;
b. die TLC (Dünnschichtchromatographie) des bioaktiven Materials zeigt in dem Lösungsmittelsystem Chloroform und Methanol (19:1) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,38;
c. die HPLC-Analyse zeigt unter Verwendung der analytischen Säule Intersil ODS-3, mit dem Lösungsmittelsystem Methanol, einer Flussrate von 1,0 ml/min und bei einem Nachweis bei 254 nm einen Peak mit einer Verzögerungszeit von 5:69 Minuten;
d. NMR (300 MHz, CDCL3) δ 0,94, 1,30, 1,60, 2,04–2, 10, 2,27–2,34, 2,78–2,82, 3,53–3,81, 3,85–3,92, 4,00, 4,24–4,26 und 5,26–5,41 und
e. die Fraktion MK04 ist ein Glykolipid.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, worin die bioaktive Fraktion mit der Bezeichnung MK05, die aus den Blättern von Murrya Koenigi zum Blockieren der Aktivität von 5-Lipooxygenase erhalten wurde, was zur Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 führt, die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften aufweist:

a. dunkel gefärbter Feststoff, der in DMSO und in Wasser löslich ist;
b. die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,66;
c. die HPLC-Analyse dieser Fraktion zeigt mit dem Lösungsmittelsystem Methanol-Wasser (1:9), einer Flussrate von 0,5 ml/min und bei einem Nachweis bei 217 nm einen einzigen Peak bei einer Verzögerungszeit von 21 min;
d. ¹³C-NMR, ppm (125 MHz, D₂O):9,22, 159,00, 147,63, 147,02, 144,76, 135,72, 131,28, 131,10 129,90, 129,63, 129,20, 128,20, 127,59, 123,30 116,81, 116,39, 115,80, 114,79, 81,77, 76,26, 76,15, 74,20, 73,79, 73,64, 73,49, 72,84, 72,16, 71,34, 70,29, 69,89, 68,83, 67,96, 63,71, 63,14, 58,22, 56,62, 56,19, 54,47, 54,42, 54,37, 41,90, 36,87 und 20,93; und
e. die MK05-Fraktion hat den Anschein, eine mit Zuckern konjugierte aromatische Verbindung zu sein.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Erhöhung der Abgabe von Gamma-Interferon, in der die bioaktive Fraktion, nämlich JB01A, die aus den Blättern von Piper betle erhalten wurde, die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

a. weißfarbiges Feststoff-Material, das sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist;
b. die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,07 auf;
c. die HPLC zeigt mit dem Lösungsmittelsystem Wasser-Methanol (1:9), einer Flussrate von 0,5 ml/min, bei einem Nachweis bei 217 nm und der analytischen Säule Intersil ODS-3 einen einzigen Peak mit einer Verzögerungszeit von 8,4 min (JP01A, Peak-1);
d. ¹³C-NMR, ppm (125 MHz, D₂O): 109,71, 108,417, 107,94, 104,17, 100,27, 84,38, 81,79, 81,53, 80,74, 77,03, 75,58, 73,85, 73,42, 71,71, 71,27, 70, 74, 70,38, 69,12, 61,71, 61,00 und 60,54; und
e. die JB01A-Fraktion ist ein Oligosaccharid.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Erhöhung der Abgabe von Gamma-Interferon, in der die bioaktive Fraktion, nämlich JB01B, die aus den Blättern von Piper betle erhalten wurde, die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

a. weiß gefärbter Feststoff, der sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist;
b. die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Flecken mit einem Rf von 0,27;
c. die HPLC zeigt unter der oben genannten Säulenbedingung einen Peak mit einer Verzögerungszeit von 8,8 min (JB01B, Peak-2);
d. ¹³C-NMR, ppm (125 MHz, D₂O): 169,48, 104,30, 98,86, 98,55, 92,60, 81,82, 76,98, 76,07, 74,57, 73,52, 73,23, 71,78, 71,46, 70,02, 69,84, 69,74, 69,30, 68,92, 68,77, 67,01, 66,43, 62,95, 62,02, 61,61, 48,67, 44,62, 38,88; und
e. die JB01B-Fraktion ist ein Oligosaccharid-Derivat.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Erhöhung der Abgabe von Gamma-Interferon, in der die bioaktive Fraktion, nämlich JB01C, die aus den Blättern von Piper betle erhalten wurde, die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

a. weiß gefärbter Feststoff, der sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist;
b. die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Flecken mit einem Rf von 0,34;
c. die HPLC zeigt unter der oben genannten Säulenbedingungen einen einzigen Peak mit einer Verzögerungszeit von 9,8 min auf (JB01C, Peak-3);
d. NMR, ppm (300 MHz, D₂O): 2,34, 3,27, 3,28, 3,44–3,47, 3,51, 3,60–3,63, 3,68, 3,92–3,99, 4,08,4,92 und 5,36; und
e. die Fraktion JB01C ist ein Oligosaccharid.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Methode zur Behandlung eines Subjektes aufgrund von bronchialen respiratorischen Bedingungen, wobei diese Methode die Verabreichung einer effektiven Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das Subjekt umfasst, die aus einem lyophilisierten wässrigen oder alkoholischen Extrakt, der aus den Blättern von Piper betle (PB) und Murrya koenigii (M.K) erhalten wurde, oder von bioaktiven Fraktionen, die sich aus diesen Extrakten ableiten, und wahlweise in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Inhaltsstoffen besteht.

In einer anderen Ausführungsform wird die genannte Zusammensetzung oral, intravenös, intramuskulär, durch Inhalation oder auf subkutanem Wege verabreicht.

