KR102346700B1 - 대마로부터 고 함량의 칸나비디올을 대량생산하는 방법 - Google Patents

대마로부터 고 함량의 칸나비디올을 대량생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대마로부터 고 함량의 칸나비디올(CBD)을 대량생산하는 방법에 관한 것으로, 대마를 추출하지 않고, 원물을 그대로 탈카르복실화함으로써, 칸나비디올(CBD)의 손실을 감소시켜, 고 함량의 칸나비디올을 생산할 수 있다는 것으로, 탈카르복실화 단계에서 최적의 온도와 시간 조건을 확립하였으며, 탈카르복실화 이후, 칸나비디올(CBD)을 분리하는 단계에서도 분리조건을 확립함으로써, 칸나비디올의 수득률을 증가시켜 대량생산이 가능하다는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 대량생산 방법으로 생산한 칸나비디올을 다양한 의약 소재로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

대마로부터 고 함량의 칸나비디올을 대량생산하는 방법{Method for mass producing high content of cannabidiol from Cannabis sativa}
본 발명은 대마로부터 고 함량의 칸나비디올을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
대마(Cannabis sativa L.)는 Cannabaceae과에 속하는 일년생 초본으로 중국에서 처음으로 섬유를 얻는 목적으로 기록되었으며, 이후 10,000년 이상 의학적으로 사용되었다. 많은 국가가 의료 목적으로 대마 사용을 허용함에 따라 점점 더 많은 사람이 통증 감소 등을 위해 대마 약물 요법을 사용하고 있다. 대마에는 525개 이상의 화합물이 포함되어 있고, 약 109개의 칸나비노이드(cannabinoid)가 존재하는 것으로 알려져 있다. 칸나비노이드(Cannabinoid)는 대마에서 유일하게 발견된 C21-terpenophenol 화합물을 지칭한다. 잎에도 소량 존재하지만 식물체의 암꽃의 포엽에 분포하는 털(trichome) 부분에 가장 밀집되어 있으며, 'sessile', 'stalked' 두 종류의 trichome 중에 stalked type의 trichome에서 더욱 농도가 높다고 알려져 있다. 이 중 가장 풍부한 칸나비노이드는 Δ9-THC(Δ9-tetrahydrocannabinol) 및 CBD(cannabidiol)이며, Δ9-THC는 주요 향정신성 칸나비노이드이고, 일시적인 정신병 및 불안 증상을 유발한다고 알려져 있다.
또한, 최근에는 알츠하이머 병과 녹내장 치료에 효과적인 것으로 알려졌다. CBD는 항불안 및 항정신질환 등에 효과가 있으며, 1,000종 이상의 CBD 함유 제품이 시중에 판매되고 있고, 정신질환을 치료할 수 있는 차세대 성분으로 알려지고 있다. 중성 칸나비노이드는 산성 전구체 칸나비노이드인 Δ9-THCA 및 CBDA로부터 비효소 반응인 탈카르복실화에 의해 형성되며(도 1), 온도 및 가열시간은 탈카르복실화에서 중요한 영향을 미친다.
한편, 한국공개특허 제2003-0040522호에 대마 식물 물질로부터의 테트라하이드로 칸나비놀, 칸나비디올 및 임의로 그의 카복실산을 포함하는 추출물의 생산 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2226394호에 대마(헴프)에서 고농도 칸나비디올(CBD) 화합물을 추출하는 가공기술이 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2021-0060410호에 칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 분리하는 방법 및 그 용도가 개시되어 있으나, 아직까지 본 발명의 대마로부터 고 함량의 칸나비디올을 대량생산하는 방법이 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 대마로부터 고 함량의 칸나비디올을 대량생산하는 방법을 제공하고, 대마를 추출하지 않고 원물(천연물) 그대로 탈카르복실화한 후, 추출하여 고 함량의 칸나비디올(CBD)을 생산할 수 있는 최적의 조건을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 재배한 대마 원물을 미리 예열된 폐쇄형 오븐에 넣고, 100~150℃에서 20~50분 동안 열처리하여 대마에 포함된 칸나비노이드를 탈카르복실화하는 단계; (2) 상기 단계 (1) 이후에, 대마 1중량부에 대하여, 200~400 중량부의 추출용매를 첨가하고 대마 추출물을 획득하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 획득한 대마 추출물을 여과하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3) 이후에, 상기 여과한 대마 추출물로부터 칸나비디올을 분리하는 단계;를 포함하는 대마로부터 고 함량의 칸나비디올(CBD)의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명의 '대마로부터 고 함량의 칸나비디올(CBD)을 대량생산하는 방법'은 대마 원물로부터 추출물을 제조한 후 탈카르복실화하는 것이 아니라, 원물 자체를 대상으로 하여 탈카르복실화함으로써 칸나비디올(CBD)을 고함량으로 생산할 수 있다는 것이 특징이며, 상기 탈카르복실화 단계에서 온도와 시간에 대한 최적의 조건을 확립하였다.
