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Technischer Bereich
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Extraktion
pharmazeutisch wirksamer Produkte aus Spermatophytenpflanzen, auf
Produkte, die entsprechend daraus erhalten werden und auf deren Verwendung
im medizinischen Bereich, insbesondere als Substanzen mit immunmodulierender
Wirkung.
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Im
Besonderen bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der immunmodulierenden
Wirkung von cis- oder trans- Resveratrol (unten jeweils angegeben
als C-Res und T-Res) und von hydroxylierten Stilbenen, Oligostilbenen
und Stilbenoiden sowohl in freien als auch glukosidierten Formen
im pharmazeutischen Bereich.
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Stand der
Technik
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Das
Immunsystem schützt
den Organismus vor Angriffen zahlreicher pathogener Agenzien, wie
beispielsweise Viren, Bakterien, Mykoplasmen, Pilzen und Protozoen,
vor Fremdsubstanzen und vor der Entwicklung von Krebszellen dank
der humoralen Faktoren und Zellfaktoren. Allerdings spielen Immunreaktionen
nicht immer eine positive Rolle, da sie auch Hypersensitivitäts- und
Autoimmunreaktionen auslösen
können.
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In
den letzten Jahren haben eine Reihe von wissenschaftlichen Untersuchungen
Möglichkeiten
aufgezeigt, wie Immunreaktionen beeinflusst und kontrolliert werden
können.
Gegenwärtig
wird das Immunsystem zur Behandlung oder Prävention zahlreicher Krankheiten
entsprechend stimuliert oder supprimiert. Immunmodulatoren sind
Verbindungen, die die Immunfunktionen beeinflussen, welche sich
positiv oder negativ auf die Wirkung des Immunsystems auswirken
können.
Genannte Medikamentenklasse umfasst chemische Verbindungen, wie
beispielsweise organische Verbindungen, Substanzen biologischen
Ursprungs oder Moleküle
natürlichen
Ursprungs.
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In
der medizinischen Praxis beinhaltet die Verwendung von Immunmodulatoren
sowohl die Stimulation oder Rekonstitution der Immunantwort (Korrektur
des Immundefekts) und die Suppression der normalen oder übermäßigen Immunreaktion.
Die Stimulation des Immunsystems ist wichtig, um beispielsweise
einen Patienten vor einem Tumor zu schützen oder die Immunantwort
eines Patienten mit einem defekten Immunsystem zu verstärken, wie
etwa bei Patienten mit chirurgischen Eingriffen und Verbrennungen,
Patienten, die sich einer Strahlen- oder Chemotherapie unterziehen
und AIDS-Patienten. Im Allgemeinen können diese Immunmangel-Patienten
Virusinfektionen, wie beispielsweise mit Zytomegalievirus, Herpesvirus,
Syncytial Respiratory Virus und Hepatitisvirus entwickeln. Immunmodulatoren
können
zur Stimulation der Immunantwort gegenüber den genannten Infektionen
oder als Prophylaxeagenzien zur Präventionen solcher Infekte verwendet
werden. Darüber
hinaus besteht die Möglichkeit,
die genannten Substanzen auch zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten
einzusetzen.
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Einer
der Hauptmechanismen bei der Immunantwort besteht in der Produktion
von Zytokinen durch die T-Lymphozyten. Es handelt sich dabei um
eine Gruppe von Polypeptiden mit hormonähnlicher Wirkung, die die Funktion
zahlreicher Zellarten beeinflussen. Jüngste wissenschaftliche Untersuchungen
haben gezeigt, dass die Produktion von Zytokinen durch CD4 positive
T-Zellen (CD4+) und CD8+ T-Zellen oftmals einem der beiden Phänotypen
TH1 oder TH2 zuzuschreiben ist. TH1-Zellen produzieren Interleukin
2 (IL2), Interferon-g (IFN-g)
und Tumornekrosefaktor (TFN) und sind hauptsächlich für die zellvermittelte Immunität, wie beispielsweise
verspätet
einsetzende Hypersensitivität,
verantwortlich. TH2-Zellen produzieren andere Typen von Interleukinen
wie IL4, IL5, IL6, IL9, IL10 und IL13 und sind hauptsächlich verantwortlich
für die
Regulation der Tumorimmunität.
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Stark
polarisierte TH1- und TH2-Reaktionen spielen über den Schutz des Organismus
vor infektiösen Agenzien
oder Tumorzellen hinaus eine bedeutende Rolle bei der Auslösung zahlreicher
Pathologien, wie beispielsweise bei der organspezifischen Autoimmunität und manchen
Typen chronischer Entzündungen
sofern diese in den Bereich der TH1-Reaktion fallen, allergischem
Asthma und atopischer Dermatitis sofern diese durch TH2-Reaktionen beeinflusst
werden. Die beiden Reaktionstypen stehen jedenfalls miteinander
im Zusammenhang, da die Stimulation der TH1-Reaktion in den meisten
Fällen
eine Hemmung der Produktion der TH2-Zytokine induziert und umgekehrt.
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Es
ist daher offensichtlich, dass der Veränderung der Zytokinproduktion
durch die T-Zellen eine fundamentale Bedeutung bei der Kontrolle
zahlreicher Krankheiten zukommt, und dass Substanzen, die die genannte
Produktion beeinflussen, eine entscheidende immunopharmakologische
und therapeutische Wirkung haben können.
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Hydroxylierte
Stilbene, sowohl Monomere als auch Oligomere, repräsentieren
eine Klasse chemischer Verbindungen, die nur in wenigen Spermatophyten
vorkommen und zwar insbesondere in Wein, wobei die wichtigen Verbindungen
hier im Ansatz der Blattstiele und hauptsächlich in den Trauben zu finden
sind (Vrhovsek U, Mattivi F, 1998, Proceedings of the 29th J. Plecnik, Cardiovascular Diseases, 449–463; Mattivi
F et al., 1995, J Agric Food Chem, 42, 1820–1823). Da ihre Rolle in der
Pflanzenphysiologie scheinbar größtenteils
in der Hemmung der Progression von durch Pilze verursachten Infektionen
beruht, wird diese Substanzgruppe den Phytoalexinen zugeordnet,
einer Klasse von Antibiotika pflanzlichen Ursprungs (Hain R et al,
1990, Plant Mol Biol, 15, 325–335).
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Die
Ergebnisse einer Reihe von Untersuchungen, die von mehreren Forschergruppen
durchgeführt wurden,
deuten darauf hin, dass eine der zur Klasse der Stilbene gehörende Verbindung,
trans-Resveratrol, eine pharmakologische Wirkung beim Menschen ausüben kann.
Tatsächlich
haben diese Untersuchungen gezeigt, dass trans-Resveratrol antioxidative
Eigenschaften besitzt (Fauconneau B et al, 1997, Life Sci, 61, 2103–2110),
die Blutplättchenaggregation
hemmt (Bertelli A et al, 1996, Drug Exp Clin Res, 22, 61–63) und Cyclooxygenase-Aktivität aufweist
(Jang M et al, 1997, Science, 275, 218–220). Darüber hinaus wurde nachgewiesen,
dass die genannte Verbindung in vitro das Wachstum von Zellen der
Zelllinie MCF-7 aus Brustdrüsen-Adenokarzinomen
hemmt (Mgbonyebi O P et al, 1998, Int J Oncology, 12, 865–869) und
in Zellen, die zur Linie HL60 (humane promyelocytische akute Leukämie) gehören, die
Unterbrechung des Zellzyklus beim Übergang von Phase S zu Phase
G2 hervorruft (Delia Ragione F et al, 1998, Biochem Biophys Res
Com, 250, 53–58)
sowie in hohen Dosen Apoptose induzieren und die Expression von
CD95L regulieren kann (Clement MV et al, 1998, Blood, 92, 996–1002).
Schließlich
konnte in vivo in einem Mäusemodell
bewiesen werden, dass trans-Resveratrol dazu in der Lage ist, die
Tumorgenese bei durch karzinogene Substanzen verursachtem Hautkrebs
zu hemmen (Jang M et al, 1997, Science, 275, 218–220). Während unserer Forschungen haben
wir überraschenderweise
herausgefunden, dass zusätzlich
zur bereits zuvor erwähnten
Aktivität,
trans- und cis-Resveratrol sowohl die Reaktion der natürlichen
Killerzellen (NK) als auch die Antigen spezifische zytotoxische
lymphozytäre
Reaktion (CTL = cytotoxic lymphocytic response of T lymphocytes)
verändern
können. Wir
haben weiterhin herausgefunden, dass die oben erwähnten Substanzen
die Produktion der Zytokine durch die CD4+ und CD8+ T-Zellen beeinflussen.