In einer noch weiteren Ausführungsform erfolgt die orale Verabreichung in Form von Kapseln, Sirup, Konzentrat, Puder oder Körnchen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die als Inhibitor der Synthese von Leukotrien und IL4 und als ein Immunomodulator vom Typ Th1 nützlich ist, wobei die Zusammensetzung effektive Mengen an einer oder mehreren bioaktiven Fraktionen umfasst, die aus Extrakten von Pflanzenteilen aus Piper betle (PB) mit den Bezeichnungen JB01A, JB01B und JB01C erhalten wurden und einer bioaktiven Fraktion, die aus Extrakten von Pflanzenteilen von Murrya Koenigii (M.K) mit der Bezeichnung MK03, MK04 und MK05 erhalten wurden, wahlweise assoziiert mit oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Additiven.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Methode zur Behandlung eines Subjektes aufgrund von bronchialen Atemwegsbedingungen, wobei diese Methode die Verabreichung einer effektiven Menge an einer oder mehreren bioaktiven Fraktionen, die aus den Blattextrakten von Murrya Koenigii (M.K) erhalten wurden und als MK03, MK04, und MK05 bezeichnet wurden, wahlweise assoziiert mit oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Additiven, an das Subjekt umfasst.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zellen in einem ex vivo menschlichen Blutsystem mit einem Calciumionophor oder ähnlichem aktiviert.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die bioaktiven Fraktionen von den Blättern von M. koenigii und P. betle durch die Technik wie z. B. Lösungsmittelfraktionierung, TLC, HPTLC, HPLC usw. getrennt.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Pflanzenmaterialien zur Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel wie z. B. Methanol oder Wasser oder Puffer in einem Durchlauferhitzer oder der im Stand der Technik bekannten Ausrüstung verwendet.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Extrakte aus Blättern von M. koenigii und P. betle unter reduziertem Druck konzentriert, um das aktive Prinzip zu retten.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Konzentrate lyophilisiert, um das verringerte Wasser und anderes restliches Lösungsmittel zu entfernen.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der lyophilisierte Feststoff unter Verwendung von Silikagel oder Sephadex LH-20 chromatographiert, um die reinen Fraktionen zu isolieren.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die isolierten Fraktionen von M.K und P.B als aktiver Inhibitor der durch 5-Lipoxygenase vermittelten Oxidation von Arachidonsäure in einem ex vivo menschlichen Vollblut gefunden.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die bioaktiven Fraktionen aus der durch Extrakte von M. koenigii und P. betle inhibierten, durch 5-Lipoxygenase vermittelten Oxidation von Arachidonsäure in einer mit Neutrophilen angereicherten Fraktion aus Vollblut ausgewählt.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die bioaktiven Fraktionen aus den Extrakten von M. koenigii und P. betle die IFN-gamma Reaktion in ex vivo menschlichem Vollblut zu erhöhen.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die aus Extrakten von M. koenigii und P. betle ausgewählten bioaktiven Fraktionen die INF-gamma-Reaktion in Neutrophilen in ex vivo menschlichem Blut erhöhen (PMN).

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die aus den Extrakten von M. koenigii und P. betle ausgewählten bioaktiven Fraktionen die IL-4-Reaktion in menschlichen peripheren mononuklearen Blutzellen verringern.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Fraktionen, die aus den Extrakten von M. koenigii und P. betle erhalten wurden, bei denen gefunden wurde, dass sie Inhibitoren der durch 5-Lipoxygenase vermittelten Oxidation von Arachidonsäure sind, untersucht nach der Inkubation des Vollblutes und Lysierung der Zellen zum Zeitpunkt der Prüfung, zur Herstellung der Zusammensetzung ausgewählt.

In einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der lyophilisierte Feststoff an Silikagel oder Sephadex LH-20 chromatographiert, um die in Blättern von Murraya koenigii und Piper betle vorhandene reine bioaktive Fraktion für die Verwendung zur Linderung, Behandlung und Heilung von respiratorischen Problemen zu isolieren.

Die folgenden Beispiele sind zur Illustration angegeben.

