KR102256712B1 - 칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 분리하는 방법 및 그 용도 - Google Patents

칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 분리하는 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다양한 추출 용매를 사용한 대마의 마이크로웨이브 조사 탈카복시산 반응을 통해 CBD의 함량이 증가된 효율적이고 경제적인 대마 가공물의 제조 방법 및 그에 의하여 생산된 CBD 함량이 증가된 가공물, 분획물 및 CBD 단일성분의 식·의약·화장품용 용도를 제공하는 것이다.

Description

칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 분리하는 방법 및 그 용도{Method of isolating cannabidiol from Cannabis sp. and uses thereof}
본 발명은 마이크로웨이브를 이용하여 대마 및 그의 추출물로부터 칸나비디올(CBD)의 함량을 증가시키는 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
대마(大麻, Cannabis sativa L.)는 중앙아시아를 중심으로 12,000년 전부터 열대와 온대지방에서 널리 재배된 삼과(Cannabaceae) 대마속의 한해살이 식물로 야생삼을 포함하며, 의·약학적 성분으로 알려진 다양한 종류의 칸나비노이드 화합물을 함유하는 칸나비스 케모바스(cannabis chemovars)와 그의 변형체, 변종 var. indica 및 var. kafiristanica를 포함한 칸나비스 사티바 서브스페시스 사티바(Cannabis sativa subspecies sativa), 칸나비스 사티바 서브스페시스 인디카(Cannabis sativa subspecies indica), 칸나비스 사티바 서브스페시스 루데라리스(Cannabis sativa subspecies ruderalis) 및 유전 교배, 자기 교배 또는 그의 교잡 식물을 통칭해서 말한다(Genetic Resources and Crop Evolution 2005, 52, 161., Nature 2015, 525, S10).
중국을 비롯한 한국의 전통의약서에서는 대마 종자의 껍질을 제거한 마자인(麻子仁) 또는 화마인(火麻仁)이 변비, 당뇨, 통증질환, 월경불순, 피부질환 및 이질 등에 사용되어 왔고, 삼잎인 대마초(大麻草, 마엽(麻葉))은 구충제, 모발보호, 천식, 진통작용, 마취, 이뇨제 등으로 사용한 바 있다. 또한 마근(麻根)은 난산 치료와 어혈 해소에, 마피(麻皮)는 타박상과 열림창동에, 마화(麻化)는 마비증상과 가려움증 등에 사용했으며, 마분(麻賁)은 난산, 변비, 통풍, 진관, 불면 등에 대마의 각 부위에 따라 병증에 맞게 사용한 기록들이 전해진다.
대마에는 약 400여 개의 화합물이 있으며, 그 중 대부분이 칸나비노이드(cannabinoids)와 테르펜(terpene), 페놀류 화합물(phenolic compounds)이고 이중 의·약학적 중요 천연 성분인 칸나비노이드류는 90여 가지로 대마에서만 발견되는 성분도 다수 있다(Frontiers in Plant Science 2016, 7, 19).
대마 성분 중 향정신성 칸나비노이드로 알려진 물질은 △9-테트라히드로칸나비놀(△9-tetrahydrocannabinol, △9-THC), 칸나비놀(cannabinol, CBN), 칸나비노디올(cannabinodiol, CBDL)이고, 칸나비디올(cannabidiol, CBD)은 비향정신성 성분으로 아드레날린 수용체 및 칸나비노이드 수용체를 비롯한 인체 내 다양한 수용체를 통해 생리활성 효과를 나타내는 성분으로 알려져 있다.
특히, 과학자들이 대마의 향정신성 작용 기전을 연구하던 중 1988년 뇌에서 칸나비노이드가 선택적으로 결합하는 수용체를 발견하였으며, 이는 우리 몸에서도 칸나비노이드와 유사한 분자가 만들어지고 있고 이러한 칸나비노이드류 분자는 뇌의 국소부위에서 만들어지는 지방산 형태의 신경전달물질로 아난다마이드(anandamide)라고 한다(Science, 1992, 258, 1946). 현재까지 알려진 칸나비스 수용체는 두 종류로 나뉘며 CB1 수용체의 경우 대뇌피질, 해마, 소뇌, 기저핵 등 뇌의 전반에 걸쳐 분포하고 있고, CB2 수용체는 주로 대식세포나 골수, 폐, 췌장, 평활근 등 말초조직에 주로 분포하여 면역계와 관련성이 깊다.
약용으로 사용되는 대마의 주요한 유효성분인 THC는 CB1 수용체에 강한 친화력을 가진 작용제로 이것이 향정신성 작용을 나타내는 주요 기전으로 나타나 있으나 CBD의 경우는 수많은 연구결과를 통해 항염증작용, 항간질작용, 진토작용, 항암작용 등 유익한 작용을 갖는다고 밝혀졌는데 THC로 인한 부작용을 줄이고(Current Pharmaceutical Design, 2012, 18, 4906., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2015, 23, 1377), THC와 같은 CB1과 CB2 수용체 작용제에 대한 길항작용을 통해 내인성 칸나비노이드인 아난다마이드의 재흡수 및 분해를 억제하는 동시에 세로토닌 수용체의 작용제 알려져 있다(Neurochemcal Research, 2005, 30, 1037). 이 밖에도 대마 성분 중 칸나비크로민(cannabichromene)은 항염증, 진정작용, 항진균작용 등이, CBN은 CB1보다는 CB2 수용체와 결합하여 면역기능 향상에 도움(Frontiers in Plant Science 2016, 7, 19)이 된다고 밝혀지는 등 대마 함유 성분들에 대한 약학적 기전 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.