본 발명의 특징은 재배(생산)된 대마를 대상으로 열처리한 후, 칸나비디올을 분리하는 방법으로써, 대량생산이 가능하다는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 대량생산 방법으로 생산한 칸나비디올을 다양한 의약 소재로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 칸나비노이드의 구조를 나타낸 것으로, (A) CBDA(Cannabidiolic acid)이고, (B) Δ9-THCA(Δ9-tetrahydrocannabinolic acid)이다.
도 2는 온도 및 시간 변화에 따른 대마 화서 분말의 칸나비노이드의 탈카르복실화 정도를 나타낸 것이다. A; 90℃, B; 105℃, C; 120℃, D; 135℃. Blue dot; CBDA, red dot; CBD, green dot; Δ9-THCA, purple dot; Δ9-THC.
도 3은 CBDA 및 Δ9-THCA의 온도별 DT50(time for 50% decarboxylation)를 나타낸 것이다.
도 4는 Δ9-THC(A), Δ9-THCA(B), CBD(C) 및 CBDA(D)의 UV 스펙트럼이다.
도 5는 HPLC에서 이동상이 아세토나이트릴(A), 메탄올(B) 및 물(C)일 때의 190~300nm의 파장에서 흡광도 스펙트럼이다.
도 6은 0.1% FA(formic acid), 0.05% TFA(trifluoroacetic acid) 및 0.1% PA(phosphoric acid)를 포함하는 유기산 조건에 따른 HPLC 스페트럼이다.
도 7은 표준품을 이용하여 CBDA, CBD, Δ9-THC 및 Δ9-THCA의 선형성을 확인한 결과이다.
도 8은 대마 품종별, 135℃에서 5~30분 동안 탈카르복실화에 의해 생성되는 CBD 및 Δ9-THC의 함량을 비교한 것으로, (A) 및 (C)는 CW21-13 품종이고, (B) 및 (D)는 RDA-35 품종이다.
본 발명은 (1) 재배한 대마 원물을 미리 예열된 폐쇄형 오븐에 넣고, 100~150℃에서 20~50분 동안 열처리하여 대마에 포함된 칸나비노이드를 탈카르복실화하는 단계; (2) 상기 단계 (1) 이후에, 대마 1중량부에 대하여, 200~400 중량부의 추출용매를 첨가하고, 대마 추출물을 획득하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 획득한 대마 추출물을 여과하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3) 이후에, 상기 여과한 대마 추출물로부터 칸나비디올을 분리하는 단계;를 포함하는 대마로부터 고 함량의 칸나비디올(CBD)의 대량생산 방법에 관한 것이다.
상기 대마는 CW21-13 또는 RDA-35 품종인 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다. 상기 단계 (2)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출이지만 이에 한정하는 것은 아니다. 추출온도 및 시간은 당 업계에서 사용되는 통상의 조건을 적용할 수 있으므로 특별히 한정하지 않는다. 상기 단계 (4)에서, 대마 추출물로부터 칸나비디올의 분리는 HPLC를 이용하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 상기 HPLC의 이동상으로 아세토나이트릴과 물을 사용하며, 유속이 1.0~2.0㎖/min이고, 상기 이동상에는 TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 대량생산 방법에 있어서, (1) 재배한 대마 원물(천연물)을 미리 예열된 폐쇄형 오븐에 넣고, 135℃에서 30분 동안 열처리하여 대마에 포함된 칸나비노이드를 탈카르복실화하는 단계; (2) 상기 단계 (1) 이후에, 대마 1중량부에 대하여, 200~400 중량부의 메탄올을 첨가하고 대마 추출물을 획득하는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 획득한 대마 추출물을 여과하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3) 이후에, 상기 여과한 대마 추출물로부터 칸나비디올을 분리하는 단계;를 포함하는 대마로부터 고 함량의 칸나비디올(CBD)의 대량생산 방법이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
1. 실험재료
시료는 한국대마유전자원센터(강원도 춘천시)에서 수령한 대마(Cannabis sativa L.)의 화서(inflorescence) 부분으로, 파종 후 양액재배 시스템에서 105일 (개화처리 후 50일 후)동안 키워진 식물의 화서(inflorescence) 시료를 사용하였다.