Beispiel I
Sammlung des Pflanzenmaterials
Die Blätter von Pflanzen von Murraya Koenigii und Piper betle wurden aus Gesträuchen bzw. Schlingpflanzen aus verschiedenen Teilen von Westbengalen, Indien, gesammelt. Eine Musterprobe ist bei der Abteilung für Medizinische Chemie beim Indischen Institut für Chemische Biologie, 4 Raja S.C. Mullick Road, Calcutta-700032 hinterlegt.
Beispiel II
Herstellung des bioaktiven Materials
Teil I (Murraya koenigii)
Frische Blätter von Murraya koenigii wurden gesammelt, gereinigt und mit Wasser gewaschen, nachdem sie vom örtlichen Lieferanten erhalten wurden, und wurden als Ausgangsmaterialien verwendet.
410 g der frischen Blätter von Murraya koenigii wurden in einem Mischer („mixture-blender") in Methanol zu einer Paste verarbeitet (1000 ml) und unter Zugabe von 1000 ml Methanol in einen Glasfiltriergerät („glass percolator") (5 Liter Kapazität) gegeben. Dieses wird für 16 Stunden (über Nacht) bei Raumtemperatur gehalten. Das Filtrieren des Extraktes durch Whatman No. 1-Filterpapier sammelte das Filtrat. Das Verfahren der Extraktion wurde vier Male wiederholt und der kombinierte Extrakt wurde unter verringertem Druck in einem Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft, wobei die Temperatur bei 40 °C (Bad) gehalten wurde. Der zurückgebliebene restliche feste Gegenstand ist in seiner Erscheinung viskos und wird weiter durch Gefriertrocknung getrocknet. Die Ausbeute beträgt 25,63 g (MKOC). Das schematische Diagramm des Fraktionierungsverfahrens ist im Flussdiagramm 1 dargestellt.
Beispiel 3
150 g frische Blätter von M. koenigii wurden gründlich mit sterilem Wasser gewaschen und mit 750 ml in Glas destilliertem Wasser in einem Mischer homogenisiert und dann in einem Ultraschallbad mit jeweils 5 Impulsfolgen („with 5 burst each") für 5 Minuten mit Ultraschall bestrahlt. Filtrieren durch Whatman No. 1-Filterpapier trennte das in Wasser extrahierte Material. Diese Art der Behandlung für das Extrahierte wurde drei Male wiederholt. Der kombinierte Extrakt wurde gefriergetrocknet, wobei 11 g als Gewicht eines pulverförmigen Materials (MKOC) erhalten wurden.
Beispiel 4 Teil II (P. betle)-Extrakt
Frische Blätter wurden von einem örtlichen Lieferanten gesammelt und als Ausgangsmaterial verwendet.
Die frischen Blätter von P. betle (1,5 kg, homogenisiert mit destilliertem Wasser (500 ml) in einem Mischer („mixture-blender") und dann in einem Ultraschallbad mit 3 Signalfolgen von jeweils 15 Minuten mit Ultraschall bestrahlt. Die Extraktion wurde über Nacht für 16 Stunden erlaubt. Das Filtrieren durch Whatman Nr. 1 Filterpapier trennte das in Wasser extrahierte Material ab. Diese Art der Behandlung der Extraktion wurde drei Male wiederholt. Der kombinierte Extrakt wurde bis zur Trockene in einem Blitzverdampfer („flash evaporator") unter verringertem Druck bei 40 °C eingedampft. Die restliche Substanz wurde dann in einem Exsikkator unter Hochvakuum getrocknet und es blieb ein halbfestes Material zurück (14,92 g) (JB01). Das schematische Diagramm des Fraktionierungsverfahrens ist im Flussdiagramm II dargestellt.
Beispiel 5 (Extrakt von M. koenigii und Extrakt von P. betle)
3 g Extrakt von M. koenigii und 3 g Extrakt von P. betle wurden unter Zugabe von wenigen Wassertropfen miteinander homogen gemischt. Der gesamte Extrakt wurde in einem Gefriertrockner bis zur Trockene eingedampft. Dieser Extrakt wurde auf biologische Aktivität geprüft (MKOC + JB01).
Beispiel 6 (MK + PB)
200 g der jeweiligen Pflanzenteile wurden getrennt mit 300 ml Methanol in einem Mischer homogenisiert. Es wird dann in einem Ultraschallbad mit 3 Impulsfolgen von jeweils 15 Minuten mit Ultraschall bestrahlt. Der Extrakt wird durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert und das Filtrat wird gesammelt. Dieses Verfahren der Extraktion wird drei Male wiederholt. Der kombinierte Extrakt wurde lyophilisiert, wobei er eine halbfeste Masse ergab, die 6,32 g wog.
Beispiel 7
Frische Blätter von M. koenigii (70 g) und P. betle (500 g) wurden miteinander gemischt und wurden gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. Es wurde mit destilliertem Wasser (300 ml) in einem Mischer homogenisiert. Es wurde dann in einem Ultraschallbad mit 3 Impulsfolgen von jeweils 15 Minuten mit Ultraschall bestrahlt. Der Extrakt wurde durch Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde gesammelt. Dieses Verfahren der Extraktion wurde drei Male wiederholt. Der kombinierte Extrakt wurde lyophilisiert, wobei ein halbfeste Masse erhalten wurde (10 g). Diese wurde dann auf biologische Aktivität getestet (MKOC + JB01).
Da die Blätter von beiden Pflanzen in Indien weithin zur Herstellung von zahlreichen Lebensmittelzubereitungen verwendet werden, muss seine Bioverträglichkeit und Giftigkeit niemanden beunruhigen. Außerdem sind beide Pflanzen allgegenwärtig. Die Gegenwart der bioaktiven Faktoren in dem Blatt von Murraya koenigii und Piper betle, die zur Linderung, Behandlung und Heilung von respiratorischen Problem nützlich ist, wurde hierin gezeigt und seine Herstellung ist schnell, bequem und nicht teuer. Die Verfütterung des Pflanzenextraktes an Tiere erzeugte keinerlei nachteilige Effekte.
Ein Teil dieses Extraktes (4,00 g) wurde über eine Sephadex LH-20-Säule chromatographiert. Unter den isolierten Fraktionen wurden drei, die als JB01A (0,17 g oder 70 mg), JB01B (0,33 g oder 330 mg) und JB01C (0,94 g oder 940 mg) bezeichnet wurden, als aktiv gefunden.
Beispiel 8
Die Methode der Herstellung der bioaktiven Faktoren umfasst:

1. Sammeln der frischen Blätter und aller anderen Pflanzenteile von örtlichen Lieferanten
2. Trocknen der Pflanzenteile im Schatten auf ein moderates Ausmaß oder Heranziehen der frischen Pflanzenteile als das Ausgangsmaterial
3. Pulverisierung der getrockneten oder Homogenisieren der jeweiligen Pflanzenteile getrennt in einem in der Technik bekannten Apparat.
4. Hineintun des Pulvers oder des Homogenisats in einen Perkolator unter der Masse von geeigneten Lösungsmitteln; Auswählen von Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln wie z. B. Petrolether (Siedepunkt 40–60 °C), Pentan, Hexan, Benzol, usw., chlorierte Lösungsmittel wie z. B. Chloroform, Dichlormethan, Tetrachlorkohlenstoff usw., Ether-artige Lösungsmittel wie z. B. Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan usw., Keton-artige Lösungsmittel wie z. B. Aceton, Cyclopentanon usw.; Esterlösungsmittel wie z. B. Ethylacetat, Ethylformat usw.; alle Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol, n-Butanol, usw., Wasser und Puffer.
5. Extrahieren des perkolierten Pflanzenmaterials unter Verwendung eines Perkolators oder einer Ausrüstung, die gegenwärtig in der Technik bekannt sind, für einen Zeitraum, der von 1 bis 120 Stunden reicht.
6. Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck unter Verwendung eines Apparates oder einer Ausrüstung, die gegenwärtig in der Technik bekannt sind.
7. Lyophilisieren oder Trocknen des Materials in dem Apparat oder der Ausrüstung, die gegenwärtig in der Technik bekannt sind, und Aufbewahren des verarbeiteten Materials in einem kühlen und trockenen Platz in einem luftdichten Behälter.
8. Isolation von einzelnen bioaktiven Fraktionen mittels Chromatographie an Silikagel und Sephadex LH-20.
9. Charakterisierungen von reinen Verbindungen, die in dem Extrakt vorhanden sind, die als Marker für die Auswertung der Bioaktivität verwendet werden sollen.
10. Aufbewahren des verarbeiteten Materials an einem kühlen und trockenen Platz in einem luftdichten Behälter.
11. Auswertung der Bioaktivität des Materials.

