KR20210040710A - 칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 연속으로 제조하는 방법 및 그 용도 - Google Patents

칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 연속으로 제조하는 방법 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대마 추출물의 연속식 마이크로웨이브 처리를 통해 탈카복실산 반응을 유도하여 CBD의 함량이 증가된 효율적이고 경제적인 대마 가공물의 제조 방법 및 그에 의하여 생산된 CBD 함량이 증가된 가공물, 분획물 및 CBD 단일성분의 식품, 의약품, 화장품용 용도를 제공하는 것이다.

Description

칸나비스 식물로부터 칸나비디올을 연속으로 제조하는 방법 및 그 용도{Method of continuously producing cannabidiol from Cannabis sp. and uses thereof}
본 발명은 마이크로웨이브를 이용하여 대마 및 그의 추출물로부터 칸나비디올(CBD)의 함량을 증가시키는 연속식 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
대마(大麻, Cannabis sativa L.)는 중앙 아시아를 중심으로 12,000년 전부터 열대와 온대지방에서 널리 재배된 삼과(Cannabaceae) 대마속의 한해살이 식물로 야생삼을 포함하며, 의·약학적 성분으로 알려진 다양한 종류의 칸나비노이드 화합물을 함유하는 칸나비스 케모바스(cannabis chemovars)와 그의 변형체, 변종 var. indica 및 var. kafiristanica를 포함한 칸나비스 사티바 서브스페시스 사티바(Cannabis sativa subspecies sativa), 칸나비스 사티바 서브스페시스 인디카(Cannabis sativa subspecies indica), 칸나비스 사티바 서브스페시스 루데라리스(Cannabis sativa subspecies ruderalis) 및 유전 교배, 자기 교배 또는 그의 교잡 식물을 통칭해서 말한다.
중국을 비롯한 한국의 전통 의약서에서는 대마 종자의 껍질을 제거한 마자인(麻子仁) 또는 화마인(火麻仁)이 변비, 당뇨, 통증질환, 월경불순, 피부질환 및 이질 등에 사용되어 왔고, 삼잎인 대마초(大麻草, 마엽(麻葉))는 구충제, 모발보호, 천식, 진통작용, 마취, 이뇨제 등으로 사용한 바 있다. 또한 마근(麻根)은 난산 치료와 어혈 해소에, 마피(麻皮)는 타박상과 열림창동에, 마화(麻化)는 마비증상과 가려움증 등에 사용했으며, 마분(麻賁)은 난산, 변비, 통풍, 진관, 불면 등에 대마의 각 부위에 따라 병증에 맞게 사용한 기록들이 전해진다.
대마에는 약 400여 개의 화합물이 있으며, 그 중 대부분이 칸나비노이드(cannabinoids)와 테르펜(terpene), 페놀류 화합물(phenolic compounds)이고 이중 의·약학적 중요 천연 성분인 칸나비노이드류는 90여 가지로 대마에서만 발견되는 성분도 다수 있다.
대마의 칸나비노이드류 중 향정신성 성분은 △9-테트라히드로칸나비놀(△9-tetrahydrocannabinol, △9-THC)이고, 칸나비디올(cannabidiol, CBD)은 비향정신성 성분으로 아드레날린 수용체 및 칸나비노이드 수용체를 비롯한 인체 내 다양한 수용체를 통해 생리활성 효과를 나타내는 성분으로 알려져 있다.
특히, 과학자들이 대마의 향정신성 작용 기전을 연구하던 중 1988년 뇌에서 칸나비노이드가 선택적으로 결합하는 수용체를 발견하였다. 이는 우리 몸에서도 칸나비노이드와 유사한 분자가 만들어지고 있고 이러한 칸나비노이드류 분자는 뇌의 국소부위에서 만들어지는 지방산 형태의 신경전달물질로 아난다마이드(anandamide)라고 한다. 현재까지 알려진 칸나비스 수용체는 두 종류로 나뉜다. CB1 수용체는 대뇌피질, 해마, 소뇌, 기저핵 등 뇌의 전반에 걸쳐 분포하고 있다. CB2 수용체는 대식세포나 골수, 폐, 췌장, 평활근 등 말초조직에 주로 분포하여 면역계와 관련성이 깊다.
THC는 약용으로 사용되는 대마의 주요한 유효성분이다. THC는 CB1 수용체에 강한 친화력을 가진 작용제로 이것이 향정신성 작용을 나타내는 주요 기전으로 알려져 있다. CBD는 수많은 연구결과를 통해 항염증작용, 항간질작용, 진토작용, 항암작용 등 유익한 작용을 갖는다고 알려져 있다. CBD는 또한 THC로 인한 부작용을 줄이고, THC와 같은 CB1과 CB2 수용체의 작용제에 대한 길항작용을 통해 내인성 칸나비노이드인 아난다마이드의 재흡수 및 분해를 억제하는 동시에 세로토닌 수용체에 대하여 작용제로서 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 이 밖에도 대마 성분 중 칸나비크로민(cannabichromene)은 항염증, 진정작용, 항진균작용 등이, 칸나비놀(cannabinol, CBN)은 CB1보다는 CB2 수용체와 결합하여 면역기능 향상에 도움이 된다고 밝혀지는 등 대마 함유 성분들에 대한 약학적 기전 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.