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Darstellung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert daher auf den Befunden, dass hydroxylierte
Stilbene, insbesondere cis- und trans-Resveratrol, die humanen T-Lymphozyten, die
die Wirkung hervorrufen, verändern
und somit als Arzneimittelwirkstoffe zur Beeinflussung der Reaktion
des Immunsystems in zahlreichen Krankheitssituationen verwendet
werden können,
wie beispielsweise bei i) primärem
Immunmangel bei Kindern und Erwachsenen; ii) sekundärem Immunmangel
verursacht beispielsweise durch Unterernährung, lymphoproliferative
Krankheiten, Infektionen (induziert durch Viren, Bakterien, Pilze,
Tierparasiten), chirurgische Interventionen, Strahlen- oder Chemotherapie,
Medikamentenverabreichung, Verbrennungen und nephrotisches Syndrom;
iii) Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis,
Uveitis, Psoriasis; iiii) Transplantatabstoßung.
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Weiterer
Gegenstand sind die Produkte aus dem Extraktionsverfahren, welche
im pharmazeutischen Bereich verwendet werden; genannte Produkte
bestehen aus komplexen Mischungen umfassend Verbindungen, die eine
oder mehrere Stilbengruppen in ihrem Molekül enthalten, in unterschiedlich
hydroxylierter und/oder glukosidierter Form, und Verbindungen, die
daraus durch natürliche
enzymatische biosynthetische Verfahren entstehen (Oligostilbene
sind definiert als diejenigen Oligomere, welche mindestens eine
noch erkennbare Stilbenbindung in ihrem Molekül haben und Stilbenoide sind
diejenigen Oligomere, bei denen alle Stilben-Doppelbindungen am
Kondensationsprozess beteiligt sind). Die folgenden Verbindungen
werden, wie folgt, bevorzugt:
Ein Gegenstand der Erfindung
ist die Verwendung der Verbindungen T-Res, C-Res, glukosidiertes C-Res, ∊-Viniferin,
H-Gnetin, r-2-Viniferin, r-Viniferin, Hopeaphenol, Ampelopepsin
A und glukosidiertes T-Res, insbesondere als Wirkstoffe mit immunmodulierender
Aktivität,
spezifischer noch als 1) Immunmodulatoren, die bei zahlreichen Krankheiten
verwendet werden, wie beispielsweise i) primärem Immunmangel bei Kindern
und Erwachsenen; ii) sekundärem
Immunmangel, verursacht zum Beispiel durch Unterernährung, lymphoproliferative
Erkrankungen, Infektionen (hervorgerufen durch Viren, Bakterien,
Pilze, Tierparasiten), chirurgische Interventionen, Strahlen- oder
Chemotherapie, Medikamentenverabreichung, Verbrennungen und nephrotisches Syndrom;
2)
Immunosuppressiva, die bei Krankheiten verwendet werden, wie beispielsweise
i) Autoimmunkrankheiten (zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Uveitis,
Psoriasis); ii) Transplantatabstoßung.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
der Verbindungen, welche durch Extraktion in verschiedenen Konzentrationen
erhalten wurden, entsprechend ihrer immunstimulierenden und immundepressiven
Wirkung.
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Kurzbeschreibung
der Abbildungen
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1A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Produktion von Zytokinen durch
CD8+/IFN+ T-Zellen aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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1B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Produktion von Zytokinen durch
CD8+/IL2+ T-Zellen aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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1C zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Produktion von Zytokinen durch
CD8+/IL4+ T-Zellen aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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2A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Produktion von Zytokinen durch
CD4+/IFN+ T-Zellen aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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2B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Produktion von Zytokinen durch
CD4+/IL2+ T-Zellen aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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2C zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Produktion von Zytokinen durch
CD4+/IL4+ T-Zellen aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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3A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Vermehrung von Lymphozyten aktiviert
mit anti-CD3/CD28.
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3B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die DNA-Synthese von Lymphozyten
aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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4A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Induktion der Apoptose in Lymphozyten
aktiviert mit anti-CD3/CD28.
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4B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Mortalität von Lymphozyten aktiviert
mit anti-CD3/CD28.
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5A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK).
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5B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Expression der Oberflächenantigene
CD16 und CD95 in humanen Lymphozyten.
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5C zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Expression von Oberflächenantigenen
CD4 und CD95 in humanen Lymphozyten.
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6A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die zytotoxische Aktivität der T-Lymphozyten.
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6B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf die Reifung von T-Lymphozyten.
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7A zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf den Prozentsatz von CD8+ Zellen.
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7B zeigt
die Wirkung von Resveratrol auf den Prozentsatz von CD4+ Zellen.
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8 zeigt
ein mit Reversed-Phase HPLC aufgezeichnetes Chromatogramm der komplexen
Mischung von Stilbenen, Oligostilbenen und Stilbenoiden extrahiert
aus Vitis-Wurzeln: trans-Stilbene und trans-Oligostilbenen werden bei 320 nm, cis-Stilbene
und Stilbenoids bei 282 nm detektiert.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen können grob
in zwei Gruppen eingeteilt werden: die erste Gruppe besteht aus
Stilbenen und Oligostilbenen, die zweite aus Stilbenoiden. Die erste
beinhaltet Moleküle
gekennzeichnet durch das Vorhandensein einer oder mehrerer Stilbengruppen [(C
6H
5)-CH=CH-(C
6H
5)], die in unterschiedlicher
Form hydroxyliert und/oder glukosidiert sind. Die folgenden Verbindungen,
als den Erfindungsgedanken nicht einschränkendes Beispiel, gehören zur
genannten ersten Gruppe:
(alternativ
zu Position 3 kann sich die glukosidische Bindung auch in Position
4' befinden und
in unterschiedlichen T-Res und C-Res resultieren, unterschiedlich
monoglukosidiert, oder T-Res und C-Res mit mehr als einer glukosidischen
Gruppe).
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Die
zweite Gruppe, diejenige die die Stilbenoide beinhaltet, umfasst
Verbindungen, welche, wie die zuvor genannten, als Stilbenoligomere
klassifiziert werden können,
aber in welchen die ursprüngliche
Stilbenstruktur nicht mehr erkennbar ist, da alle Stilben-Doppelbindungen
durch natürliche
enzymatische Biosyntheseabläufe
innerhalb der pflanzlichen Produkte, aus denen sie extrahiert wurden,
verändert
werden.
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Als
den Erfindungsgedanken nicht einschränkendes Beispiel können die
folgenden Verbindungen erwähnt
werden:
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Ampelopepsin
A wird als ein oxidatives Dimer von T-Res angesehen.
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Hopeaphenol
ist das entsprechende Tetramer, d.h. ein Dimer von Dimeren, welche über zwei
C8 Positionen miteinander verbunden sind.
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Die
zu den beiden Gruppen gehörenden
Verbindungen können
mittels Extraktions- und Reinigungsverfahren aus den natürlichen
Produkten, in denen sie enthalten sind, gewonnen werden, wie beispielsweise aus
Früchten
(Bsp. Trauben), überirdischen
Teilen (Stamm, Schösslinge,
Blätter)
oder unterirdischen Teilen von Spermatophytenpflanzen, insbesondere
denjenigen, die zur Familie der Vitaceae oder Polygonaceae gehören. Die
in der Erde vorkommenden Teile solcher Pflanzen werden hierbei besonders
bevorzugt.
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Extraktions-
und Reinigungsverfahren folgen den unten angegebenen Methoden. Es
gilt zu beachten, dass es sich bei den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Mischungen um komplexe Mischungen handelt, in denen bislang
nur die Hauptkomponenten identifiziert wurden (Stilbene, Oligostilbene
und Stilbenoide, wie oben angegeben):
allerdings sind diese
Produkte nur stellvertretend für
andere ähnliche
Verbindungen anzusehen, welche in kleineren Mengen vorliegen und
noch nicht isoliert und charakterisiert sind, obwohl sie die gleiche
Natur und Charakteristika für
die Anwendung aufweisen; diese Produkte sind auch Teil der vorliegenden
Erfindung, obwohl nicht isoliert und charakterisiert, da sie in
natürlichen
Extrakten vorkommen.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die immunmodulierende Wirkung,
die durch diese Verbindungen ausgeübt wird, sowohl durch die einzelne
Substanz selbst als auch in Mischungen.
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Das
erfindungsgemäße Extraktionsverfahren
wird bei Spermatophytenpflanzen angewendet. Als Ausgangsmaterial
können
Früchte, überirdische
und unterirdische Pflanzenteile genommen werden. Das Ausgangsmaterial
kann frisch oder gefroren oder lyophilisiert und pulverisiert sein.