칸나비디올(cannabidiol; CBD) 및 Δ9-테트라하이드로칸나비놀(Δ9-Tetrahydrocannabinol; Δ9-THC) 표준품은 CAYMAN(Ann Arbor, MI, USA)사에서 구입하였고, 칸나비디올산(cannabidiolic acid; CBDA) 표준품은 Cerilliant (Round Rock, TX, USA)사에서 구입하였으며, Δ9-THCA(Δ9-Tetrahydrocannabinolic acid) 표준품은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
본 발명에서 사용된 표준품과 시료는 서울지방식품의약품안전처의 승인(승인번호: 1806)을 받아 수령 및 실험하였다.
본 발명은 마약류 취급자(학술연구자)허가 (승인번호: 서울-1806)와 마약류, 원료물질취급승인(식품의약품안전처 마약정책과-4789) 하에서 이루어졌다.
2. HPLC 분석조건
HPLC는 Shimadzu사의 LC-20AT 시스템을 사용하였으며, Detector는 SPD-20A (UV-Vis, Shimadzu Co., Kyoto, Japan), 칼럼(Column)은 Zorbax SB-C18(Rapid 해상도, 4.6×100㎜, 3.5㎛, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA), 용매는 HPLC 등급의 초순수와 메탄올(CH3OH), 아세토나이트릴(C2H3N)을 Mallinckrodt Baker (Phillipsburg, NJ, USA)사에서 구매하여 사용하였다. Δ9-THC, Δ9-THCA, CBD 및 CBDA 표준품은 각각 최종 농도 100㎍/㎖으로 혼합하여 분석조건 설정을 진행하였다.
각 성분의 흡광 영역을 파악하기 위해 190~400nm의 UV(ultra-violet) 영역에서 흡광도를 측정하였으며, 용매의 컷오프(cut-off) 구간을 회피하기 위해 메탄올과 아세토나이트릴의 스펙트럼도 동일한 구간에서 측정하였다.
초순수와 선정된 유기용매의 이동상을 60, 70, 80 및 90%의 농도별로 조합 후 분석하여 1차 선정한 후, pKa를 조절하여 첨도(kurtosis) 및 왜도(skewness)를 개선하기 위해 포름산(Formic acid; FA, , Merck, Darmstadt, Germany), TFA(trifuluroacetic acid, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), PA(phosphoric acid, Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 각각 0.01%, 0.05%, 0.10% 첨가하여 최적의 이동상 조건을 탐색하였다. 이동상은 binary 펌프로 시간적으로 유리하며 재연성이 뛰어난 농도구배를 채택하였다.
3. 분석조건 확립을 위한 검증
상기 확립한 분석조건의 적합성을 판단하기 위해 시스템 적합성 테스트(system suitability test), 특이성(specificity), 선형성(linearity), 범위(range), 정확도(accuracy), 정밀도(precision), 검출한계(detection limit) 및 정량한계(quantitation limit)를 ICH(International Council of Harmonization) 가이드라인 Q2 (R1)(2005) 항목을 참고하여 진행하였으며, USP(United States Pharmacopeia)의 기준에 따라 시스템 적합성 여부를 판단하였다.
4. 대마 화서의 탈카르복실화 상관관계 규명
동결건조한 대마의 화서(Inflorescence)는 KCL(Korea Conformity Laboratories)의 인증을 받은 차퍼(chopper)(YPT-1402, Young polymer tech Co., Incheon, Korea)를 사용하여 분쇄하였고, 테스트 체(test sieve)를 사용하여 입자를 12메쉬 크기로 균질화하였다.