Beispiel 9
Beschreibung der Methode zur Messung der Inhibierung der Oxidation von Arachidonsäure. 500 μl heparinisiertes menschliches peripheres Blut, das mit PBS zur Hälfte verdünnt war, wurde in jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen gegeben. In jede Vertiefung wurde eine 10 μg/ml-Konzentration von jeder Extraktprobe gegeben. Die Zellen wurden dann für 3 Stunden bei 37 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die 10 μl/ml einer Lösung von Arachidonsäure (12,2 mg/ml von absolutem Alkohol, der unter Argon bei –20 °C gelagert wurde) wurde zu jeder Vertiefung 5 Minuten vor der Zugabe von Calciumionophor (A23187) mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um die Inkubation für weitere 10 Minuten fortzusetzen. Das Volumen der Zell-Suspension wurde mit PBS auf 2 ml erhöht und ihr Sauerstoffgehalt wurde unter Zuhilfenahme eines empfindlichen Oxygraph-Instrumentes verfolgt.
Beispiel 10
Methode:
500 heparinisiertes menschliches peripheres Blut, das mit PBS zur Hälfte verdünnt war, wurde in jede Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen gegeben. In jede Vertiefung wurde eine 1 μg/ml Konzentration von jeder Probe gegeben. Im Falle der Mischung wurden die Fraktionen unter einem 1:1-Verhältnis gemischt, um eine endgültige Preparation herzustellen, die mit einer Konzentration von 1,0 μg/ml verwendet wird. Die Zellen wurden dann für 3 Stunden bei 37 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die 10 μl/ml einer Lösung von Arachidonsäure (12,2 mg/ml von absolutem Alkohol, der unter Argon bei –20 °C gelagert wurde) wurde zu jeder Vertiefung 5 Minuten vor der Zugabe von Calciumionophor (A23187) mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um die Inkubation für weitere 10 Minuten fortzusetzen. Das Volumen der Zell-Suspension wurde mit PBS auf 2 ml erhöht und ihr Sauerstoffgehalt wurde unter Zuhilfenahme eines empfindlichen Oxygraph-Instrumentes verfolgt.
Beispiel 11
500 μl halb verdünntes menschliches peripheres Blut wurden mit 10 μg/ml von jedem Extrakt für 3 Stunden bei 37 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Dann wurden 10 μl/ml einer Lösung von Arachidonsäure (12,2 mg/ml von absolutem Alkohol, der unter Argon bei –20 °C gelagert wurde) zu jeder Vertiefung 5 Minuten vor der Zugabe von Calciumionophor (A23187) mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um die Inkubation für weitere 10 Minuten fortzusetzen. Das Volumen der Zell-Suspension wurde unter Zugabe von 1 ml von PBS + 500 μl Wasser auf 2 ml erhöht, um die Zellen zu lysieren. Der Sauerstoffgehalt des Zellenlysats wurde unter Zuhilfenahme eines empfindlichen Oxygraph-Instrumentes verfolgt.
Beispiel 12
Methode:
500 μl halb verdünntes menschliches peripheres Blut wurden mit 1 μg/ml von jeder Fraktion für 3 Stunden bei 37 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Im Falle der Mischung wurden die Fraktionen in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, um eine endgültige Preparation herzustellen, die bei einer Konzentration von 1,0 μg/ml verwendet wurde. Dann wurde 10 μl/ml einer Lösung von Arachidonsäure (12,2 mg/ml von absolutem Alkohol, der unter Argon bei –20 °C gelagert wurde) zu jeder Vertiefung 5 Minuten vor der Hinzugabe von Calciumionophor (A23187) mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um die Inkubation für weitere 10 Minuten fortzusetzen. Das Volumen der Zell-Suspension wurde unter Zugabe von 1 ml von PBS + 500 μl Wasser auf 2 ml erhöht, um die Zellen zu lysieren. Der Sauerstoffgehalt des Zellenlysats wurde unter Zuhilfenahme eines empfindlichen Oxygraph-Instrumentes verfolgt.
Beispiel 13
Heparinisiertes menschliches peripheres Blut wurde mit dem gleichen Volumen einer 2%igen Lösung von Gelatine in PBS gemischt und für eine halbe Stunde stehen gelassen, wenn sich das RBC am Boden gesammelt hat. Die obere Schicht, die mit Neutrophilen angereicherte mononukleare Zellen enthält, wurde zentrifugiert und das Zellkügelchen („cell pellet") wurde in PBS suspendiert. 500 μl dieser Zellsuspension (3 × 10⁶ Zellen/Vertiefung) wurden mit 10 μg/ml jeder Probe bei 37 °C für 3 Stunden inkubiert. Dann wurde 10 μl/ml einer Lösung von Arachidonsäure (12,2 mg/ml von absolutem Alkohol, der unter Argon bei –20 °C gelagert wurde) zu jeder Vertiefung 5 Minuten vor der Hinzugabe von Calciumionophor (A23187) mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um die Inkubation für weitere 10 Minuten fortzusetzen. Das Volumen der Zelle wurde mit PBS auf 2 ml erhöht und der Sauerstoffgehalt der Zell-Suspension wurde in einem empfindlichen Oxygraph-Instrument verfolgt.
Auf diese Weise wurden Extrakte von M. koenigii und P. betle auf biologische Aktivität überprüft, die relevant ist für die Linderung, Behandlung und Heilung von respiratorischen Problemen und der verarbeitete Extrakt wurde mittels Dünnschichtchromatographie und HTPLC analysiert. Der gemischte Extrakt wurde aufgelöst und fein in geeigneten Lösungsmitteln dispergiert und in dem Testsystem (menschliches Vollblut außerhalb des Organismus („ex vivo")) verwendet, um die festgelegte biologische Antwort zu begründen.
Beispiel 14
Methode
Heparinisiertes menschliches peripheres Blut wurde mit dem gleichen Volumen einer 2%igen Lösung von Gelatine in PBS gemischt und für eine halbe Stunde stehen gelassen, wenn sich das RBC am Boden gesammelt hat. Die obere Schicht, die mit Neutrophilen angereicherte mononukleare Zellen enthält, wurde zentrifugiert und das Zellkügelchen („cell pellet") wurde in PBS suspendiert. 500 μl dieser Zellsuspension (3 × 10⁶ Zellen/Vertiefung) wurden mit 1 μg/ml jeder Fraktion bei 37 °C für 3 Stunden inkubiert. Im Falle einer Mischung wurden die Fraktionen in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, um die endgültige Zubereitung herzustellen, die mit einer Konzentration von 1,0 μg/ml verwendet wurde. Dann wurden 10 μl/ml einer Lösung von Arachidonsäure (12,2 mg/ml) zu jeder Vertiefung 5 Minuten vor der Hinzugabe von Calciumionophor (A23187) mit einer Konzentration von 20 μg/ml hinzugefügt, um die Inkubation für weitere 10 Minuten fortzusetzen. Das Volumen der Zelle wurde mit PBS auf 2 ml erhöht und der Sauerstoffgehalt der Zell-Suspension wurde in einem empfindlichen Oxygraph-Instrument verfolgt.
Auf diese Weise wurden bioaktive Fraktionen aus den Extrakten der Blätter von M. koenigii und P. betle auf die biologische Aktivität überprüft, die relevant ist für die Linderung, Behandlung und Heilung von asthmatischen Zuständen und die auf diese Weise bearbeitete Fraktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie und HPLC und NMR-Spektren analysiert, aufgelöst und fein in geeigneten Lösungsmitteln dispergiert und in dem Testsystem (menschliches Vollblut außerhalb des Organismus („ex vivo")) verwendet, um die festgelegte biologische Antwort zu begründen.
Beispiel 15
Herstellung von intrazellulärem Interferon gamma (IFN-y) und Interleukin-4 (IL-4) mittels Durchflusscytometrie
Heparinisiertes Vollblut (0.1 ml/Vertiefung von Platten mit 24 Vertiefungen, gesammelt von normalen Individuen) wurden bei 37 °C in 5 % CO2 für 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml Rosewell-Park-Memorial-Institute (RPMI)-Medium, das 10 % in der Hitze desaktiviertes fötales Rinderserum („fetal bovine serum") und Phytohaemaglutinin (PHA, 10 μg/ml) enthielt, in der Gegenwart oder in Abwesenheit von Extrakten aus P. betle und M. koenigii (jeweils 1,0 mg/ml), allein oder in Kombination, kultiviert. Um die intrazelluläre Ansammlung von neu synthetisierten Proteinen zu bewirken, wurde Brefeldin A (10 μg/ml) während mindestens vier Stunden zu den Zellen hinzugegeben. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Zellen mit der lysierenden FACSTM-Lösung (Becton Dickinson, USA) zur Lyse von RBC behandelt. Die Zellen wurden dann gewaschen, durch die Behandlung mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten permeabilisiert. Nach dem Waschen mit Waschpuffer (mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung [PBS], die 1 % Albumin, 0,1 % Saponin und 0,1 % Natriumazid enthält) wurden die permeabilisierten Zellen mit entweder mit FITC-gekennzeichneten („FITC-labeled") Anti-IFN-y-monoklonalen Antikörper oder mit PE-gekennzeichneten („PE-labeled") anti-IL-4-monoklonalem Antikörper während 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit behandelt. Die Zellen wurden mit Waschpuffer gewaschen und dann wieder in PBS suspendiert, das 1 % Paraformaldehyd enthält, für eine Einzelfarben-Durchflusscytometrie-Analyse unter Verwendung von FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) mit dem Programm Cell Quest. Zehntausend Zellen wurden für jede Probe gesammelt und die Fluoreszenz-Intensität wurde auf einer logarithmischen Skala gemessen. Um sicherzustellen, dass nur intrazelluläres IFN-y oder IL-4 nachgewiesen wurde, wurden die Zellen vor der Permeabilisierung mit mit FITC-gekennzeichneten („FITC-labeled") Anti-IFN-y- oder mit PE-gekennzeichneten („PE-labeled") anti-IL-4 Antikörpern versetzt/gefärbt und ergaben weniger als 0,2 % fluoreszierende Zellen für jede Einfärbung. Unbedeutsame „isotype-matched" Kontrollantikörper erzeugten ebenfalls nur weniger als 0,1 fluoreszierende Zellen.
Die Bestimmung von intrazellulärem IFN-gamma und IL-4 in ex vivo menschlichen mononuklearen Zellen nach der Cokultur mit Phytohemmaglutinin in der Gegenwart oder Abwesenheit von Extrakten, die von M. Koenigii und P. betle erhalten wurden, mittels Durchflusscytometrie. Unsere Daten belegen, dass der Extrakt aus P. betle die IFN-gamma-positiven Zellen erhöhte und die IL-4-positiven Zellen merklich verringerte. Der Extrakt von M. koenigii hatte die IL-4-positiven Zellen wie auch die IFN-gamma-positiven Zellen verringert. Die Kombination dieser beiden Extrakte erhöhte die IFN-gamma-positiven Zellen auf das Kontrolllevel und erhielt noch ein verringertes Level von IL-4-positiv aufrecht.
Beispiel 16
Ein Teil des Extraktes von M. koenigii (8,01 g) wird einer Säulenchromatographie an Silikagel unterzogen, die in der Isolation von Fraktionen unter den biologisch aktiven Fraktionen resultierte. Diese werden als Fraktion MK03 (70 mg), MK04 (270 mg) und MK05 (110 mg) bezeichnet.
Beispiel 17
Physikochemische Charakterisierung von MK03, MK04, MK05, JB01A, JB01B und JB01C
Fraktion MK03:

1. Der getrocknete Feststoff, Schmelzpunkt 98–100 °C, löslich in DMSO.
2. Dünnschichtchromatographie zeigt einen einzelnen Flecken, der einen Rf von 0,48 in einem der Lösungsmittelsysteme Chloroform und Methanol (19:1) hat.
3. Die HPLC-Analyse zeigte einen einzelnen Peak mit einer Retentionszeit von 8,5 Minuten bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,5 ml/min, wobei eine analytische Säule Intersel ODS-3 (4,6 × 250 mm), Lösungsmittelsystem Methanol, verwendet und die Detektion bei 210 nm durchgeführt wird. HPLC: Säule ODS-3 (4,6 × 250 mm); Durchflussgeschwindigkeit – 0,5 m/min; Retentionszeit – 3,5 Minuten; Lösungsmittelsystem-Methanol.
4. ¹³C-NMR ppm (125 MHz, CDCL3): 153,34, 153,29, 148,94, 140,73, 134,78, 131,58, 128,61, 124,22, 120,36, 119,97, 118,23, 118,02, 117,39, 116,63, 108,36, 104,39, 97,16, 78,03, 40,68, 25,67, 25,60, 22,70, 17,53 und 15,97.
5. Die Fraktion „MK03" scheint eine reine stickstoffhaltige Verbindung zu sein.