Figure 112019058018916-pat00001
△9-테트라히드로칸나비놀,△9-THC
Figure 112019058018916-pat00002
△8-테트라히드로칸나비놀,△8-THC
Figure 112019058018916-pat00003
△9-테트라히드로칸나비놀산,△9-THCA
Figure 112019058018916-pat00004
칸나비놀, CBN
Figure 112019058018916-pat00005
칸나비노딜올, CBDL
Figure 112019058018916-pat00006
칸나비디올, CBD
Figure 112019058018916-pat00007
칸나비디올산, CBDA
미국에서 식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)이 승인한 THC 경구용 약품인 드로나비놀(dronabinol, 상품명 Marinol)과 나빌론(nabilone, 상품명 Cesamet)이 항암치료 부작용 완화와 에이즈환자 식욕촉진제로 판매되고 있으며(Journal of Nurse Practitioners 2014, 10, 633), CBD를 주성분으로 하는 액상 약물인 에피디오렉스(Epidiolex)가 소아 간질에, CB2 수용체 결합 합성 칸나비노이드 제제인 레수납(Resunab)이 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus) 치료에, 단일 THC와 CBD 약물이 아닌 대마 추출물 형태의 칸나도르(Cannador, THC:CBD=2:1)가 다발성 경화증 및 심각한 만성 통증 질환에 대한 임상실험을 하는 등 광범위하고 활발히 연구가 진행중이다.
이에 본 연구자들은 지금까지 축적해온 마이크로웨이브 가공기술을 이용한 대마의 주요 약학 성분에 대한 추출 수율 증대 및 CBD의 함량을 높이는 기술을 개발하던 중 지용성 유기 용매를 사용하여 마이크로웨이브 탈카복시산 반응을 통해서 CBDA로부터 CBD가 손쉽게 전환됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
대마로부터 약학적 성분인 칸나비노이드를 추출하는 단계에서 에탄올을 사용하는 것이 일반적이지만, 칸나비노이드류는 지용성 성분이라 극성이 낮은 용매로 추출하는 것이 대마 추출물 내 함유량이 높은 칸나비노이드를 얻을 수 있다.
따라서, 본 연구자들은 대마 에탄올 추출물과 부탄올 추출물, 에틸아세테이트 추출물, 아세톤 추출물, 비양성자성 추출물, 클로로포름 추출물, 메틸렌클로라이드 추출물, 및 헥산 추출물을 얻은 후 각기 다른 용매의 추출물 중량 대비 함유된 CBDA와 CBD의 양을 분석함으로써 기존에 알려진 CBDA 및 CBD를 추출하는데 사용한 양성자성 극성 용매(protonic polar solvent)인 알코올류 보다 비양성자성 용매(aprotonic solvent)를 사용하으로써 추출 수율이 향상된 방법을 제공한다.
또한, 본 연구자들은 마이크로웨이브 조사 탈당 및 탈수반응으로 천연물을 가공한 기술을 적용하여 대마 또는 대마의 유기용매 추출물을 밀폐형 용기에 부가하고 마이크로웨이브 조사를 함으로써 탈카복실산 반응을 통해 대마에 함유된 칸나비디올산 (Cannabidiolic acid, CBDA)이 약학적 성분인 칸나비디올 (Cannabidiol, CBD)로 전환하는 제조방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 대마 추출물과 가공물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 대마 가공물로부터 CBD를 포함하는 분획물 또는 단일성분의 CBD를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 대마 추출물, 가공물, 분획물 또는 단일성분의 CBD를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 대마 추출물, 가공물, 분획물 또는 단일성분의 CBD를 포함하는 식품용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 대마 추출물, 가공물, 분획물 또는 단일성분의 CBD를 포함하는 피부 트러블 개선용 화장품용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 대마 추출물, 가공물, 분획물 또는 단일성분의 CBD를 포함하는 뇌신경 개선용 의약품용 조성물을 제공한다.
일 양상은 칸나비스 속 식물 또는 그 추출물 및 용매를 포함하는 반응 혼합물을 밀폐된 용기 중에서 마이크로웨이브 조사하는 단계; 및 상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 포함하는 칸나비노이드를 분리하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 칸나비스 속 식물은 Cannabis chemovars , Cannabis sativa, Cannabis indica, Cannabis ruderalis 등의 Cannabis sp, 야생종자, 변형체, 변종, 교잡종, 및 칸나비노이드를 포함한 식물 등을 포함할 수 있다. 또한, 칸나비스 속 식물은 살아있는 식물체 또는 건조된 식물체일 수 있다. 또한, 칸나비스 속 식물체는 잎, 꽃봉오리, 열매, 겹털, 화포, 줄기, 또는 칸나비노이드를 함유할 수 있는 임의의 부위일 수 있다. 또한, 칸나비스 속 식물은 자웅이주 식물로서 암, 수에 따라 칸나비노이드 함량에 차이가 있을 수 있다. 칸나비스 속 식물은 암, 수, 또는 그 혼합물일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 비양성자성 용매를 칸나비스 (cannabis) 속 식물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 비양성자성 용매는 C3-C10의 에스테르, C3-C10의 케톤, 또는 C1-C6의 비치환 또는 할로겐화 탄화수소일 수 있다. 상기 추출물은 칸나비노이드 CBDA와 CBD의 총 함량이 증가된 것일 수 있다. 상기 추출물은 칸나비노이드 CBDA와 CBD의 총 함량이 중량 기준으로 5% 이상, 예를 들면 5 내지 9%, 5 내지 8%, 5 내지 7%, 또는 5 내지 6%일 수 있다. 상기 추출물은 농축시 층 분리가 없으며, 용해도가 좋은 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 칸나비노이드 및 비양성자성 용매를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은, 20℃, 25℃, 30℃, 또는 35℃ 내지 사용한 단일 용매 또는 혼합 용매의 환류 온도에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 비양성자성 용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 2-부탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 칸나비스 속 식물은 잎, 꽃봉오리, 열매, 겹털, 화포, 줄기, 또는 칸나비노이드를 함유할 수 있는 임의의 부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 추출물 전체 중량에 대하여 CBDA와 CBD의 함량이 5 % 이상, 예를 들면 5 내지 9%, 5 내지 8%, 5 내지 7%, 또는 5 내지 6%일 수 있다.