분쇄된 시료를 미리 예열된 폐쇄형 건조 오븐(Sungchan science Co., Pocheon, Korea)에 넣어 60분 동안, 5분 간격으로 샘플링하였다. 온도 조건은 90℃, 105℃, 120℃ 및 135℃를 사용하였다.
한편, 비교예로 사용하기 위하여, 대마 시료 0.1g을 30㎖의 초순수급 메탄올(Daejung chemicals and metals Co., Ltd., Siheung, Korea)을 추출용매로 녹인 후, 초음파(JEIO TECH Co., ltd., Daejoen, Korea)을 사용하여 30분 동안 상온(23±2℃)에서 초음파 추출한 후, 상층액을 대마 추출물로 획득하였다. 0.45㎛ 주사 필터(Advantec, Tokyo, Japan)를 사용하여 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다.
본 발명에서는 대마 추출물과 원물(천연물, 추출하지 않은 대마 자체)의 탈카르복실화 비교를 위하여, 2가지의 다른 품종의 대마 추출물을 추가로 제조하였으며, 상기 추출방법을 적용하여 추출하였고, TOKYO RIKAKIKAI 사의 회전증발기를 사용하여 30℃에서 농축하였다. 추가적인 수분을 제거하기 위해 동결건조기(FD8512, IlShinBioBase Co., Ltd., Dongducheon, Korea)를 사용하여 수분을 제거하였으며, 용매를 추가하지 않은 상태로 135℃에서 30분 동안 원물(천연물)과 함께 탈카르복실화하였으며, 이후 메탄올로 추출하여 분석에 사용하였다.
실시예 1. 대마 화서(inflorescence)의 탈카르복실화 조건 확립
(1) 온도 및 시간 조건
대마 탈카르복실화의 주요 인자는 열로 알려져 있어, 대마 화서 분말을 이용하여 온도와 가열 시간에 따른 탈카르복실화를 분석하였다.
그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 온도별 산성 형태의 칸나비노이드(acid form cannabinoid)의 감소 및 중성 형태의 칸나비노이드의 증가를 확인할 수 있었고, 탈카르복실화 반응은 온도가 높을수록, 시간이 증가할수록 가속화되었다. 가열하는 동안 산화되는 칸나비노이드 및 자연적으로 생성된 중성 칸나비노이드의 인자를 제거하며 정확한 탈카르복실화 속도를 평가하기 위하여 DT50(산성 칸나비노이드가 절반으로 감소한 시점; half-life) 이라는 인자를 선택하였다.
한편, 산성 칸나비노이드의 DT50 값은 원물(천연물)과 추출물 모두 유의미한 차이가 없어, 원물(천연물)과 추출물의 탈카르복실화 속도에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 하지만, 135℃에서 30분이 지났을 때, 원물(천연물)의 중성 칸나비노이드의 수율이 추출물에 비해 유의미하게 증가하였다.
DT50은 90℃에서 CBDA, Δ9-THCA 모두 60분 이내에 이루어지지 않았고, 105℃에서는 CBDA; 44.4, Δ9-THCA; 39.1로 5.3의 차이, 120℃는 CBDA; 32.6, Δ9-THCA; 27.3으로 5.3의 차이, 135℃는 CBDA; 25.8, Δ9-THCA; 21.1로 4.7의 차이를 보였다.
탈카르복실화는 Δ9-THCA가 CBDA보다 동일 온도에서 DT50 값이 약 5.1±0.3 만큼 작았으며, 이는 우리의 동일한 조건에서 Δ9-THCA가 CBDA보다 탈카르복실화가 더 빠르게 이루어진 것을 확인하였다(도 3).
실시예 2. HPLC 분석 조건 확립
표준용액의 UV 영역 흡광도 스펙트럼을 측정하여 mAU 값을 통해 상대적으로 비교한 결과, Δ9-THC는 210.50㎚에서, Δ9-THCA는 221.24㎚에서, CBD는 209.09㎚에서, CBDA는 221.51㎚에서 최대 흡광도를 가지고 있었다(도 4).