Als die wichtigsten Matrizes werden die Wurzeln von Polygonum cuspidatum
und Polygonum multiflorum sowie die Rinde der lignifizierten Wurzel
der Gattung Vitis angesehen.
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Bevorzugt
werden Materialien verarbeitet, die so trocken wie möglich sind,
sodass es vorteilhaft sein kann, das genannte zu extrahierende Material
einer Vorbehandlung einschließlich
der kalten Entfernung von Wasser, zum Beispiel durch Lyophilisation,
zu unterziehen. Ausgeführt
wird die Extraktion in einer neutralen Umgebung mit aliphatischem
Alkohol, vorzugsweise Methanol oder Ethanol und Mischungen daraus,
wobei vorzugsweise Lösungsmittelmengen
zwischen dem 10- bis 20-fachen des Volumens bezogen auf das Gewicht der
zu extrahierenden Matrix genommen werden. Das zu extrahierende Material
und das Lösungsmittel
werden gemischt, das Ganze gerührt
und in einer sauerstofffreien Atmosphäre extrahiert, zum Beispiel
gesättigt mit
Stickstoff, und lichtgeschützt
bei Raumtemperatur über
eine Extraktionsdauer, die entsprechend der Matrix variiert, im
Allgemeinen zwischen 2–12
Stunden für
unbehandelte Matrizes und etwa 5–120 Minuten für Matrizes,
die zuvor lyophilisiert und dann das lyophilisierte Produkt durch
Vermahlen pulverisiert wurde. Der erhaltene Endextrakt wird zentrifugiert
und die überstehende
Flüssigkeit
weiter verwendet, wobei zuletzt genannte unter Vakuum bei niedrigen
Temperaturen (unter 45°C)
aufkonzentriert und mit Ethylacetat oder einem anderen ähnlichen
Lösungsmittel
wie beispielsweise Methylacetat und/oder Tetrahydrofuran (Rohextrakt
in Lösungsmittel)
oder mit Wasser (wässriger Rohextrakt)
(insbesondere Polygonum-Wurzeln, um so einen höheren Reinheitsgrad zu erhalten)
aufgenommen wird.
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Der
Rohextrakt kann entsprechend einer der beiden Methoden behandelt
werden, abhängig
davon, ob eine Mischung, die im wesentlichen die erfindungsgemäßen Produkte
oder nur trans-Resveratrol und glukosidiertes trans-Resveratrol
enthalten soll.
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Die
erste Behandlungsart (Behandlung A) wird bevorzugt, wenn die Extraktion
mit Pflanzen der Gattung Vitis durchgeführt wird, während mit Präferenz die
zweite Behandlungsart (Behandlung B) für die einfachere Matrix bei
Pflanzen der Gattung Polygonaceae verwendet wird.
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Behandlung
(A) Der Rohextrakt in einem Lösungsmittel,
wie beispielsweise Ethylacetat wird mit Wasser, gesättigt mit
einem anorganischen Salz (beispielsweise NaCl), gewaschen, die Fraktion
in Ethylacetat dann auf eine mit Harz eines aromatischen Polymers
(Stiren-divinylbenzol-Copolymere, vorzugsweise mit einer Porengröße zwischen
0,1 und 0,25 mm, da diese zu diesem Zweck besonders gut geeignet
sind) gefüllte Säule geladen.
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Nach
dem Beladen wird zuerst mit Wasser eluiert, vorzugsweise mit einem
Volumen, das etwa dem doppelten Volumen von Ethylacetat entspricht,
dann mit Pentan-methylenchlorid 2:1 (mit einem Volumen, das etwa
dem Volumen von Ethylacetat entspricht). Stilbene werden mit Ethylacetat
oder mit geeigneten Mischungen an organischen Lösungsmitteln mit mittlerer
Polarität
eluiert, deren Elutionsstärke
derjenigen von XAD-2 entspricht; diese Abkürzung ist den Experten auf
diesem Gebiet bekannt. XAD-2 ist eine besondere Art von Stiren-divinylbenzolharz
dahingehend, dass seine die relative Elutionsstärke betreffenden Faktoren in
der wissenschaftlichen Literatur tabellarisch aufgelistet sind (siehe
z.B. Robinson J. L. et al., J. Chromatogr., 1980, 185, 145), wie
zum Beispiel für
Tetrahydrofuran und Methylenchlorid. Das Volumen von Ethylacetat
wird so gewählt,
dass die quantitative Gewinnung der gesamten Klasse (wie in 14) sichergestellt ist und variiert entsprechend
der Form und dem freien Säulenvolumen.
Das Produkt dieser selektiven Elution besteht aus einer gereinigten
Fraktion enthaltend die Gesamtklasse an Viniferin zusammen mit Oligostilbenen
und Stilbenoiden.
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Die
Grundbestandteile, aufgrund derer diese Fraktion pharmakologisch
interessant ist, sind die Oligomere von Resveratrol mit besonderer
Beachtung von Dimeren, Trimeren und Tetrameren, und zwar sowohl derjenigen,
die noch eine Stilben-Doppelbindung in trans- oder cis-Form (Oligostilbene)
besitzen und derjenigen, welche ihre Stilbenstruktur während der
natürlichen
Polymerisation (Stilbenoide) verloren haben. Die gleiche Fraktion
enthält
auch glukosidiertes trans-Resveratrol.
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Wenn
die folgenden reinen Verbindungen erhalten werden sollen: Epsilon-Viniferin, alfa-Viniferin, H-Gnetin
(welches auch aus dem Holz von Welwitschia mirabilis isoliert werden
kann), r-Viniferin, Ampelopepsin A (welches auch aus den Wurzeln
von Ampelopsis brevipedunculata isoliert werden kann) und Hopeaphenol,
muss eine High-Performance Flüssigkeitschromatographie über Reversed-Phase
Säulen
durchgeführt werden.
Verwendet werden können
Phasen basierend auf Silica mit den funktionellen Gruppen C18 oder
C8 (Begriffe, die den Experten auf diesem Gebiet bekannt sind) oder
Stirenpolymere, die zuletzt genannten allerdings nur mit Niederdruck.
Ein praktisches Beispiel (ideal für die Trennung von Epsilon-Viniferin, H-Gnetin
und r-Viniferin) ist die Verwendung von gepackten Säulen mit
einem Festphasen-RP-18-Material, beispielsweise LiChrospher 100
oder ähnliches,
10 Mikrometer Partikelgröße, Elution
mit einem linearen Gradienten aus Wasser und Acetonitril, das letztere
mit einem Anteil von 30 bis 50%. Den Experten auf diesem Gebiet
ist die Einstellung der Trennbedingungen für diese Art von Mischungen
bekannt.
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Eine
quantitative Analyse der Mischung von Stilbenen, Oligostilbenen
und Stilbenoiden erhalten mit der erfindungsgemäßen Extraktion kann im Allgemeinen über Reversed-Phase
High-Performance Flüssigkeitschromatographie
(oder mit anderen Trenntechniken in Flüssigphase wie etwa Elektrophorese,
Dünnschichtchromatographie
(TLC = Thin Layer Chromatography) mit UV-Detektion, MS (Massenspektrometrie) oder
Fluoreszenzdetektor durchgeführt
werden. Die ersten beiden Techniken werden bevorzugt, da sie eine zuverlässige Identifizierung
erlauben. Ein Beispiel für
optimierte Bedingungen findet sich in Beispiel 8.
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Behandlung B
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Behandlung
B besteht aus den folgenden Alternativen:
- – wenn beide,
lipophile und hydrophile Verbindungen aus dem Endextrakt eliminiert
werden müssen,
wird der wässrige
Rohextrakt mit Methylenchlorid oder einem anderen Lösungsmittel
mit ähnlicher
Polarität,
wie beispielsweise Chloroform, gewaschen, um lipophile Produkte,
aber nicht Stilbene zu entfernen und dann nochmals extrahiert in
Ethylacetat (zum Beispiel fünfmal
mit einem Verhältnis
Extrakt/Extraktionsvolumen von 1/1, reduzierbar im Fall höherer Extraktionsvolumina
oder über
Veränderung
der Ionenstärke
des Extrakts), um Stilbene zu gewinnen, während die hydrophilen Bestandteile
in dem Wasseranteil verbleiben, der verworfen wird.
- – wenn
nur glukosidierte Derivate aus dem Endextrakt erhalten werden sollen,
können
diese selektiv aus dem Rohextrakt in einem Lösungsmittel wie etwa Ethylacetat
mit einem nicht polaren Lösungsmittel
(Hexan wäre
ideal in einem Verhältnis
3/1 bezogen auf Ethylacetat) kalt-präzipitiert und durch Filtration
gewonnen werden. Alternativ kann die gesamte Fraktion verwendet
werden, um auch trans-Resveratrol zu erhalten.