칸나비스 식물 또는 그 추출물에 함유된 CBDA의 탈카복시산 반응을 통한 CBD로의 전환 반응은 마이크로웨이브 조사를 통해 얻어질 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 용매, 또는 최종 산물 중 CBD 함량 또는 CBDA에 대한 CBD의 비율에 따라 적당한 온도가 선택될 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 80℃ 내지 150℃, 예를 들면 80 내지 140℃, 80 내지 130℃, 80 내지 120℃, 80 내지 110℃, 80 내지 100℃, 80 내지 90℃, 90℃ 내지 150℃, 90 내지 140℃, 90 내지 130℃, 90 내지 120℃, 90 내지 110℃, 90 내지 100℃, 100℃ 내지 150℃, 100 내지 140℃, 100 내지 130℃, 100 내지 120℃, 100 내지 110℃, 110℃ 내지 150℃, 110 내지 140℃, 110 내지 130℃, 110 내지 120℃, 120℃ 내지 150℃, 120 내지 140℃, 또는 120 내지 130℃일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 CBDA를 CBD로 전환하기에 충분한 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사 시간은 온도, 마이크로파 출력, 사용한 용매 및 최종 산물의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사 시간은 5 분 내지 180 분, 예를 들면, 10 분 내지 180 분, 10 분 내지 150 분, 10 분 내지 100 분, 10 분 내지 90 분, 20 분 내지 180 분, 20 분 내지 150 분, 20 분 내지 100 분, 20 분 내지 90 분, 30 분 내지 180 분, 30 분 내지 150 분, 30 분 내지 100 분, 또는 30 분 내지 90 분일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 가압하에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 1 초과 100 기압, 예를 들면, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 30, 2 내지 20, 또는 2 내지 15 기압하에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사에서 상기 마이크로웨이브의 출력은 50W 내지 6 kW, 예를 들면, 100W 내지 3kW일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 마이크로웨이브 조사는 칸나비스 또는 그 추출물에 마이크로웨이브를 조사하여 가열하는 열적 반응(thermal reaction)을 의미한다. 마이크로웨이브는 300 MHz 내지 300 GHz, 예를 들면, 1000 MHz 내지 100 GHz, 1000 MHz 내지 50 GHz, 1000 MHz 내지 10 GHz, 또는 1000 MHz 내지 5 GHz의 주파수를 갖는 마이크로파일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 분리되는 상기 칸나비노이드는 CBD일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사하는 단계에서, 상기 용매는 비양성자성 용매일 수 있다. 상기 비양성자성 용매는 C3-C10의 에스테르, C3-C10의 케톤, 또는 C1-C6의 비치환 또는 할로겐화 탄화수소일 수 있다. 상기 비양성자성 용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 2-부탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
상기 마이크로웨이브 조사하는 칸나비스 속 식물 또는 그의 추출물에 함유된 CBDA 성분이 CBD 성분으로 10% 내지 100%, 예를 들면 25% 내지 100%, 30% 내지 100%, 50% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 97% 내지 100%, 또는 100% 전환되도록 하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 분리된 칸나비노이드는 분리물 전체 중량에 대하여 10 내지 100 중량%의 CBD를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 분리 방법은 CBD를 분리하는 단계일 수 있다.
상기 분리하는 단계는 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물은 크로마토그래피하는 것을 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 역상 C18 컬럼-크로마토그래피, 또는 역상 준 분취 고성능 액체크로마토그래피일 수 있다. 그 결과, 상기 반응 혼합물은 실리카겔을 이용한 용매의 극성별 분획물로 CBD 함량이 높은 혼합물 또는 분취용 액체크로마토그래피 분리를 통해서 CBD 단일 성분을 얻을 수 있다.
역상 C18 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리방법은 실험실에서 일반적인 방법으로 사용되는 분리방법으로, 분리할 시료의 양에 따라 사용되는 유리관의 직경과 역상 C18의 사용량이 달라질 수 있으나, 통상은 유리관의 경우 내경 1 내지 10 cm, 길이 10 내지 100 cm의 관과 선택된 관 높이에 50 내지 70%의 역상 C18이 채워진 관을 사용하는 것일 수 있다. 사용되는 용리액의 조성은 시료의 양과 실리카 겔 관에 따라 다소 차이가 있으며, 예를 들면 메탄올:물:에틸아세테이트=1:1:0 내지 1:0:0 내지 0:0:1 부피비의 혼합용매를 혼합비에 따라 순차적으로 사용하는 것일 수 있다.
역상 준 분취용 HPLC에 의한 분리 조건은, 시료의 양과 사용되는 컬럼의 크기에 따라 달라질 수 있으나, 통상은 역상 분취용 HPLC (고정상: Phenomenex 사 Luna C18(2) 컬럼, 입자크기 10 μm, 길이 250x10 mm)을 액체 크로마토그래피 (Shimadzu) 기기에 준비하고 시료를 초기 용리액에 용해하여 주입한 뒤, 용리액을 아세토니트릴:물=50:50 (v/v)로 전개시켜 60 내지 90분간 아세토니트릴:물=100:0 (v/v)로 증가시키면서 분리하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드 유효성분으로 포함하는 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토용 약학 조성물을 제공한다. 상기 칸나비노이드는 CBD일 수 있다. 상기 칸나비노이드는 추출물, 분획물, 또는 단일성분의 형태일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 칸나비노이드는 단순 열처리 가공물에 비해 CBD의 함량이 현저히 높음으로써 증가된 CBD의 약효를 갖는다. CBD는 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증, 면역 또는 진토작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 마이크로웨이브 조사에 의하여 이러한 효과가 단순 열처리 가공물에 비해 현저히 증가될 수 있다.