산성 전구체 형태의 칸나비노이드가 자외선 영역에서 비교적 낮은 흡광도를 가지고 있었다. 또한, 이동상의 cut-off 구간을 확인하여 선정된 파장에서 분석이 용이한 지 판단하였다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물(water)은 220㎚에서 baseline보다 낮거나 유사한 흡광도를 나타내었고, 메탄올(methaol)은 baseline에 비하여 다소 높은 흡광도를 가지고 있었다. 피크 검출 민감도, 용매의 흡광 회피와 동시 분석 조건에 부합하기 위하여 220㎚의 흡광도를 최적 파장대로 선정하였으며, 유기 이동상은 아세토나이트릴을 선정하였고, tailing이 일어나면 첨도가 불안정해지므로, 최대한 영향이 적은 유속인 1.5㎖/min으로 설정하였다.
수기용매는 물, 유기용매는 아세토나이트릴(ACN)을 사용하여 물, 60%(v/v), 70%(v/v), 80%(v/v) 및 90%(v/v) 아세토나이트릴의 등용매 방법(isocratic method)으로 40분 동안 분리한 결과, 60%(v/v) 아세토나이트릴의 경우, 40분 내에 마지막에 용출되는 Δ9-THCA가 검출되지 않았으며, 70%(v/v) 아세토나이트릴을 용매로 사용하는 경우, 머무름 시간(RT)이 10.314(Δ9-THCA)이고, 80%(v/v) 아세토나이트릴을 용매로 사용하는 경우는 RT=5.922(Δ9-THCA)이며, 90%(v/v) 아세토나이트릴을 용매로 사용하는 경우는 RT=3.059(Δ9-THCA)로 확인되었다. 90%(v/v) 아세토나이트릴을 용매로 사용하는 경우를 제외한 모든 spike된 표준품의 피크는 분리되었으나, 80%(v/v) 이상의 아세토나이트릴을 용매로 사용하는 경우, CBDA의 피크가 갈라지는 현상이 있으므로, 70%(v/v)의 아세토나이트릴 비율을 최적 용매로 선정하였다.
CBDA 및 Δ9-THCA과 같은 음전하의 카르복실기를 가지고 있는 화합물의 pH와 pKa 값의 차이에 따른 heading과 tailing을 방지하기 위하여 이동상에 유기산을 처리하였다. 유기산은 0.05%(w/v)의 TFA(trifluoroacetic acid), 0.10%(w/v)의 PA(phosphoric acid), 0.10%(w/v)의 FA(formic acid)가 선정되었고, 분석 중간지점의 유기용매의 비율을 늘려주어 목적 성분들의 분리능을 유지하며, 머무름 시간(retention time: RT)을 단축시킨 농도구배(gradient) 조건(0~2분; 70%(v/v), ACN, 2~10분; 85% ACN, 10~19분; 70% ACN, 19~31분; 70% ACN)으로 분석하였을 때, FA는 유기용매 비율이 늘어남에 따라 흡광도 기준선(baseline)의 상승이 가장 심하게 나타났으며, PA는 LC-MS 혹은 LC-QToF 등의 질량 분석기의 호환성이 떨어지므로 TFA를 최적의 유기산으로 채택하였다(도 6).
(1) 시스템 적합성 테스트(System Suitability Test)
표준 저장 용액(Standard stock solution)을 제조하여 4가지의 표준품을 혼합하여 동일 농도로 9회 측정하였다. 머무름 시간은 4가지 칸나비노이드 모두 RSD%가 2.00%를 넘지 않았고, 피크면적(peak area)도 1.00% 이하였다. Taling factor는 2.0 이하였고, theoretical plate number는 모두 1000 이상의 값을 가져 USP 기준에 모두 부합되었다. 해상도(분리능)는 머무름 시간이 유사한 CBDA, CBD 및 Δ9-THC, Δ9-THCA를 비교하였다(표 1).