Fraktion MK04:

1. Dunkel gefärbtes gummiartiges Material, das in Dimethylsulfoxid löslich ist;
2. Die TLC des bioaktiven Materials zeigt in dem Lösungsmittelsystem Chloroform und Methanol (19:1) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,38:
3. Die HPLC-Analyse des bioaktiven Materials unter Verwendung der analytischen Säule Intersil ODS-3, mit dem Lösungsmittelsystem Methanol, einer Flussrate von 1,0 ml/min und bei einem Nachweis bei 254 nm zeigt einen Peak mit einer Verzögerungszeit von 5:69 Minuten auf;
4. NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 0,94, 1,30, 1,60, 2,04–2,10, 2,27–2,34, 2,78–2,82, 3,53–3,81, 3,85–3,92, 4,00, 4,24–4,26 und 5,26–5,41.
5. Die Fraktion MK04 ist ein Glykolipid.

Fraktion MK05:

1. Dunkel gefärbter Feststoff, der in DMSO und in Wasser löslich ist;
2. Die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,66;
3. Die HPLC-Analyse dieser Fraktion zeigt mit dem Lösungsmittelsystem Methanol- Wasser (1:9), einer Flussrate von 0,5 ml/min und bei einem Nachweis bei 217 nm einen Peak mit einer Verzögerungszeit von 21 min;
4. ¹³C-NMR, ppm (125 MHz, D₂O): 9,22, 159,00, 147,63, 147,02, 144,76, 135,72, 131,28, 131,10 129,90, 129,63, 129,20, 128,20, 127,59, 123,30 116,81, 116,39, 115,80, 114,79, 81,77, 76,26, 76,15, 74,20, 73,79, 73,64, 73,49, 72,84, 72,16, 71,34, 70,29, 69,89, 68,83, 67,96, 63,71, 63,14, 58,22, 56,62, 56,19, 54,47, 54,42, 54,37, 41,90, 36,87 und 20,93.
5. Die MK05-Fraktion scheint eine mit Zuckern konjugierte aromatische Verbindung zu sein.

Fraktion JB01A:

1. Weißfarbiges Feststoff-Material, das sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist;
2. Die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen Fleck mit einem Rf von 0,07;
3. Die HPLC zeigt mit dem Lösungsmittelsystem Wasser-Methanol (9:1), einer Flussrate von 0,5 ml/min, bei einem Nachweis bei 217 nm und mit der analytischen Säule Intersil ODS-3 einen einzigen Peak mit einer Verzögerungszeit von 8,4 min (JP01A, Peak-1);
4. ¹³C-NMR, ppm (125 MHz, D₂O): 109,71, 108,417, 107,94, 104,17, 100,27, 84,38, 81,79, 81,53, 80,74, 77,03, 75,58, 73,85, 73,42, 71,71, 71,27, 70, 74, 70,38, 69,12, 61,71, 61,00 und 60,54.
5. Die JB01A-Fraktion ist ein Oligosaccharid.

Fraktion JB01B:

1. Weiß gefärbter Feststoff, der sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist;
2. Die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Flecken mit einem Rf von 0,27;
3. Die HPLC zeigt unter der oben genannten Säulenbedingung einen Peak mit einer Verzögerungszeit von 8,8 min (JB01B, Peak-2).
4. ¹³C-NMR, ppm (125 MHz, D₂O): 169,48, 104,30, 98,86, 98,55, 92,60, 81,82, 76,98, 76,07, 74,57, 73,52, 73,23, 71,78, 71,46, 70,02, 69,84, 69,74, 69,30, 68,92, 68,77, 67,01, 66,43, 62,95, 62,02, 61,61, 48,67, 44,62, 38,88.
5. Die Fraktion JB01B ist ein Oligosaccharid-Derivat.

Fraktion JB01C:

1. Weiß gefärbter Feststoff, der sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist.
2. Die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Flecken mit einem Rf von 0,34;
3. Die HPLC zeigt unter der oben genannten Säulenbedingung einen einzigen Peak mit einer Verzögerungszeit von 9,8 min (JB01C, Peak-3);
4. NMR (300 MHz, D₂O): 2,34, 3,27, 3,28, 3,44–3,47, 3,51, 3,60–3,63, 3,68, 3,92–3,99, 4,08, 4,92 und 5,36.
5. Die Fraktion JB01C ist ein Oligosaccharid.