다른 양상은 상기한 따른 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드 유효성분으로 포함하는 건강기능식품용 조성물을 제공한다. 상기 칸나비노이드는 CBD일 수 있다. 상기 칸나비노이드는 추출물, 분획물, 또는 단일성분의 형태일 수 있다. 상기 식품은 기능성 식품, 또는 건강기능성 식품일 수 있다. 식품의 기능적 성분은 약학성분이 일부 함유된 안전한 식품 조성물이고 식품적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물을 제공한다. 상기 화장품은 일반 화장품, 또는 기능성 화장품일 수 있다. 화장품의 기능적 성분으로 알려진 CBD는 항산화 또는 항염증 등에 효과를 갖는 조성물일 수 있다. 상기 화장품용 조성물은 화장품에 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 대마 추출물은 비양성자성 용매(aprotonic solvent)를 사용함으로써 칸나비노이드류가 효과적으로 추출되며, 특히, CBDA와 CBD의 추출물 내 함량을 높일 수 있다.
본 발명에 의하면, 추출물에 함유된 CBDA는 마이크로웨이브 조사를 통해 CBD로 전환할 수 있는데, 칸나비노이드 함량이 높은 에틸아세테이트 추출물을 밀폐형 반응기에서 마이크로웨이브 조사를 통해 CBDA의 탈카복시산 반응으로 CBD가 20 내지 100% 생성되는 효율적인 생산을 할 수 있다.
본 발명에 의하면, 마이크로웨이브 조사 칸나비스 식물 또는 그의 추출물의 역상 C18 컬럼 크로마토그래피 분획을 통해 CBD의 함유량이 높은 분획물을 제조할 수 있다.
본 발명에의 의하면 CBD 함량이 높은 분획물의 역상 준 분취용 고성능 액체크로마토그래피 분리를 통해 단일성분의 CBD를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 칸나비스 식물 추출물, 마이크로웨이브 가공물, 분획물 또는 단일 CBD이 포함된 약학적 조성물에 의하면 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증, 면역 또는 진토작용 등의 의약품 및 의약외품에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 대마 추출물, 마이크로웨이브 가공물, 분획물 또는 단일 CBD이 포함된 식품용 조성물에 의하면 식품, 특히 기능성 식품으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 대마 추출물, 마이크로웨이브 가공물, 분획물 또는 단일 CBD이 포함된 화장품용 조성물에 의하면 항산화 또는 항염증 기능의 일반 화장품, 또는 기능성 화장품에 사용될 수 있다.
도 1은 CBDA를 농도 별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 2는 CBD를 농도 별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 3은 원료 대마 잎 추출물의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다. 이하에서 "원료 대마 잎 추출물"은 실시예 8에서 얻어진 에틸아세테이트 용매로 추출한 추출물을 나타낸다.
도 4는 대마 잎 추출물을 80 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 5는 대마 잎 추출물을 90 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 6은 대마 잎 추출물을 100 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 7은 대마 잎 추출물을 110 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 8은 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 9는 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 10은 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 11은 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 40 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 12는 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 50 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 13은 대마 잎 추출물을 130 ℃, 100 W에서 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 14는 대마 잎을 130 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 15는 실시예 23 가공물로부터 CBD를 분리하는 과정을 그린 도면이다.
도 16은 실시예 23 가공물의 분획물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 17은 실험예 2에서 분리한 CBD의 순도 확인을 위해 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1 및 실시예 1-7 : 추출용매에 따른 대마 추출물 비교
본 비교예 및 실시예에서 사용된 대마는 식품의약품안전처와 서울지방식품의약품안전청의 마약류(대마) 학술연구자 허가(제1564호) 및 대마시료 양수·양도 승인 절차를 거쳐 대한민국 경상북도 상주시에 소재한 제이헴프코리아로부터 기탁받아 사용하였다. 대마 씨 껍질, 대마 잎, 대마 줄기, 및 대마 뿌리는 2018년 10월에 수확하였고 건조 후 세절하여 사용하였다. 대마 부위 중 칸나비노이드류가 비교적 많이 함유된 세절된 건조 대마 잎 1 g에 추출용매 20 mL를 100 mL 삼각 플라스크에 넣고 초음파 추출기(Sonics, VC505)로 1시간 동안 기기의 40% 파워로 추출 후 24 시간 실온에서 추출하였다. 사용한 추출용매는 에탄올 (비교예 1), 부탄올 (실시예 1), 에틸아세테이트 (실시예 2), 아세톤 (실시예 3), 2-부탄온 (실시예 4), 클로로포름 (실시예 5), 디클로로메탄 (실시예 6), 및 헥산 (실시예 7)으로 추출하였다.
실시예 8 : 대마 잎 추출물 제조
본 실시예는 실시예 2에서 사용한 방법으로 추출물을 제조하였고 2018년 10월에 수확한 대마 잎을 건조 후 세절하여 사용하였다. 세절된 건조 대마 잎 200 g과 에틸아세테이트 2 L를 5L 비이커에 넣고 초음파 추출기로 1시간 동안 기기의 40% 파워로 추출 후 24시간 실온에서 추출하는 것을 2회 반복하였다. 추출액을 감압 하에 증발 농축하여 CBDA 및 CBD를 포함하는 건조 추출물 17.6 g을 얻었다.