칸나비노이드 평균값±표준편차 RSD%
머무름 시간(분) CBDA 3.386±0.004 0.118
CBD 4.207±0.005 0.119
Δ9-THC 7.419±0.006 0.081
Δ9-THCA 8.808±0.008 0.076
피크 면적 CBDA 1773858±5000 0.282
CBD 475916±2567 0.539
Δ9-THC 1247380±8270 0.663
Δ9-THCA 1501031±7258 0.484
Tailing factor CBDA 1.40±0.008 -
CBD 1.34±0.010 -
Δ9-THC 1.38±0.005 -
Δ9-THCA 1.39±0.007 -
Theoretical plate number CBDA 5963±38 -
CBD 6897±45 -
Δ9-THC 18614±30 -
Δ9-THCA 25698±187 -
해상도(분리능) CBDA 4.038±0.011 -
CBD
Δ9-THC 5.986±0.008 -
Δ9-THCA
(2) 직선성(Linearity)
직선성을 테스트하기 위하여, 20, 40, 80, 160, 320 및 640㎍/㎖의 농도로 표준품을 제작하여 상기 확립한 분석 조건으로 측정하여 보정곡선(calibration curve)를 작성하였다. 평가된 보정곡선 CBDA, CBD, Δ9-THC 및 Δ9-THCA의 R2는 각각 0.9916, 0.9993,0.9954 및 0.9994로, 매우 우수한 선형성(R2 ≥ 0.9900 이상)을 기록하였다.
하지만 CBDA와 Δ9-THC의 경우 최대농도인 640㎍/㎖을 제거하였을 때, 각각 R2 = 0.9999, 0.9986이었으며, 이는 보정곡선 특성상 Beer-lambert 법칙에 위배되는 고농도로 판단되었으며, 정량분석에서 640㎍/㎖은 제외시켜 분석함으로써, 신뢰성이 있는 정량적 결과를 확보하였다(도 7).
(3) 정밀도(Precision)
분석방법의 정밀성을 확립하기 위하여 5 반복으로 2일에 걸쳐 intra-day 및 inter-day 분석을 하였다. Intra-day CBDA의 RSD%는 0.053~0.157, CBD의 RSD%는 0.641~1.203, Δ9-THC의 RSD%는 0.689~1.329, Δ9-THCA의 RSD%는 0.424~0.486 수준이었으며, inter-day 결과에서도 CBDA의 RSD%는 0.181, CBD의 RSD%는 1.944, Δ9-THC의 RSD%는 1.018, Δ9-THCA의 RSD%는 0.590으로 정밀도가 우수한 것으로 나타났다.
(4) 검출한계(Detection limit) 및 정량한계(Quantitation limit)
검출한계 및 정량한계는 10.0ppm, 1.0ppm, 0.5ppm 및 0.1ppm의 낮은 농도의 표준품을 사용하여 측정하였다. 검출한계는 S/N(signal/noise) 값이 최소 3.000일 때 유효하다고 판단하였으며, CBDA는 <0.1ppm (S/N: 10.181), CBD는 <0.5ppm (S/N: 6.985), Δ9-THC는 <0.5ppm (S/N: 16.654), Δ9-THCA는 <0.5ppm(S/N: 28.372)으로 나타났다. 정량한계는 S/N 값이 최소 10.000일 때 유효하다고 판단하였으며, CBDA는 <0.1ppm (S/N: 10.181), CBD는 <1.0ppm (S/N: 13.272), Δ9-THC는 <0.5ppm (S/N: 16.654), Δ9-THCA는 <0.5ppm(S/N: 28.372)으로 모든 칸나비노이드는 0.5ppm 이하에서 감지되었으며, 1.0ppm 이하에서 정량이 가능한 수준이었다.
실시예 3. 원물(천연물)과 추출물의 중성 칸나비노이드 수득율 비교
대마 품종 중에서 무작위로 선별된 CW21-13과 RDA-35 품종을 사용하여 가공하지 않은 대마 원물(천연물)과 대마 추출물의 중성 칸나비노이드의 수득량을 비교하였다.