- – wenn
eine ziemlich genaue Trennung der Mischung erhalten werden soll,
ist es möglich
mit dem Rohextrakt in einem Lösungsmittel
wie Ethylacetat, welches komplett wasserfrei sein sollte, zu beginnen.
Genannter Rohextrakt, vorzugsweise reduziert bis auf das Minimalvolumen,
wird in die Aufgabevorrichtung auf eine präparative Silica-Chromatographiesäule (zum
Beispiel Kieselgel 0,05–0,20
mm) aufgegeben, letztere gepackt in einem nicht polaren Lösungsmittel
(zum Beispiel Hexan). Ein geeignetes Volumen an Chloroform wird über der
Säule belassen.
Die Behandlung sieht zwei nacheinander folgende Wasch- und Elutionsequenzen
mit Mischungen von steigender Elutionsstärke vor, Chloroform-Methanol,
I (20:1); II (10:1); III (5:1); IV (2,5:1). Mit geeigneten binären und
ternären
Mischungen von Lösungsmitteln
mit mäßiger Polarität (beispielsweise
chlorhaltige Lösungsmittel,
Diethylester, Tetrahydrofuran) und starken Lösungsmitteln (beispielsweise
aliphatische Alkohole, Acetonitril) ist es üblicherweise möglich ähnliche
Trennergebnisse unter Verwendung von Mischungen zu erhalten, die
an einer Stelle in der Elutionsreihe stehen, die ganz ähnlich den
oben angegebenen sind, wie es den Experten auf diesem Gebiet bekannt
ist. Diese Trennung ermöglicht
die unversehrte Gewinnung Stilben-aktiver Agenzien, separiert von
allen wichtigen Interferenzsubstanzen, wodurch zwei Präparationen
mit hoher Reinheit gewonnen werden: Fraktion IV enthält zwei
verschiedene monoglukosidierte Derivate von tans-Resveratrol, gesammelt
in der gleichen Fraktion und Fraktion II enthält freies trans-Resveratrol.
Die hier beschriebenen Bedingungen beziehen sich insbesondere auch
die Wurzelextrakte von Polygonum cuspidatum und können mit
einem ähnlichen
Verfahren für
Polygonum multiflorum angepasst werden, welches – wie bekannt ist – auch andere
Arten von glukosidierten Stilbenen enthält (2,3,5,4'-tetrahydroystilbene-2-glucoside,
Yong et al., 2,2-diphenyl-1-picriylhydrazyl radical-scavenging active
components from polygonum multiflorum Thunb., J. Agr. Food Chem.,
1999, 47, 226–2228).
Falls es erforderlich ist, bis auf die molekulare Ebene vorzudringen,
werden Reinigungstechniken mithilfe präparativer Chromatographie verwendet
mit den Bedingungen wie von Mattivi et al., Isolation, characterization
and evolution in red wine vinification of resveratrol monomers,
J. Agr. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820–1823 beschrieben.
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Eine
quantitative Analyse von Resveratrolen kann gemäß Beispiel 8 durchgeführt werden.
Die für
die quantitative Analyse beschriebenen Techniken sind besonders
angezeigt beispielsweise, um zu evaluieren, ob das gewünschte aktive
Agens im Kulturmedium enthalten ist und somit auch zur Unterstützung von
experimentellen In-vitro-Modellen.
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Trans-cis Isomerisation
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Eine
Angabe zu erfindungsgemäßen Isomerisationstechniken
findet sich in Beispiel 7.
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Therapeutische Aktivität
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Die
wichtigste Funktion des Immunsystems besteht darin, den Organismus
vor Krankheiten zu schützen.
Um diese Aufgabe zu erfüllen,
hat das Immunsystem im Laufe der Evolution verschiedene Effektor-bildende
Mechanismen entwickelt, die sowohl humoral als auch zellvermittelte
Reaktionen hervorrufen. Jeder einzelne dieser Reaktionsmechanismen,
weist einzigartige Charakteristika auf hinsichtlich seiner Fähigkeit,
die Progressionsgeschwindigkeit zu beeinflussen oder die Eliminierung
pathogener Mikroorganismen oder Tumorzellen zu fördern. Genannte Reihe von Mechanismen
ist absolut notwendig, da nicht eine Reaktion allein alle Arten
von Krankheitszuständen
bewältigen
kann. Darüber
hinaus sollte eine Effektor-bildende Reaktion selektiv am Zielorgan
angreifen und dazu in der Lage sein, die Entwicklung nicht spezifischer
Typen der Immunantwort zu hemmen, um das Risiko pathogener Folgen
zu verringern.
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Im
Rahmen der zellvermittelten Reaktion können zwei Zellkompartimente
unterschieden werden: Das erste betrifft Makrophagen und natürliche Killerzellen
(NK) und stellt die natürliche
Abwehr unabhängig
vom antigenen Stimulus dar. Das zweite steht mit der erworbenen
Abwehr in Verbindung und betrifft zytotoxische T-Lymphozyten (CTL
= cytotoxic T lymphocytes). Die Reaktion ist ausschließlich auf
die Antigenerkennung in Verbindung mit dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex (HLA) ausgerichtet.
T-Lymphozyten spielen dank ihrer Fähigkeit, verschiedene Typen
von Zytokinen als Reaktion auf eine Vielzahl von aktivierenden Stimuli
zu produzieren, eine zentrale Rolle bei der Entwicklung einer zielgerichteten
Reaktion durch das Immunsystem.
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Daher
können
pharmakologische Interventionen, die das Immunsystem verändern, indem
sie sowohl direkt die Effektor-bildenden Reaktionen kontrollieren
als auch Synthese und Sekretion der Zytokine durch die T-Zellen
regulieren, einen direkten quantitativen und qualitativen Einfluss
auf die Immunantwort haben.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt eine Methode zur Beeinflussung
der Effektor-bildenden Aktivität von
Zellen des Immunsystems und insbesondere der Aktivität der natürlichen
Killerzellen (NK) und der Antigen-spezifischen zytotoxischen Aktivität von T-Lymphozyten
und der Zytokinproduktion der Typen TH1 und TH2 durch aktivierte
CD8+ und CD4+ T-Zellen mithilfe der erfindungsgemäßen Verbindungen,
insbesondere Resveratrol. Die Effekte des beschriebenen erfindungsgemäßen Immunomodulators
bezüglich
der oben erwähnten
funktionellen Parameter des Immunsystems variieren mit der Dosierung
der verabreichten Substanz (immunstimulierende Wirkung bei niedrigen
Dosen und immunsuppressive Wirkung bei höheren Dosen). Daher können die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sowohl als Immunstimulanzien zur Stärkung der Immunreaktion bei
primärem
oder sekundärem
Immunmangel, wie er bei Patienten auftritt, die an Tumoren, AIDS,
vitalen und bakteriellen Infektionen leiden oder bei alten Patienten
als auch als Immunosuppressiva bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten
oder im Allgemeinen zur Hemmung unerwünschter Immunreaktionen bei Asthma
oder Transplantatabstoßung
eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäß beschriebenen
Immunmodulatoren können
in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven therapeutischen
Agenzien, wie beispielsweise Anti-Tumor-Verbindungen (Antimetaboliten, interkalierende
Agenzien, Mitoseinhibitoren oder andere zytotoxische Inhibitoren
(zum Beispiel Platinkomplexe, Vinka-Alkaloide, Surrogate für Harnstoff,
L-Asparaginase, kortikoadrenale Inhibitoren) verwendet werden. Für die Therapie
können
Extrakte als solche verwendet werden, d.h. die einzelnen Verbindungen
sowohl in natürlicher
Form (isoliert aus den Matrizes pflanzlichen Ursprungs) als auch
chemisch synthetisiert. Das aktive Agens kann in Form von pharmazeutisch
akzeptablem Salz, Ester, Amid, Prodrug oder ähnlichem oder Kombinationen
daraus verabreicht werden. Salze, Ester, Amide, Prodrugs oder ähnliche
Formen der aktiven Agenzien können
durch Befolgung der Standardverfahren der organischen synthetischen
Chemie hergestellt werden.