실시예 9-30 : 대마 잎 추출물의 마이크로웨이브 이용한 가공
실시예 8에서 얻어진 에틸아세테이트 추출물을 마이크로웨이브 가공하였다. 구체적으로는, 대마 잎 추출물 100 mg을 미국 CEM 사에서 제조된 마이크로웨이브 조사기 (모델번호 908005)의 10 mL 용기 중에 에틸아세테이트 1 mL를 첨가하고 용기 마개를 닫은 후 80 ℃로 100W, 주파수 2450 MHz에서 10분 (실시예 9), 20분 (실시예 10), 및 30분 (실시예 11), 90 ℃로 10분 (실시예 12), 20분 (실시예 13), 및 30분 (실시예 14), 100 ℃로 10분 (실시예 15), 20분 (실시예 16), 및 30분 (실시예 17), 110 ℃로 10분 (실시예 18), 20분 (실시예 19), 및 30분 (실시예 20), 120 ℃로 10분 (실시예 21), 20분 (실시예 22), 30분 (실시예 23), 40분 (실시예 24), 및 50분 (실시예 25), 130 ℃로 5분 (실시예 26), 10분 (실시예 27), 20분 (실시예 28), 30분 (실시예 29), 및 40분 (실시예 30) 동안 각각 마이크로웨이브를 조사한 후 감압건조하여 마이크로웨이브 조사 가공물을 수득하였다. 마이크로웨이브 조사 시 압력은 1 내지 15 기압이었고, 함량 분석은 실험예 1의 분석법에 따라 실시하였다.
실시예 31-38 : 대마의 마이크로웨이브 가공
건조된 대마 잎을 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 2-부탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 및 헥산 용매를 사용하여 마이크로웨이브 가공하였다. 구체적으로는, 2018년 10월에 수확하여 건조 후 세절한 대마 잎 1 g을 미국 CEM 사에서 제조된 마이크로웨이브 조사기 (모델번호 908005)의 40 mL 용기 중에 용매 7 mL를 첨가하고 용기 마개를 닫은 후 300W, 주파수 2450 MHz에서 30분간 가공하였다. 사용한 용매에 따라 마이크로웨이브 가공 온도는 에탄올은 130 ℃ (실시예 31), 부탄올은 130 ℃ (실시예 32), 에틸아세테이트는 130 ℃ (실시예 33), 아세톤은 90 ℃ (실시예 34), 2-부탄온은 100 ℃ (실시예 35), 클로로포름은 130 ℃ (실시예 36), 디클로로메탄은 95 ℃ (실시예 37), 및 헥산은 130 ℃ (실시예 38)로 각각 실시하였다. 마이크로웨이브 조사 시 압력은 5 내지 15 기압이었고, 함량 분석은 실험예 1의 분석법에 따라 실시하였다.
실시예 39-51 : 대마 잎의 마이크로웨이브 가공
건조된 대마 잎을 에틸아세테이트를 사용하여 마이크로웨이브 가공하였다. 구체적으로는, 건조 후 세절된 대마 잎 1 g을 미국 CEM 사에서 제조된 마이크로웨이브 조사기 (모델번호 908005)의 40 mL 용기 중에 에틸아세테이트 7 mL를 첨가하고 용기 마개를 닫은 후 120 ℃로 300W, 주파수 2450 MHz에서 30분 (실시예 39), 60분 (실시예 40), 90분 (실시예 41), 120분 (실시예 42), 및 150분 (실시예 43), 130 ℃로 10분 (실시예 44), 20분 (실시예 45), 30분 (실시예 46), 40분 (실시예 47), 및 50분 (실시예 48), 140 ℃로 10분 (실시예 49), 20분 (실시예 50), 및 30분 (실시예 51) 동안 각각 마이크로웨이브를 조사하였다. 마이크로웨이브 조사 시 압력은 5 내지 15 기압이었고, 함량 분석은 실험예 1의 분석법에 따라 실시하였다.
실험예 1 : 추출물 및 마이크로웨이브 가공물의 칸나비노이드 분석
(1) 실험 방법
CBDA 및 CBD 검증선 값을 기준으로 하여 상기 비교예, 실시예에서 얻어진 대마 잎 추출물과 가공 추출물의 칸나비노이드를 분석하였으며 3회 반복하여 재현성을 확인하였다. 실험에 사용된 CBDA, 및 CBD 단일성분은 대마 잎 원료로부터 직접 분리한 순도 97.1% (CBDA)와 96.3% (CBD)를 사용하였다. 일반적인 검량선 측정 방법에 따라 CBDA와 CBD를 각각 10, 25, 50, 100, 및 250 ppm으로 제조하여 검증선을 작성하였다. UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)에서 사용한 용출 용매인 A는 물이고 용출 용매 B는 아세토니트릴이며, 2개의 펌프를 이용하여 각각 펌핑하여 사용하였다. 상기 표준 수용액 3 ㎕를 시린지(syringe)를 이용하여 분석용 역상 컬럼 (Phenomenex Luna Omega 1.6 μ Polar C18, 150 Х 2.1 mm)에 주입시키고, 70 부피 %의 A, 30 부피 %의 B의 조성을 갖는 용출 용매를 0.3 mL/분의 유속으로 흘렸다. 그 후, 용출 용매 B의 부피 %를 100 % (20 분), 100 % (23 분), 및 30 % (26 분)으로 점차적으로 변화시켰다. 상기 과정 후 컬럼에서 분리된 각 성분을 UV 스펙트럼을 통하여 분석하였다.
(2) 실험 결과
실험 결과, 대마 잎 추출물에 대해 UPLC 분석에 의해 컬럼에서 분리된 각 성분을 UPLC 크로마토그램을 통하여 분석한 결과 도 3-14의 피크를 얻었다.
도 1은 CBDA를 농도 별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 2은 CBD를 농도 별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 3은 원료 대마 잎 추출물의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다. 이하에서 "원료 대마 잎 추출물"은 실시예 1에서 얻어진 에틸아세테이트 용매로 추출한 추출물을 나타낸다.