각각의 시료를 135℃에서, 5~30분 동안 열처리하여 탈카르복실화 한 후, 상기 실시예 2에서 확립한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 조건으로 분석하였다(표 2). HPLC 장비는 시마즈 시스템(Shimadzu LC-20AT HPLC system)을 사용하였으며, 고정상은 Zorbax SB-C18(4.6×100㎜, 3.5㎛), 이동상 A는 0.05% TFA(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물을 사용하였고, 이동상 B는 0.05% TFA를 함유하는 아세토나이트릴(ACN)을 사용하였다. 이동상은 농도구배를 적용하여 0분; 70% 이동상 B, 2분; 70% 이동상 B, 8분; 85% 이동상 B, 9분; 70% 이동상 B, 12분; 70% 이동상 B로 조정하였다. 4가지 칸나비노이드 모두 자외선-가시광선 검출기로 파장 220nm로 고정하여 측정하였으며, 유속은 1.5㎖/min로 하였고, 주입량은 10㎕로 하였으며, 컬럼오븐의 온도는 산성 형태의 칸나비노이드의 파괴를 방지함과 동시에 머무름 시간을 줄이기 위해 35℃로 설정하였다.
HPLC 조건
장비 Shimadzu LC-20AT HPLC system
칼럼 Zorbax SB-C18(4.6×100㎜, 3.5㎛)
검출기 UV-VIS detector(220㎚)
이동상 A 0.05% TFA를 포함하는 H2O
이동상 B 0.05% TFA를 포함하는 아세토나이트릴
유속 1.5 ㎖/min
오븐 온도 35℃
주입량 10㎕
농도구배 조건
시간 이동상 A(%) 이동상 B(%)
0~2분 30 70
2~4분 30 70
4~12분 15 85
12~21분 30 70
21~32분 30 70
그 결과 표 3 및 도 8에 개시한 바와 같이, CW21-13 품종의 CBD 및 Δ9-THC 수율은 최종시점을 비교하였을 때, 원물(천연물)이 추출물보다 각각 약 3.4배, 4.0배 높았고, RDA-35 품종의 CBD 및 Δ9-THC 수율도 각각 약 3.1배, 약 5.1배 높은 것으로 나타나 두 품종 모두 중성 칸나비노이드의 열적 파괴가 추출물보다 원물(천연물)에서 현저히 적게 발생한다는 것을 확인하였다.
135℃에서, 30분 동안 열처리하여 탈카르복실화 한 후 획득한 대마 추출물 및 원물(천연물)의 중성 칸나비노이드 수율
CW21-13 RDA-35
원물(천연물) 추출물 원물(천연물) 추출물
CBD 33,786㎍/㎖ 10,046㎍/㎖ 19,756㎍/㎖ 6,306㎍/㎖
Δ9-THC 956㎍/㎖ 235㎍/㎖ 792㎍/㎖ 155㎍/㎖
시각적인 평가에서도 추출물은 시간이 지나면서 중성 칸나비노이드가 증가하였다가 후반에는 감소하는 반면, 원물(천연물)은 실험의 종말점인 30분의 지점에도 계속 상승하거나 감소하지 않는 양상을 가지고 있었다. 추출물에서는 동일 온도와 시간에서 CBD 계열이 THC 계열보다 손실이 컸고, 이는 대마를 추출하여 탈카르복실화 과정을 거치는 것보다 원물(천연물)로 탈카르복실화를 수행하는 것이 CBD의 산화적 전환 및 파괴를 감소시키는데 유리하다고 판단하였다.

Claims (6)

  1. (1) 재배한 대마 원물을 미리 예열된 폐쇄형 오븐에 넣고, 135℃에서 30분 동안 열처리하여 대마에 포함된 칸나비노이드를 탈카르복실화하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1) 이후에, 대마 1중량부에 대하여, 200~400 중량부의 메탄올을 첨가하고 대마 추출물을 획득하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에서 획득한 대마 추출물을 여과하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3) 이후에, 상기 여과한 대마 추출물로부터 칸나비디올을 분리하는 단계;를 포함하는 대마로부터 칸나비디올(CBD)을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대마는 CW21-13 또는 RDA-35 품종인 것을 특징으로 하는 대마로부터 칸나비디올(CBD)을 생산하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (4)에서, 대마 추출물로부터 칸나비디올의 분리는 HPLC를 이용하는 것을 특징으로 하는 대마로부터 칸나비디올(CBD)을 생산하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 HPLC의 이동상으로 아세토나이트릴과 물을 사용하며, 유속이 1.0~2.0㎖/min이고, 상기 이동상에는 TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 대마로부터 칸나비디올(CBD)을 생산하는 방법.
  6. 삭제
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