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Basierend
auf dem gewählten
Verabreichungsweg kann die pharmazeutische Formulierung in Form von
Tabletten, Suppositorien, Pillen, Kapseln, Pulvern, Flüssigkeiten,
Suspensionen, Cremes, Salben, Lotionen oder Ähnlichem gegeben werden. Die
Verbindungen werden deshalb eine wirksame Menge an Agens in Kombination
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff beinhalten und ebenso
weitere pharmakologische Agenzien, wie Adjuvantien, Verdünner, Puffer
usw. Die Verbindungen können
dann oral, parenteral (subkutan, intravenös, intramuskuläre Injektion),
transdermal, rektal, über
Nase und Mund, topisch oder über ein
Implantat mit kontrollierter Freisetzung verabreicht werden.
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Die
Menge an aktiver Verbindung, die verabreicht werden soll, wird abhängig sein
von der speziellen Erkrankung (oder Erkrankungen), an welcher der
zu behandelnde Patient leidet, vom Gewicht und Alter des Patienten,
dem gewählten
Verabreichungsweg und der Meinung des Arztes.
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In
der erfindungsgemäßen Methode
für die
immunmodulierende Wirkung wird der Behandlungsplan die Verabreichung
des Wirkstoffes in Dosierungen zwischen 0,0001 und 20 mg/kg/Tag
vorsehen.
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Die
klinische Verabreichung der Verbindungen wird sich auf die Prävention
und Therapie der Krankheiten beziehen, zu deren Heilung es der Stimulation
der Immunreaktion oder deren Hemmung bedarf. Verwendet werden können die
Verbindungen hierbei als: 1) Immunmodulatoren bei Krankheitszuständen wie
beispielsweise i) primärem
Immunmangel bei Kindern und Erwachsenen; ii) sekundärem Immunmangel
verursacht durch beispielsweise Unterernährung, lymphoproliferative
Erkrankungen, Infektionen (wie solche durch Viren, Bakterien, Pilze,
Tierparasiten), chirurgischen Interventionen, Strahlen- oder Chemotherapie,
Medikamenteneinnahme, Verbrennungen und nephrotischem Syndrom;
2)
Immunsuppressiva, die bei Krankheiten verwendet werden, wie beispielsweise
i) Autoimmunkrankheiten (zum Beispiel rheumatoide Arthritis, Uveitis,
Psoriasis); ii) Transplantatabstoßung.
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Die
folgenden Beispiele –16
sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 1
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Extraktion von Resveratrolen
(trans-Resveratrol, cis-Resveratrol und ihre Glukoside) aus pflanzlichen
Matrizes (Früchte,
Weintrauben)
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Die
Matrix wird eingefroren und dann in Gegenwart von Natriummetabisulfit
und Ascorbinsäure
in einer Menge von jeweils 1 Gew.-% homogenisiert; das homogenisierte
Produkt wird dreimal einer Flüssig-Flüssig-Extraktion
mit Ethylacetat (150 Vol% bezogen auf das Matrixgewicht) im Dunkeln
unterzogen. Die Extrakte werden einmal mit einer 3%igen wässrigen
Lösung
an Natriumbicarbonat und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen
mit einem Volumen pro Waschschritt von 10% des Extraktvolumens.
Der gewaschene Extrakt wird mit wasserfreiem Natriumsulfat oder
durch Einfrieren wasserfrei gemacht und beim Trocknen unter vermindertem
Druck und bei niedriger Temperatur aufkonzentriert. Der Trockenextrakt
wird mit wasserfreiem Ethylacetat aufgenommen.
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Beispiel 2
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Extraktion von Resveratrolen
(trans-Resveratrol, cis-Resveratrol und ihre Glukoside) aus Wurzeln
von Polygonum cuspidatum
-
Die
Wurzeln der Topfpflanze werden gewaschen, getrocknet, in große Stücke geschnitten,
lyophilisiert und gemahlen. Die Extraktion wird unter Rühren in
sauerstofffreier Umgebung und im Dunkeln mit Methanol (oder Ethanol)
durchgeführt.
Dann wird der Extrakt zentrifugiert und der flüssige Überstand entnommen, letzterer
wird dann bei niedrigem Druck und niedriger Temperatur aufkonzentriert
und mit Ethylacetat aufgenommen.
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Beispiel 3
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Extraktion von Viniferin
(Oligomerstilbene und Stilbenoide) aus pflanzlichen Matrizes
-
Die
Extraktion von Viniferin aus den überirdischen Teilen (Stamm,
Schösslinge,
Blätter)
oder aus den unterirdischen Teilen der Pflanzen der Familie Vitaceae
oder Polygonaceae kann sowohl mit der frischen als auch der gefrorenen
Matrix oder den lyophilisierten und pulverisierten Teilen durchgeführt werden.
Wenn die Extraktion mit den Wurzeln ausgeführt wird, werden diese zuerst
gewaschen, getrocknet, in große
Stücke
geschnitten, lyophilisiert und gemahlen. Die Matrix, welche als
wichtigster Teil angesehen wird, besteht aus der Rinde der lignifizierten
Wurzel der Gattung Vitis.
-
Die
Extraktion erfolgt mit Methanol (oder alternativ mit Ethanol) in
einem Volumen, das dem 10- bis 20-fachen des Gewichtes der zu extrahierenden
Matrix entspricht, in einer sauerstofffreien Umgebung, z.B. gesättigt mit
Stickstoff und im Dunkeln bei Raumtemperatur über einen Zeitraum, der abhängig von
der Matrix variiert. Der Endextrakt wird unter vermindertem Druck
und bei niedriger Temperatur aufkonzentriert und mit Ethylacetat
aufgenommen.
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Beispiel 4
-
Reinigung von Viniferin,
Herstellung des gereinigten Extrakts, der die gesamte Klasse dieser
Verbindungen enthält
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Der
erhaltene konzentrierte Extrakt wird mit Wasser, das mit einem anorganischen
Salz (NaCl) gesättigt
ist, gewaschen, die Fraktion in Ethylacetat auf eine Säule geladen,
die als Füllmaterial
Harz eines Stirendivinylbenzolpolymers enthält, mit einer Porengröße zwischen
0,1 und 0,25 mm, anschließend
vorgereinigt durch konsekutive Waschschritte mit Methanol, Methylenchlorid,
Aceton, Methanol und Wasser. Ein Volumen Wasser entsprechend etwa
dem 10-fachen Extraktvolumens mit dem die Säule beladen wird, wird in der
Aufgabevorrichtung der Säule
belassen. Nach dem Beladen wird zuerst mit Wasser, dann mit Pentan-Methylenchlorid
2:1 eluiert. Mit Ethylacetat werden dann die Stilbene eluiert. Das
Produkt dieser selektiven Elution besteht aus einer gereinigten
Fraktion enthaltend die Gesamtklasse an Viniferin zusammen mit Oligostilbenen und
Stilbenoiden. Die anderen Polyphenole, die stark adsorbiert sind,
werden mit Methanol und/oder Methanol angesäuert mit einer starken Mineralsäure eluiert.
-
Von
besonderem pharmakologischen Interesse bei den Grundbestandteilen
dieser Fraktion sind die Oligomere von Resveratrol, wobei die Dimere,
Trimere und Tetramere von herausragender Bedeutung sind, und zwar
sowohl diejenigen, die noch eine Stilben-Doppelbindung in trans-
oder cis-Form (Oligostilbene) besitzen als auch diejenigen, die
ihre Stilbenstruktur während
der Polymerisation verloren haben (Stilbenoide). Die gleiche Fraktion
enthält
auch das monomere glukosidierte trans-Resveratrol.
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Beispiel 5
-
Reinigung von Resveratrolen,
Herstellung des gereinigten Extrakts, falls möglich mit Abtrennung der freien
von den glukosidierten Formen
-
Der
wie oben beschrieben gewonnene Rohextrakt aus den Wurzeln von Polygonum
cuspidatum wird wie folgt behandelt: Wenn nur Glukoside gereinigt
werden sollen, können
diese selektiv in einem nicht polaren Lösungsmittel kalt-präzipitiert
werden (Hexan wäre
ideal). Alternativ kann die gesamte Fraktion verwendet werden, um
auch trans-Resveratrol zu erhalten. Der Extrakt in Ethylacetat,
der absolut wasserfrei sein sollte, wird bis auf sein Minimalvolumen
reduziert und auf eine präparative
Silica-Säule
zur Chromatographie (zum Beispiel Kieselgel 0,05–0,20 mm), gepackt in Hexan,
aufgegeben. Ein geeignetes Volumen an Chloroform wird über der
Säule belassen
Die Behandlung sieht zwei nacheinander folgende Wasch- und Elutionsequenzen
mit verschiedenen Mischungen an Chloroform-Methanol vor, I (20:1);
II (10:1); III (5:1); IV (2,5:1). Diese Trenntechnik ermöglicht eine
unversehrte Gewinnung der aktiven Agenzien, getrennt von den wichtigsten
Interferenzsubstanzen und somit den Erhalt von zwei Präparationen
mit einem sehr hohen Reinheitsgrad: eine enthält zwei verschiedene Monoglukoside
von trans-Resveratrol, gesammelt in der gleichen Fraktion und die
andere enthält
freies trans-Resveratrol. Falls es erforderlich ist, bis auf die
molekulare Ebene vorzudringen, können Reinigungstechniken
mithilfe präparativer
Chromatographie angewandt werden mit den von Mattivi et al., Isolation,
characterization and evolution in red wine vinification of resveratrol
monomers, J. Agr. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820–1823 beschriebenen Bedingungen.