도 4는 대마 잎 추출물을 80 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 5는 대마 잎 추출물을 90 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 6은 대마 잎 추출물을 100 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 7은 대마 잎 추출물을 110 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 8은 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 9는 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 10은 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 11은 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 40 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 12는 대마 잎 추출물을 120 ℃, 100 W에서 50 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 13은 대마 잎 추출물을 130 ℃, 100 W에서 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 14는 대마 잎을 130 ℃, 100 W에서 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 마이크로웨이브 조사 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 15는 실시예 23 가공물로부터 CBD를 분리하는 과정을 그린 도면이다.
도 16은 실시예 23 가공물의 분획물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 17은 실험예 2에서 분리한 CBD의 순도 확인을 위해 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
또한, 추출 용매에 따른 CBDA와 CBD의 함량 결과를 표 1에 정리하였다.
구분 추출물량 CBDA CBD CBDA+CBD 추출물 내 CBDA+CBD 함량%
비교예 1 166.3 mg 5.62 mg 0.03 mg 5.65 mg 3.40%
실시예 1 84.3 mg 5.96 mg 0.23 mg 6.19 mg 7.34%
실시예 2 90.0 mg 7.70 mg 0.16 mg 7.86 mg 8.73%
실시예 3 86.7 mg 6.66 mg 0.13 mg 6.79 mg 7.83%
실시예 4 115.7 mg 5.87 mg 0.05 mg 5.92 mg 5.12%
실시예 5 112.8 mg 6.09 mg 0.13 mg 6.22 mg 5.51%
실시예 6 83.0 mg 6.16 mg 0.26 mg 6.42 mg 7.74%
실시예 7 70.0 mg 5.17 mg 0.27 mg 5.44 mg 7.77%
표 1은 대마 잎 1g을 8종의 추출용매인 에탄올 (비교예 1), 부탄올 (실시예 1), 에틸아세테이트 (실시예 2), 아세톤 (실시예 3), 2-부탄온 (실시예 4), 클로로포름 (실시예 5), 디클로로메탄 (실시예 6), 및 헥산 (실시예 7)으로 추출하고 각 용매 별 추출물량과 CBDA 및 CBD의 함량을 mg으로 나타내었다. 대마 잎 추출물은 에탄올에서 166.3 mg으로 가장 많았고 2-부탄온 (115.7 mg), 클로로포름 (112.8 mg), 에틸아세테이트 (90.0 mg), 아세톤 (86.7 mg), 부탄올 (84.3 mg), 디클로로메탄 (83.0 mg), 및 헥산 (70.0 mg) 순이다. 하지만 대마의 유효성분인 CBDA와 CBD 합은 에틸아세테이트로 추출할 때 가장 많이 추출되었고 (7.86 mg), 아세톤 (6.79 mg), 디클로로메탄 (6.42 mg), 클로로포름 (6.22 mg), 부탄올 (6.19 mg), 2-부탄온 (5.92 mg), 에탄올 (5.65 mg), 및 헥산 (5.44 mg) 순으로 나타났다. 결국 에탄올을 추출 용매로 사용하였을 때 가장 많은 추출물을 얻을 수 있지만 대마 약학 성분인 CBDA와 CBD를 확보하는 용매로는 적합하지 않은 것으로 나타났다. 하지만 에틸아세테이트를 추출 용매로 사용하였을 때 추출물의 양은 에탄올 추출량의 54 % 수준이지만 CBDA+CBD 량은 39 % 이상 증가된 것으로 나타났다. 부탄올의 경우는 알코올류이기는 하지만 지용성 알콜이기 때문에 비교적 많은 양의 CBDA와 CBD를 얻을 수 있는 추출용매라는 것을 확인하였다. 이로써 대마 잎으로부터 칸나비노이드를 추출하는 가장 좋은 추출 용매는 에틸아세테이트임이 확인되었다.
또한, 대마 잎 추출물의 마이크로웨이브 가공 후 얻어진 UPLC 크로마토그램에서 CBDA와 CBD의 함량을 계산한 결과를 표 2에 정리하였다.
구분 온도(℃)-시간(min) CBDA CBD CBDA+
CBD		 CBD 생성수율* CBD 함량% =
{CBD/(CBDA+CBD)}×100
실시예 8 - 68.2 mg 8.9 mg 77.1 mg 13.0 % 11.5 %
실시예 9 80-10 63.4 mg 13.3 mg 76.7 mg 19.4 % 17.3 %
실시예 10 80-20 59.9 mg 15.5 mg 75.4 mg 22.6 % 20.6 %
실시예 11 80-30 58.0 mg 16.7 mg 74.7 mg 24.3 % 22.4 %
실시예 12 90-10 60.2 mg 16.2 mg 76.4 mg 23.6 % 21.2 %
실시예 13 90-20 52.9 mg 20.9 mg 73.8 mg 30.4 % 28.3 %
실시예 14 90-30 49.1 mg 24.5 mg 73.6 mg 35.7 % 33.3 %
실시예 15 100-10 57.8 mg 18.6 mg 76.4 mg 27.1 % 24.3 %
실시예 16 100-20 47.8 mg 25.7 mg 73.5 mg 37.4 % 35.0 %
실시예 17 100-30 37.5 mg 31.6 mg 69.1 mg 46.0 % 45.7 %
실시예 18 110-10 54.2 mg 19.2 mg 73.4 mg 27.9 % 26.2 %
실시예 19 110-20 43.6 mg 26.9 mg 70.5 mg 39.1 % 38.2 %
실시예 20 110-30 34.6 mg 34.1 mg 68.7 mg 49.6 % 49.6 %