Beispiel 18
Beschreibung des Tests zur Analyse von intrazellulärem Interferon gamma (IFN-y) und Interleukin-4 (IL-4) mittels Durchflusscytometrie
Methode: Heparinisiertes Vollblut (0.1 ml/Vertiefung von Platten mit 24 Vertiefungen, gesammelt von normalen Individuen) wurden bei 37 °C in 5 % CO₂ für 6 Stunden in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml Rosewell-Park-Memorial-Institute (RPMI)-Medium, das 10 % in der Hitze desaktiviertes fötales Rinderserum („fetal bovine serum") und Phorbolmyristatacetat (PMA) und Inomycin oder LPS enthält, in der Gegenwart oder in Abwesenheit von Fraktionen aus allen Pflanzenteilen von P. betle und M. koenigii (jeweils 50,0 μg/ml), allein oder in Kombination, kultiviert. Um die intrazelluläre Ansammlung von neu synthetisierten Proteinen zu bewirken, wurde Brefeldin A (10 μg/ml) während mindestens vier Stunden zu den Zellen gegeben. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Zellen mit der lysierenden FACS^TM-Lösung (Becton Dickinson, USA) zur Lyse von RBC behandelt. Die Zellen wurden dann gewaschen, durch Behandlung mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten permeabilisiert. Nach dem Waschen mit Waschpuffer (mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung [PBS], die 1 % Albumin, 0,1 % Saponin und 0,1 % Natriumazid enthält) wurden die permeabilisierten Zellen entweder mit FITC-gekennzeichneten („FITC-labeled") Anti-IFN-y-monoklonalem Antikörper oder mit PE-gekennzeichnetem („PE-labeled") anti-IL-4 monoklonalem Antikörper während 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit behandelt. Die Zellen wurden mit Waschpuffer gewaschen und dann wieder in PBS suspendiert, das 1 Paraformaldehyd enthält, für eine Einzelfarben-Durchflusscytometrie-Analyse unter Verwendung von FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) mit dem Programm Cell Quest. Zehntausend Zellen wurden für jede Probe gesammelt und die Fluoreszenz-Intensität wurde auf einer logarithmischen Skala gemessen. Um sicherzustellen, dass nur intrazelluläres IFN-y oder IL-4 nachgewiesen wird, wurden die Zellen vor der Permeabilisierung mit FITC-gekennzeichnetem („FITC-labeled") Anti-IFN-y- oder mit PE-gekennzeichnetem („PE-labeled") anti-IL-4-Antikörper gefärbt und ergaben weniger als 0,2 % fluoreszierende Zellen für jede Einfärbung. Unbedeutsame „isotype-matched" Kontrollantikörper erzeugten ebenfalls nur weniger als 0,1 % fluoreszierende Zellen.
Resultate von Beispiel 9
Resultate von Beispiel 11
Resultate von Beispiel 13
Tabelle 1
Beispiel 19
Resultate der therapeutischen Auswertung der durch die Kombination der Extrakte aus Rinde von M. koenigii und aus Blättern von P. betle zur Behandlung von respiratorischen Beschwerden entwickelten Präparationen. (Durchgeführt von einem registrierten Ayurveda-Praktiker)