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Beispiel 6
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Herstellung reiner Verbindungen
aus der Familie Viniferin
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Wenn
das Ausgangsprodukt aus den Wurzeln von Vitis besteht, können die
folgenden reinen Verbindungen durch Reinigung erhalten werden: Epsilon-Viniferin, alfa-Viniferin,
H-Gnetin (welches auch aus dem Holz von Welwitschia mirabilis isoliert
werden kann), r-Viniferin, Ampelopepsin A (welches auch aus den
Wurzeln von Ampelopsis brevipedunculata isoliert werden kann) und
Hopeaphenol.
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Die
letztendliche Isolation dieser reinen Verbindungen kann über High-Performance Flüssigchromatographie über eine
Reversed-Phase Säule
erfolgen. Erfolgreich verwendet werden können Phasen basierend auf Silica
mit den funktionellen Gruppen C18 oder C8 oder Stirenpolymere, die
zuletzt genannten allerdings nur mit Niederdruck. Ein praktisches
Beispiel (ideal für
die Trennung von Epsilon-Viniferin, H-Gnetin und r-Viniferin) ist
die Verwendung von Säulen
gepackt mit LiChrospher 100 RP-18, 10 Mikrometer Partikelgröße, Elution
mit einem linearen Gradienten aus Wasser und Acetonitril, das letztere
mit einem Anteil von 30 bis 50%.
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Beispiel 7
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Trans-cis Isomerisation
-
Diese
Reaktion kann sowohl zur Gewinnung von Produkten, die nicht kommerziell
erhältlich
sind, benutzt werden (Beispiel: cis-Resveratrol) als auch zur Verlagerung
des Gleichgewichts von Mischungen natürlichen Extrakts enthaltend
beide Formen, falls pharmakologisch sinnvoll.
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Cis-Isomere
können über Photoisomerisation
ausgehend von dem entsprechenden trans-Isomer hergestellt werden.
Der beste Umwandlungsertrag kann mit schwacher Bestrahlung im Spektrum
nahe dem ultravioletten Licht oder dem Spektrum von sichtbarem Licht,
die in Gefäßen aus
transparentem Glas durchführbar ist,
erreicht werden. Beispielsweise ergibt sich bei der Isomerisation
einer Lösung
enthaltend 0,5 mg/ml an kommerziell erhältlichem T-Res in Ethanol,
sauerstoffgeschützt
durch Entgasen in einem Ultraschallbad, anschließend mit Stickstoff begast
und dann dicht verschlossen und bestrahlt mit 366 nm, ein Umwandlungsertrag
von etwa 90% über
einen Zeitraum von 600 Minuten. Die Umwandlung kann mithilfe der
Techniken der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC = High Pressure Liquid Chromatography), wie oben beschrieben,
kontrolliert werden durch direkte Injektion und Abstoppen der Reaktion,
sobald der gewünschte
Ertrag erreicht ist. Die Zeiten und Modi müssen selbstverständlich entsprechend
der allgemeinen Praxis angepasst werden: Eine stärkere Bestrahlung kann nur
angewandt werden, wenn raschere Prozesskontrollen, wie sie den Experten
auf diesem Gebiet bekannt sind, angewandt werden (direktes UV, isokratische
HPLC), was im Falle von Einzelverbindungen sicherlich einfach ist.
Die alkoholische Lösung,
in unserem Fall Ethanol, erlaubt eine optimale Stabilität der Präparation,
die in Lösung
bleiben muss, da sich im festen Zustand große Stabilitätsprobleme ergeben.
-
Beispiel 8
-
Methoden zur quantitativen
Analyse
-
Was
die Quantifizierung von Viniferin, als eine Mischung aus Beispiel
4 oder 6 betrifft, so wird ein Volumen zwischen 1 und 6 Mikroliter
Extrakt in Ethylacetat, wasserfrei und filtriert bei 0,22 Mikrometer,
auf ein HPLC-System mit einer Reversed-Phase Säule, Hypersil ODS C18, 5 Mikrometer,
200 × 2,
1 mm aufgegeben. Als günstig
bieten sich Bedingungen mit den Eluenten A = H3PO4 1 mM in Wasser, B = Acetonitril an, mit
einem linearen Gradienten von 100% A, +2% B/min und 0,6 ml/mm Flussgeschwindigkeit
bei 40°C.
Die Detektion erfolgt über
einen Photodiodendetektor, Detektion bei 325 nm für Oligostilbene
und bei 282 nm für
Stilbenoide. Die Quantifizierung erfolgt mit einer externen Standardmethode
bezogen auf die geradlinige Kalibrationskurve mit reinen Referenzverbindungen.
-
Was
Resveratrole betrifft, so können
diese mit zwei alternativen Techniken, HPLC oder GC, erhalten werden.
Für beide
Techniken wird die Quantifizierung mit der internen Standardmethode
durchgeführt.
Die Verbindung, die wir als optimal befunden haben, ist kommerziell
erhältliches
trans-4-hydroxy-Stilben. Für
GC-Analysen werden die Techniken, beschrieben in Mattivi et al Isolation,
characterization, and evolution in red wine vinification of resveratrol
monomers, J. Agric. Food Chem., 1995, 43, 7, 1820–1823, verwendet.
Es wird ein anderes Derivatisierungsagens als die in der entsprechenden
Literatur angegebenen verwendet, bestehend aus Trimethylchlorosilan
und Hexamethyldisilazan in wasserfreiem Pyridin. Diese spezifischen
Bedingungen werden festgelegt, um die Probleme der Silanisierung
mit bis(trimethylsilil)trifluoroacetamid(BSTFA) zu umgehen.
-
Für die HPLC
kann die Referenzmethode mit einer Reversed-Phase Säule angewandt
werden mit Detektion bei 310 nm für trans-Isomere und bei 282
nm für
cis-Isomere (Mattivi F. Solid phase extraction of trans-resveratrol
from wines for HPLC analysis. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung
und Forschung, 1993, 196, 522–525).
Hilfreich sind hierbei die gleichen Bedingungen wie für Viniferin
beschrieben. Der Koeffizient der molaren Extinktion beider Glukoside
ist fast gleich demjenigen der entsprechenden Aglycone, sodass diese
als solche nach Korrektur der Molekulargewichte zugegeben werden
können
(Mattivi et al. Isolation, characterization, and evolution in red
wine vinification of resveratrol monomers, J. Agric. Food Chem.,
1995, 43, 7, 1820–1823).
-
Ist
eine Präparation
für wässrige oder
hydroalkoholische Matrizes erforderlich, sollte der Injektion eine Vorreinigung über eine
Reversed-Phase Kartusche gemäß Mattivi
F. Solid Phase extraction of trans-resveratrol from wines for HPLC
analysis vorausgehen. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung
und Forschung, 1993, 196, 522–525.
Zusätzlich
zu dem, was in dem zuvor erwähnten
Dokument enthalten ist, wurde verifiziert, dass die Methode für alle monomeren
Stilbene, in freier und glukosidierter Form geeignet ist, und dass
die eluierte Fraktion von Ethylacetat unter einem leichten Stickstofffluss
getrocknet werden kann, falls es notwendig ist, den Austausch in
einem anderen Lösungsmittel
durchzuführen
und/oder die Quantifizierungsgrenzen weiter zu senken.
-
Genannte
Techniken können
beispielsweise zur Kontrolle der Stabilität des aktiven Agens im Kulturmedium
verwendet werden und daher zur Unterstützung von experimentellen In-vitro-Modellen,
welche in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden. Beispielsweise
ist es für
die Kultur, beschrieben in Beispiel 10, möglich, die Zeiten für cis-Resveratrol
auf 38 h zu halbieren, welches noch in einer Menge von etwa 25%
am Ende des Tests (72 h) vorliegt, wohingegen die Hälfte der
Zeit von 28 h für
trans-Resveratrol immer noch hoch ist, da diese Verbindung als solche
nach 72 h nicht mehr vorliegt.