실시예 21 120-10 15.3 mg 50.4 mg 65.8 mg 73.3 % 76.6 %
실시예 22 120-20 4.5 mg 61.3 mg 65.8 mg 89.2 % 93.2 %
실시예 23 120-30 2.6 mg 62.0 mg 64.6 mg 90.3 % 96.0 %
실시예 24 120-40 0.6 mg 61.4 mg 62.0 mg 89.4 % 99.0 %
실시예 25 120-50 0.5 mg 60.9 mg 61.3 mg 88.6 % 99.3 %
실시예 26 130-05 1.7 mg 56.8 mg 58.6 mg 82.7 % 96.9 %
실시예 27 130-10 0.5 mg 55.0 mg 55.5 mg 80.0 % 99.1 %
실시예 28 130-20 0.5 mg 52.6 mg 53.0 mg 76.5 % 99.2 %
실시예 29 130-30 0.1 mg 48.2 mg 48.3 mg 70.1 % 99.8 %
실시예 30 130-40 N.D 45.8 mg 45.8 mg 66.6 % 100.0 %
* CBD 생성수율 = (각 실시예의 생성된 CBD mg / 68.7mg (실시예 8의 100% 생성 CBD 량)×100
표 2는 실시예 8의 대마 잎 추출물을 에틸아세테이트에 녹인 후 마이크로웨이브 조사하고 CBDA 및 CBD 함량을 추출물 1 g 당 mg 단위로 나타냈다. 초기 대마 잎 추출물(실시예 8)에서는 CBDA 68.2 mg, CBD 8.9 mg으로 CBDA가 88.5 %이지만 마이크로웨이브 조사 온도와 시간에 따라 탈카복시산 반응이 일어나면서 CBDA가 CBD로 전환되어 가공물 내 CBD의 함량이 증가하는 것이 확인되었다. 마이크로웨이브 가공 온도는 80 내지 130 ℃까지 10 ℃ 간격으로 실험하였고, 온도에 대한 시간의 영향을 확인하기 위해서 10 내지 50분까지 측정하였다. 결국 가공 온도와 시간이 증가할수록 CBD로 전환되는 양이 증가하는 경향을 보였지만 120 ℃, 30분 이후 실질적인 CBD의 생성수율이 감소하는 경향을 보였고, 130 ℃, 40분에서 CBDA가 모두 CBD로 100% 바뀌었지만 실질적인 CBD 생성수율은 67 %로 나타났다.
또한, 대마 잎을 다양한 추출 용매에 직접 사용하여 마이크로웨이브 가공 후 얻어진 UPLC 크로마토그램에서 CBDA와 CBD의 함량을 계산한 결과를 표 3에 정리하였다.
구분 온도
(℃)		 CBDA CBD CBDA+CBD CBD 함량% =
{CBD/(CBDA+CBD)}*100
실시예 31 130 0.26 mg 4.35 mg 4.61 mg 94.4 %
실시예 32 130 0.37 mg 5.45 mg 5.82 mg 93.6 %
실시예 33 130 0.23 mg 5.89 mg 6.12 mg 96.2 %
실시예 34 90 4.01 mg 2.12 mg 6.13 mg 34.6 %
실시예 35 100 3.02 mg 2.74 mg 5.76 mg 47.6 %
실시예 36 130 0.45 mg 4.42 mg 4.87 mg 90.8 %
실시예 37 95 2.55 mg 1.96 mg 4.51 mg 43.5 %
실시예 38 130 0.24 mg 4.95 mg 5.19 mg 95.4 %
표 3은 대마 잎을 8종의 추출 용매에 넣고 마이크로웨이브로 직접 가공한 추출물의 CBDA와 CBD 함량을 대마 잎 1g 당 mg 단위로 나타내었다. 마이크로웨이브 가공 온도는 130 ℃, 가공 시간은 30분, 300 W의 동일한 조건으로 가공하였다. 다만, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산은 용매의 성질에 따라 마이크로웨이브 가공 온도가 130 ℃에서 수행할 수 있었으나, 아세톤은 90 ℃, 2-부탄온은 100 ℃, 디클로로메탄은 95 ℃의 최대 온도로만 실험할 수 있었다. 최종적인 용매에 따른 마이크로웨이브 가공 결과, 상기의 대마 잎 추출물을 가공한 것과 동일하게 CBDA의 탈카복시산 반응으로 CBD로 전환되는 것이 확인되었으며 또한, 추출 용매를 에틸아세테이트를 사용하여 가공하였을 때가 CBD로 전환되는 양이 5.89 mg으로 가장 좋았다.
또한, 대마 잎을 에틸아세테이트 용매에 직접 사용하여 마이크로웨이브 조사 온도와 시간에 따른 가공물의 UPLC 크로마토그램에서 CBDA와 CBD의 함량을 계산한 결과를 표 4에 정리하였다.
구분 온도(℃)-시간(min) CBDA CBD CBDA+CBD CBD 생성수율 CBD 함량% =
{CBD/(CBDA+CBD)}*100
비교예 1 - 7.70 mg 0.16 mg 7.86 mg 2.3 % 11.5 %
실시예 39 120-30 3.16 mg 3.20 mg 6.36 mg 46.3 % 50.3 %
실시예 40 120-60 1.45 mg 4.84 mg 6.29 mg 70.0 % 76.9 %
실시예 41 120-90 0.81 mg 5.52 mg 6.33 mg 79.8 % 87.2 %
실시예 42 120-120 0.40 mg 5.72 mg 6.12 mg 82.7 % 93.5 %
실시예 43 120-150 0.20 mg 5.59 mg 5.79 mg 80.9 % 96.5 %
실시예 44 130-10 2.17 mg 4.18 mg 6.35 mg 60.5 % 65.8 %
실시예 45 130-20 1.21 mg 4.92 mg 6.13 mg 71.2 % 80.3 %
실시예 46 130-30 0.23 mg 5.89 mg 6.12 mg 85.2 % 96.2 %
실시예 47 130-40 0.21 mg 5.52 mg 5.73 mg 79.8 % 96.3 %
실시예 48 130-50 0.12 mg 5.31 mg 5.43 mg 76.8 % 97.8 %
실시예 49 140-10 0.52 mg 5.64 mg 6.16 mg 81.6 % 91.6 %
실시예 50 140-20 0.08 mg 5.81 mg 5.89 mg 84.0 % 98.6 %
실시예 51 140-30 0.07 mg 5.46 mg 5.53 mg 79.0 % 98.7 %
표 4는 대마 잎을 에틸아세테이트 용매에서 마이크로웨이브 가공한 추출물의 CBDA 및 CBD 함량을 대마 잎 1g 당 mg 단위로 나타내었다. 대마 잎을 마이크로웨이브 가공한 결과 대마 추출물을 가공한 것과 동일하게 CBDA의 탈카복시산 반응에 의하여 CBD로 전환되는 것이 확인되었으며 또한 온도와 가공 시간이 증가할수록 CBD로 전환되는 양이 증가하였다. 130 ℃ 30분 가공하였을 때 CBD 생성수율이 최대가 되었고, CBD 함량이 최대 85 %로 나타났다.