Claims

Synergistische pharmazeutische Zusammensetzung zum Einsatz als Leukotrin-Inhibitor, IL4-Synthese-Inhibitor und als Immunmodulator des Typs Th1, wobei die Zusammensetzung wirksame Mengen an lyophilisierten, wässrigen oder alkoholischen Extrakten, die aus den Blättern der Piper betle (PB) und der Murrya koenigii (M.k.) erhältlich sind, oder an bioaktiven Fraktionen JB01A, JB01B, JB01C beziehungsweise MK03, MK04, MK05, die von diesen Extrakten abgeleitet sind, in allen möglichen Kombinationen und wahlweise ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Inhaltsstoffe umfasst, wobei das Verhältnis des PB-Extrakts oder der bioaktiven Fraktionen, die von diesem Extrakt abgeleitet sind, zu dem M.k.-Extrakt oder zu den bioaktiven Fraktionen, die von diesem Extrakt abgeleitet sind, im Bereich 1:1 bis 1:5 liegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die MK03 genannte bioaktive Fraktion die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften aufweist: (a) der getrocknete Feststoff weist einen Schmelzpunkt zwischen 98 und 100 °C auf und ist löslich in DMSO; (b) die Dünnschichtchromatographie zeigt in einem der Lösungsmittelsysteme Chloroform und Methanol (19:1) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,48 auf; (c) die HPLC-Analyse zeigt unter Verwendung der analytischen Säule Intersel ODS-3 und dem Lösungsmittelsystem Methanol einen einzigen Ausschlag mit einer Verzögerungszeit von 8,5 min bei einer Flussrate von 0,5 ml/min auf, wobei der Nachweis bei 210 nm durchgeführt wurde. HPLC: Säule ODS-3 (4,6 × 250 mm), Flussrate 0,5 ml/min; Ausschlag bei 210 nm; Verzögerungszeit 3,5 min; Lösungsmittelsystem Methanol; (d) ¹³CNMR, ppm (125 MH₂, CDCl₃): 153,34, 153,29, 148,94, 140,73, 134,78, 131,58, 128,61, 124,22, 120,36, 119,97, 118,23, 118,02, 117,39, 116,63, 108,36, 104,39, 97,16, 78,03, 40,68, 25,67, 25,60, 22,70, 17,53 und 15,97 und (e) die Fraktion ,MK03' hat den Anschein eine reine stickstoffhaltige Verbindung zu sein, die MK04 genannte bioaktive Fraktion weist die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften auf: (a) dunkel gefärbtes gummiartiges Material, welches in Dimethylsulfoxid löslich ist; (b) die TLC (Dünnschichtchromatographie) des bioaktiven Materials zeigt in dem Lösungsmittelsystem Chloroform und Methanol (19:1) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,38 auf; (c) die HPLC-Analyse zeigt unter Verwendung der analytischen Säule Intersil ODS-3, mit dem Lösungsmittelsystem Methanol, einer Flussrate von 1,0 ml/min und bei einem Nachweis bei 254 nm einen Ausschlag mit einer Verzögerungszeit von 5:69 min auf; (d) NMR (300 MH₂ CDCl₃) δ 0,94, 1,30, 1,60, 2,04–2,10, 2,27–2,34, 2,78–2,82, 3,53–3,81, 3,85–3,92, 4,00, 4,24–4,26, und 5,26–5,41 und (e) die Fraktion MK04 ist ein Glykolipid, wobei die MK05 genannte bioaktive Fraktion die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften aufweist: (a) dunkel gefärbter Feststoff, der in DMSO und in Wasser löslich ist; (b) die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem N-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,66 auf; (c) die HPLC-Analyse dieser Fraktion zeigt mit dem Lösungsmittelsystem Methanol-Wasser (1:9), einer Flussrate von 0,5 ml/min und bei einem Nachweis bei 217 nm einen einzigen Ausschlag bei einer Verzögerungszeit von 21 min auf; (d) ¹³CNMR, ppm (125 MH₂, D₂O): 175,82, 169,22, 159,00, 147,63, 147,02, 144,76, 135,72, 131,28, 131,10, 129,90, 129,63, 129,20, 128,20, 127,59,123,30, 116,81, 116,39, 115,80, 114,79, 81,77, 76,26, 76,15, 74,20, 73,79, 73,64, 73,49, 72,84, 72,16, 71,34, 70,29, 69,89, 68,83, 67,96, 63,71, 63,14, 58,22, 56,62, 56,19, 54,47, 54,42, 54,37, 41,90, 36,87 und 20,93; und (e) die MK05-Fraktion hat den Anschein eine mit Zuckern konjugierte aromatische Verbindung zu sein.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die bioaktive JB01A-Fraktion die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften aufweist (a) weiß gefärbter Feststoff, der sowohl DMSO als auch in Wasser löslich ist; (b) die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,07 auf; (c) die HPLC zeigt mit dem Lösungsmittelsystem Wasser-Methanol (1:9), einer Flussrate von 0,5 ml/min, bei einem Nachweis bei 217 nm und einer analytischen Säule Intersil ODS-3 einen einzigen Ausschlag mit einer Verzögerungszeit von 8,4 min (JB01A, Ausschlag-1) auf; (d) ¹³CNMR, ppm (125 MH₂, D₂O): 109,71, 108,417, 107,94, 104,17, 100,27, 84,38, 81,79, 81,53, 80,74, 77,03, 75,58, 73,85, 73,42, 71,71, 71,27, 70,74, 70,38, 69,12, 61,71, 61,00 und 60,54; und (e) die JB01A-Fraktion ist ein Oligosaccharid; die bioaktive Fraktion JB01B weist die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften auf: (a) weiß gefärbter Feststoff, der das sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist; (b) die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butonol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Ausschlag mit einem Rf von 0,27 auf; (c) die HPLC zeigt unter den genannten Säulenbedingungen einen einzigen Ausschlag mit einer Verzögerungszeit von 8,8 min auf; (d) ¹³CNMR, ppm (125 MH₂, D₂O): 169,48, 104,30, 98,86, 98,55, 92,60, 81,82, 76,98, 76,07, 74,57, 73,52, 73,23, 71,78, 71,46, 70,02, 69,84, 69,74, 69,30, 68,92, 68,77, 67,01, 66,43, 62,95, 62,02, 61,61, 48,67, 44,62, 38,88; und (e) die J01B-Fraktion ist ein Oligosaccharid-Derivat; und die bioaktive Fraktion JB01C weist die folgenden physikalisch chemischen Eigenschaften auf: (a) weißer Feststoff, der sowohl in DMSO als auch in Wasser löslich ist; (b) die TLC zeigt in dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Wasser (9:5:7) einen einzigen Fleck mit einem Rf von 0,34 auf; (c) die HPLC zeigt unter den oben genannten Bedingungen einen einzigen Ausschlag mit einer Verzögerungszeit von 0,8 min auf (JB01C, Peak-3); (d) NMR (300 MH₂, D₂O): 2,34, 3,27, 3,28, 3,44–3,47, 3,51, 3,60–3,63, 3,68, 3,92–3,99, 4,08, 4,92 und 5,36; und (e) die JB01C Fraktion ist ein Oligosaccharid.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der pharmazeutisch verträgliche Inhaltsstoff unter Nährstoffen wie Proteinen, Kohlenhydraten, Zucker, Talg, Magnesiumstearat, Zellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatinepaste und/oder Trägermaterialien, Arzneistoffträgern, Verdünnungsmitteln oder Lösungsmitteln ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die besagte Zusammensetzung durch Inhalation, oral, intravenös intramuskulär, subkutan oder auf andere Art und Weise verabreicht wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die orale Verabreichung in Form von Kapseln, Sirup, Konzentrat, Puder oder Körnchen erfolgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die intravenös verabreichte Menge geringer ist als diejenige der oralen Verabreichung.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche mit einem Dosierungsgrad zwischen 1 bis 20 mg/kg des Körpergewichtes wenigstens einmal am Tag über eine Dauer von wenigstens vier Wochen verabreicht wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung aus bioaktiven Fraktionen MK03, MK04 und/oder MK05 besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung aus bioaktiven Fraktionen JB01C, MK03, MK04 und/oder MK05 besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Menge der intravenös verabreichten bioaktiven Fraktionen geringer ist als diejenige der oralen Verabreichung.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Anteil an bioaktiven Fraktionen der M.k. gleich oder größer ist als derjenige der bioaktiven Fraktion der (PB) Piper betle.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung mit einem Dosierungsgrad zwischen 0,5 bis 10,0 mg/kg des Körpergewichts wenigstens einmal am Tag über eine Dauer von vier Wochen hinweg in Abhängigkeit der Atmungsbedingungen verabreicht wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung über eine Dauer von wenigstens vier Wochen bis zu drei Monaten verabreicht wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Kombination der bioaktiven Fraktionen MK03, MK04 und MK05, die von den Blättern oder anderen Pflanzenteilen der Murrya koenigi zum Blockieren der 5-Lipooxygenase-Aktivität erhalten wurde, zur Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 und zum Immunmodulator des Typs Th1 führt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Kombination der bioaktiven Fraktionen MK03, MK04 und MK05, die aus Blättern oder anderen Pflanzenteilen der Murryae koenigi (M.k.) erhalten wurden, und JB01C, das aus den Blättern oder anderen Pflanzenteilen des Piper betle stammt, zum Blockieren der 5-Lipooxygenase-Aktivität, zur Inhibierung der Leukotrien-Synthese, zur Unterdrückung der Erzeugung von Interleukin-4 und zur Steigerung der Abgabe von Gamma Interferon führt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zur Behandlung bronchialer Atemzustände verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zur Behandlung von Säugetieren und Tieren verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zum Verschieben der Th2-Reaktion zur Th1-Reaktion verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zur Inhibierung der durch 5-Lipooxgenase vermittelten Oxidation der Arachidonsäure in mit Neutrophilen angereicherten Bestandteilen des Vollblutes verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zur Steigerung der IFN-Gamma-Reaktion und zur Herabsetzung der IL-4-Reaktion im Vollblut ex-vivo verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zur Steigerung IFN-Gamma-Reaktion im einkernigen menschlichen Vollblut ex-vivo verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei diese zur Herabsetzung der IL-4-Reaktion in peripheren einkernigen Zellen des menschlichen Vollblutes verwendet wird.