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Beispiel 9
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Methoden zur qualitativen
Analyse
-
Die
wichtigsten Experimente, die für
eine eindeutige Charakterisierung auf Molekularebene erforderlich
sind, werden hier gemäß den verwendeten
Techniken aufgeführt:
Ultraviolett-Spektroskopie:
in einem UV-Spektrophotometer mit statischer Messzelle wird die
Doppelmessung in Ethanol absolut und mit Zugabe von Natriumethylat
(Hillis W. E., Ishikura N. 1968 J. Chromatogr., 32, 323) durchgeführt und
in einem mit HPLC gekoppelten Photodioden-Detektor, gemäß Mattivi
F., Raniero F. Relationship between UV spectra and molecular structure
of resveratrol oligomers gemessen. Polyphenols Communications 96,
125–126.
Bei gegebenem y = A230/A236, wird die Anzahl an Stilbeneinheiten
in den Oligomeren, d.h. x, bestimmt mithilfe der Gleichung y = 0,657x – 0,065.
Kernresonanzspektroskopie
(NMR = Nuclear magnetic resonance): 1H im NMR-Spektrometer bei 400
MHz oder höher,
13C bei 100 MHz oder höher,
in Aceton hexadeuteriert mit TMS als Referenz. Als Alternative,
kann die Resonanz der Methylgruppe von hexadeuteriertem Aceton als
Referenz (deltaH = 2,04 deltaC = 29,8) herangezogen werden. Für die spezifischen
Verbindungen können,
gemäß den Anforderungen,
mehrere Messexperimente angewandt werden, z.B. homonukleare DEPT,
1H COSY, 1H COSY langer Bereich, „Double Quantum Filtered" COSY, heteronukleare
HECTOR und heteronuklearer langer Bereich 1H-13C(13C)-GARP „Decoupling
Experiments", HMQC,
HMBC, NOE Differenzspektrum. Optimale Konzentrationen für Messungen in
5 mm Sonden sind 15 mg in 0,5 ml für Protonexperimente und 80
mg in 0,5 ml für
Kohlenstoffexperimente.
Massenspektrometrie, insbesondere FAB-MS
aufgezeichnet in negativer Modalität, in einer Glycerinmatrix.
Infrarot-Spektrometrie:
aufgezeichnet in KBr-Tabletten.
Acetylierung freier Hydroxyle,
unter den Bedingungen angegeben von Koenig et al. (1987, Phytochemistry,
26, 2, 423–427).
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Beispiel 10
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Experimentelle Modelle
zur Untersuchung der funktionellen Aktivitäten von Lymphozyten aus humanem
peripherem Blut.
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Zelltrennung
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Monozyten
im peripheren Blut (PBMC = Mononucleated cells of human peripheral
blood) von gesunden Personen wurden gewonnen durch Trennung von über eine
Leukozytenmanschette erhaltenen Zellen über einen Gradienten (Ficoll-Hypaque).
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Zytofluorometrische
Analyse der intrazytoplasmatischen Zytokinkonzentrationen Die in
vitro Produktion von Zytokinen induziert durch Aktivierung mit monoklonalen
anti-CD3 Antikörpern,
durchgeführt
von den zahlreichen T-Zell-Unterpopulationen
in PBMC, wurde mithilfe einer simultanen zytofluorometrischen Bestimmung
der intrazytoplasmatischen Zytokinkonzentration und der Expression
von Oberflächenantigenen
in jeder einzelnen Zelle bestimmt. Durch Verwendung dieser Methode
wurde es möglich,
die Produktion von Zytokinen durch einzelne Zell-Unterpopulationen ohne vorausgehende
physikalische Trennung und somit in Gegenwart von Interaktionen
bei der Produktion von Zytokinen, welche in physiologischen Systemen
stattfinden, zu bewerten. Die Ausführung der genannten Methode
wird durch die Verwendung von Saponin als reversibel permeabilisierendem
Agens der Zellmembran möglich.
Kurz zusammengefasst wurden PBMC in einer Konzentration von 1 × 106/ml resuspendiert, aktiviert durch Behandlung
mit anti-CD3 (10 ng/ml) und mit unterschiedlichen Dosen an Resveratrol
inkubiert. Nach 3 Tagen in Kultur bei 37°C in einem CO2-Inkubator wurden
die Zellen mit anti-CD28 (2 ng/ml) und mit Resveratrol in der gleichen
wie zuvor verwendeten Dosis behandelt. Nach 3 weiteren Behandlungstagen
wurden die Zellen mit einem fluoreszierenden monoklonalen Antikörper spezifisch
für ein
Oberflächenantigen
(CD4 oder CD8) in einem Medium mit Zusatz von 0,3% Saponin resuspendiert und
mit einer optimalen Dosis einer Mischung von monoklonalen Anti-Zytokin-Antikörpern, konjugiert
mit mehreren Fluorochromen, markiert. Die so behandelten Proben
wurden dann einer zytofluorometrischen Analyse mithilfe eines Zytofluorometers
vom Typ FACscan (BD) unterzogen.
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Bestimmung der Expression
von Oberflächenantigenen
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PBMC
wurden in einer Konzentration von 1 × 106/ml
resuspendiert und über
unterschiedliche Zeiträume
mit verschiedenen Resveratroldosierungen inkubiert. Die Zellen wurden
mit einem oder mehreren fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern inkubiert,
wobei jeder spezifisch für
ein Oberflächenantigen
(CD4, CD8, CD16 and CD95) ist. Sie wurden dann einer zytofluorometrischen
Analyse mithilfe eines Zytofluorometer FACscan (BD) unterzogen.
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Bestimmung von Apoptose
mit Durchflusszytofluorometrie
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PBMC
resuspendiert in einer Konzentration von 1 × 106/ml
wurden in Aceton/Methanol 1:4 fixiert, mit 100 KU/ml RNase behandelt
und mit Propydiumjodid (50 μg/ml)
markiert. Die Zellen wurden mithilfe der Durchflusszytofluorometrie
mit einem Zytometer vom Typ FACscan analysiert.
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Bestimmung von Apoptose
durch konfokale Mikroskopie
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PBMC
resuspendiert in einer Konzentration von 1 × 106/ml
wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 100 KU/ml RNase behandelt
und mit Propydiumjodid (50 μg/ml)
markiert. Die Zellen wurden durch Betrachtung mit einem konfokalen
Mikroskop (LEIKA TCS 4D) analysiert.
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Bestimmung von Zellproliferation
und DNA-Synthese
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Die
Zellvermehrung wurde mithilfe des Coulter Counter (Gerät zur Zelltiterbestimmung),
bewertet. Die DNA-Synthese wurde anhand des Tests auf Inkorporation
von Bromodeoxyuridin (BrdU) gemessen und über Durchflusszytometrie unter
Verwendung eines Zytometers vom Typ FACscan (Becton-Dickinson) bewertet.
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Bestimmung der Zellmortalität
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Die
Zellmortalität
wurde durch eine Zellzahlbestimmung in Trypan-Blue und/oder durch
Durchflusszytometrie mithilfe eines Zytometers vom Typ FACscan (Becton-Dickinson)
ermittelt. Bestimmt wurde die Vitalität nicht fixierter Zellen, die
mit Propydiumjodid (PI) markiert wurden.
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Bestimmung der Aktivität der natürlichen
Killerzellen (NK)
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PBMC
in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml wurden in vitro für 18 h mit
verschiedenen Resveratroldosierungen behandelt. Am Ende der Inkubation
wurden die Zellen auf ihre natürliche
zytotoxische Aktivität
(NK) gegenüber
der humanen erythroleukämischen
Linie K 562 getestet. Die zytotoxische Aktivität der Zellen, die eine Reaktion
hervorrufen und 4 Stunden bei 37°C
mit K562 inkubiert wurden, wurde bestimmt mithilfe eines Zytotoxizitätsstandardtests
basierend auf der Freisetzung von 51Cr durch
die Zielzellen.
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Bestimmung der zytotoxischen
Aktivität
von T-Lymphozyten (CTL)
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PBMC
in einer Konzentration von 2 × 106 Zellen/ml wurden in vitro für 5 Tage
bei 37°C
mit bestrahlten MT-2 Zellen (einer Linie von humanen T-Zellen aus
Nabelschnurblut infiziert mit HTVL-1) stimuliert und gleichzeitig
mit verschiedenen Dosen an Resveratrol behandelt. Am Ende der Inkubation
wurden die Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber MT-2 Zellen getestet mithilfe
eines Zytotoxizitätsstandardtests
basierend auf der Freisetzung von 51Cr durch
die Zielzellen.