상기 실험 결과, 대마 잎 추출물 및 대마 잎을 에탄올 외 다양한 유기용매를 이용한 마이크로웨이브 조사 시, 원료 대마 잎의 주요 칸나비노이드 성분인 CBDA가 기존 문헌, 학술연구 및 특허 등에서 증명되어 온 약학적 효능이 우수한 CBD로 더욱 효율적으로 변환시킬 수 있었다.
예를 들면, 대마 잎의 주요 칸나비노이드 성분 중량에 대하여 CBD 함량이 20 % 내지 100% 함유된 마이크로웨이브 조사 가공물을 얻을 수 있게 되었다.
실험예 2 : 대마 잎 마이크로웨이브 가공물의 칸나비노이드 분리
(1) 실험 방법
실시예 23에서 얻은 대마 잎의 마이크로웨이브 가공물을 역상 컬럼크로마토그래피를 사용하여 CBD를 고농도로 함유한 분획물을 포함한 7개의 분획으로 분리하였다.
상기 실시예 23의 가공물 1 g을 C18 (Nacalai tesque, Cosmosil C18) 2 g 에 흡착 후 내경이 2.8 cm인 유리 컬럼에 높이 10.0 cm까지 C18을 채우고 메탄올과 물을 혼합한 용매와 에틸아세테이트를 흘려주어 분리하였다. 용출 시킨 용매는 메탄올 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 및 100%와 에틸아세테이트 100 %로 F1 내지 F7인 총 7개의 분획물이다.
분획된 7개의 분획물은 위의 실험예 1 방법으로 분석하였다.
상기에서 얻은 F4 분획물에서 CBD가 분석되어 분리를 시도하였다. 역상 준 분취용 크로마토그래피(고정상 : Phenomenex사 Luna C18(2) 컬럼, 입자크기 10 μm, 길이 250 Ⅹ 10 mm)를 통해 용리액을 초기 아세토니트릴:물=50:50 (v/v)로 전개시켜 60 내지 90분간 유속 4 mL/min으로 아세토니트릴:물=100:0 (v/v)까지 증가시키면서 분리하여 UV 220 nm에서 나타나는 1개의 주요한 피크를 얻었다.
(2) 실험 결과
실험 결과, 실시예 23을 역상 C18 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 7개의 분획물로 분리하였다. 각각의 분획물은 102 mg (분획물 F1), 22 mg (분획물 F2), 28 mg (분획물 F3), 103 mg (분획물 F4), 117 mg (분획물 F5), 339 mg (분획물 F6), 및 103 mg (분획물 F7)을 얻었다. 분획물 F1 내지 F3 및 F5 내지 F7에서는 CBD가 확인되지 않았으나 분획물 F4에서 CBD가 다량 포함되어 있는 것이 확인되었고, 이를 역상 준 분취용 크로마토그래피를 통해 분리한 결과 CBD를 약 58 mg 얻을 수 있었다.
결론적으로, 대마 잎 추출물의 마이크로웨이브 가공물로부터 역상 C18 컬럼 크로마토그래피와 역상 준 분취용 크로마토그래피를 이용한 방법으로 CBD를 분리한 결과 1g의 대마 잎 추출물로부터 마이크로웨이브 조사 CBDA의 탈카복시산 반응을 통해 순도 99.2%의 순수한 CBD 58mg을 제조하는 방법을 개발할 수 있었다.

Claims (20)

  1. 칸나비스 속 식물의 추출물 및 용매를 포함하는 반응 혼합물을 밀폐된 용기 중에서 마이크로웨이브 조사하는 단계로서, 칸나비스 속 식물의 추출물은 CBDA를 포함하고, 상기 칸나비스 속 식물은 잎, 꽃봉오리, 겹털, 화포, 또는 줄기이고 상기 용매는 에틸아세테이트를 포함하는 것이고; 및
    상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 포함하는 칸나비노이드를 분리하는 방법으로서, 상기 마이크로웨이브 조사는 120℃ 내지 130℃에서 5분 내지 40분 동안 2 내지 100 기압하에서 수행하는 것이고, 상기 칸나비노이드는 CBD인 것이고,
    칸나비스 속 식물의 추출물은 에틸아세테이트를 포함하는 용매를 상기 칸나비스 (cannabis sp.) 속 식물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것인 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 칸나비스 속 식물 및 에틸아세테이트를 포함하는 용매를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것인 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 추출물 전체 중량에 대하여 CBDA와 CBD의 함량이 5 중량 % 이상인 것인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 300 MHz 내지 300 GHz의 주파수로 수행하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 50W 내지 6 kW의 전력으로 수행하는 것인 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 청구항 1에 있어서, 분리된 칸나비노이드는 분리물 전체 중량에 대하여 10 내지 100 중량%의 CBD를 포함하는 것인 방법
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
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