-
Beispiel 11
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Wirkung von Resveratrol
auf die Produktion von Zytokinen in aktivierten humanen Lymphozyten
-
Monozyten
im peripheren Blut (PBMC) wurden aktiviert durch Inkubation mit
anti-CD3 + anti-CD28 und anschließend mit verschiedenen Resveratroldosierungen
(oder DMSO als Kontrolle), wie oben beschrieben, inkubiert. Nicht
aktivierte Zellen, die aus der gleichen Leukozytenmanschette stammen,
wurden als Kontrolle verwendet. Der Prozentsatz an T-Lymphozyten CD4+
und CD8+ positiv für
IL2, IL4 und IFN-g wurde über durchflusszytometrische
Bestimmungen analysiert. Die Ergebnisse der Experimente zeigten,
dass in einem Dosisbereich von 0,625–2,5 μg/ml Resveratrol in den mit
anti-CD3 + anti-CD28 aktivierten Zellen einen bedeutenden Anstieg
im Prozentsatz der T-Zellen CD8+ positiv für intrazellulare IFN-g, IL2
und IL4 (und somit aktiviert, die oben erwähnten Zytokine zu synthetisieren)
(1) im Vergleich zu Kontrollen induziert.
Der Aktivitätspeak
variiert gemäß den untersuchten
Zytokinen und betrug: 1,25–2,5
für IFN-g
(1A), 0,625 für
IL2 (1B) und 2,5 für
IL4 (1C). Die Wirkung von Resveratrol führte bei
einer Dosierung von 5 und noch deutlicher bei einer Dosierung von
10 μg/ml
zu einer Hemmung des Prozentsatzes an Zellen, welche alle getesteten
Zytokine synthetisieren (1A, 1B, 1C). Ähnliche
Ergebnisse wurden für
T-Zellen CD4+ (2) erhalten, obwohl
sich Unterschiede hinsichtlich des Peaks der stimulierten Aktivität ergaben,
welcher jeweils bei 2,5, 1,25–2,5
und 0,625 für
IFN-g (2A), IL2 (2B)
und IL4 (2C) auftrat. Diese Ergebnisse
zeigen deutlich, dass Resveratrol (sowohl im Sinne einer Stimulation
bei niedrigen Dosen als auch einer Hemmung bei hoher Dosierung)
die Produktion von Zytokinen in aktivierten T-Zellen CD8+ und CD4+
verändern
kann und daher dank der genannten Wirkung als Medikamentenwirkstoff
mit immunmodulierender Aktivität
verwendet werden kann.
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Beispiel 12
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Wirkung von Resveratrol
auf die DNA-Replikation und Synthese von aktivierten humanen Lymphozyten
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Monozyten
im peripheren Blut (PBMC) wurden aktiviert durch die Inkubation
mit anti-CD3 + anti-CD28 und anschließend mit verschiedenen Resveratroldosierungen
(oder DMSO als Kontrolle), wie oben beschrieben, inkubiert. Nicht
aktivierte Zellen, die aus der gleichen Leukozytenmanschette stammen,
wurden als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse der Experimente zeigten,
dass bei Dosierungen von 0,625 und 1,25 μg/ml Resveratrol einen statistisch
signifikanten Anstieg sowohl bei der Anzahl (3A) als
auch der Fähigkeit (3B)
der behandelten Zellen DNA zu synthetisieren induziert und damit
eine verstärkte
proliferative Aktivität
herbeiführt.
Im Gegensatz dazu induziert eine Behandlung mit Resveratrol im Dosisbereich
von 2,5–10 μg/ml eine
dosisabhängige
Hemmung der Zellproliferation (3A und 3B).
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Beispiel 13
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Wirkung von Resveratrol
auf Apotose und Mortalität
von aktivierten humanen Lymphozyten
-
Monozyten
im peripheren Blut (PBMC) wurden aktiviert durch die Inkubation
mit anti-CD3 + anti-CD28 und anschließend mit verschiedenen Resveratroldosierungen
(oder DMSO als Kontrolle), wie oben beschrieben, inkubiert. Nicht
aktivierte Zellen, die aus der gleichen Leukozytenmanschette stammen,
wurden als Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse der Experimente zeigten,
dass Resveratrol bei Dosierungen von 0,625 und 1,25 μg/ml keine
Wirkung auf die Apoptose der aktivierten Zellen hat (4A).
Im Gegensatz dazu induziert eine Behandlung mit Resveratrol im Dosisbereich
von 2,5–10 μg/ml einen
dosisabhängigen
Anstieg im Prozentsatz apoptotischer Zellen (4A). In ähnlicher
Weise hat Resveratrol in Dosierungen von 0,625 und 1,25 μg/ml keinen
Effekt auf die Mortalität
aktivierter Zellen (4B). Im Gegensatz dazu induziert
eine Behandlung mit Resveratrol im Dosisbereich von 2,5–10 μg/ml einen
dosisabhängigen
Anstieg der Mortalität (4B).
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Beispiel 14
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Die Effekte von Resveratrol
auf die Aktivität
von Lymphozyten als natürliche
Killerzellen (NK) gewonnen aus Humanblut.
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Monozyten
im peripheren Blut (PBMC) wurden für 18 h mit Resveratrol in einer
Konzentration von 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10 und 20 μg/ml inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurden die Zellen auf ihre natürliche zytotoxische
Aktivität
(NK) gegenüber
der humanen erythroleukämischen
Linie K 562 getestet. Die Resultate zeigten (5A), dass
Resveratrol in einem Dosisbereich von 0,625–5 μg/ml einen statistisch signifikanten Anstieg
der NK-Aktivität
induziert. Der nach der Behandlung mit Resveratrol in einer Dosierung
von 5 μg/ml genannte
signifikante Anstieg (5B) von Zellen, die CD16 und
CD95 (CD16+/CD95+ Zellen) co-exprimieren können, deutet stark auf die
spezifische stimulierende Aktivität bezüglich des Parameters hin, der
für die untersuchte
Substanz in Betracht gezogen wird, vermutlich aufgrund der Stimulation
der genannten Zellen. Genannte Spezifität zeigt sich ebenso darin,
dass die Behandlung von Lymphozyten mit Resveratrol in der gleichen
Dosierung keine Veränderung
im Prozentsatz der CD4+/CD95+ Zellen (5C) induziert.
-
Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, dass Resveratrol, möglicherweise durch die Aktivierung
von CD16+/CD95+ Zellen, eine immunstimulierende Aktiviät in Bezug
auf die NK-Reaktion ausüben
kann und somit zur Stärkung
der natürlichen
zytotoxischen Reaktion führt.
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Im
Gegensatz dazu induziert eine Behandlung mit Resveratrol im Dosisbereich
von 10 und 20 μg/ml eine
Hemmung der NK-Aktivität.
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Beispiel 15
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Wirkung von Resveratrol
auf die zytotoxische Aktivität
von T-Lymphozyten (CTL) aus Humanblut
-
Monozyten
aus peripherem Blut (PBMC) wurden mit Resveratrol in einer Konzentration
von 0,625, 1,25, 2,5, 5 und 10 μg/ml
in Gegenwart von MT-2 Zellen (Linie von humanen T-Zellen aus Nabelschnurblut
infiziert mit HTLV1) für
5 Tage bei 37°C
inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber genannten
MT-2 Zellen getestet. Die Ergebnisse der Experimente zeigten, dass
Resveratrol bei einer Dosierung von 0,625 einen Anstieg in der zytotoxischen
Aktivität
von T-Lymphozyten (6A) induziert und zu einer vermehrten
Anzahl an Blastenzellen (6B) führt. Im
Gegensatz dazu induziert eine Behandlung mit Resveratrol im Dosisbereich
von 2,5–10 μg/ml eine
Hemmung der zytotoxischen Aktivität (5A) und
der Anzahl der Blastenzellen (5B).
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Beispiel 16
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Wirkung von Resveratrol
auf den Prozentsatz von T-Lymphozyten CD4+ und CD8+ in aktivierten
humanen PBMC
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Monozyten
im peripheren Blut (PBMC) wurden durch die Inkubation mit anti-CD3
+ anti-CD28 aktiviert und anschließend mit verschiedenen Resveratroldosierungen
(oder DMSO als Kontrolle), wie oben beschrieben, inkubiert. Die
Ergebnisse der Experimente zeigten, dass Resveratrol eine dosisabhängige Abnahme
des Prozentsatzes an aktivierten CD8+ Zellen in einem Dosisbereich
von 2,5–10 μg/ml induziert.
Es induziert im Gegensatz dazu aber keine Veränderung bei geringer Dosierung
oder in Bezug auf den Prozentsatz an CD4+ Zellen.