Figure pat00001
△9-테트라히드로칸나비놀, △9-THC
Figure pat00002
△8-테트라히드로칸나비놀, △8-THC
Figure pat00003
△9-테트라히드로칸나비놀산, △9-THCA
Figure pat00004
칸나비놀, CBN
Figure pat00005
칸나비노디올, CBND
Figure pat00006
칸나비디올, CBD
Figure pat00007
칸나비디올산, CBDA
미국에서 식품의약국(Food and Drug Administration, FDA)이 승인한 THC 경구용 약품인 드로나비놀(dronabinol, 상품명 Marinol)과 나빌론(nabilone, 상품명 Cesamet)이 항암치료 부작용 완화와 에이즈환자 식욕촉진제로 판매되고 있으며, CBD를 주성분으로 하는 액상 약물인 에피디오렉스(Epidiolex)가 소아 간질에, CB2 수용체 결합 합성 칸나비노이드 제제인 레수납(Resunab)이 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus) 치료에, 단일 THC와 CBD 약물이 아닌 대마 추출물 형태의 칸나도르(Cannador, THC:CBD=2:1)가 다발성 경화증 및 심각한 만성 통증 질환에 대한 임상실험을 하는 등 광범위하고 활발히 연구가 진행 중이다.
이에 본 연구자들은 지금까지 축적해온 마이크로웨이브 가공기술을 이용한 대마의 주요 약학 성분에 대한 추출 수율 증대 및 CBD의 함량을 높이는 기술을 개발하던 중 반응 혼합물을 연속으로 흘려 주면서 마이크로웨이브 탈카복시산 반응을 통해서 CBDA로부터 CBD가 손쉽게 전환됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 칸나비스 속 식물 또는 그 추출물로부터 칸나비노이드를 분리하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효 성분으로 포함하는 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 따른 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물을 제공한다.
일 양상은 CBDA를 포함하는 시료 및 용매를 포함하는 반응 혼합물을 반응용기 중에서 마이크로웨이브 조사하는 단계로서, 상기 마이크로웨이브 조사는 상기 반응 혼합물을 반응용기 유입구로부터 반응용기 유출구를 통하여 흘려 주면서 수행하는 것인 단계를 포함하는 칸나비노이드를 연속적으로 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. CBDA를 포함하는 시료는 CBDA를 포함하는 식물, 예를 들면, 칸나비스 속 식물, 또는 그 추출물일 수 있다. 상기 시료는 시료 중량에 대하여 1, 3, 5, 10, 15, 20% 이상의 CBDA를 포함하는 것일 수 있다.
일 양상은 칸나비스 속 식물 또는 그 추출물 및 용매를 포함하는 반응 혼합물을 반응용기 중에서 마이크로웨이브 조사하는 단계로서, 상기 마이크로웨이브 조사는 상기 반응 혼합물을 반응용기 유입구로부터 반응용기 유출구를 통하여 흘려 주면서 수행하는 것인 단계를 포함하는 칸나비노이드를 연속적으로 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 반응용기는 관 형상으로서 반응 혼합물이 흐르는 방향의 길이가 높이보다 긴 것일 수 있다. 상기 높이는 반응 혼합물이 흐르는 방향과 수직인 방향의 길이일 수 있다. 상기 흐르는 방향의 길이는 상기 높이보다 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 50, 100, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000, 0.5 내지 10,000, 1.0 내지 10,000, 5 내지 10,000, 10 내지 10,000, 100 내지 10,000, 또는 1000 내지 10,000배인 것일 수 있다. 상기 높이는 0.01 내지 3.0 cm일 수 있다. 상기 높이는 관의 내경(inside diameter)일 수 있다. 또한, 상기 흐르는 방향의 길이는 1.0 내지 30,000 cm일 수 있다. 상기 반응용기는 적어도 일부 또는 그 전체가 마이크로웨이브 투과성 또는 반-투과성(semi-transparent) 물질로 된 것일 수 있다. 마이크로웨이브 투과성 물질(microwave transparent material)이란 마이크로웨이브 발생기로부터 조사된 마이크로웨이브 에너지의 실질적 부분(substantial portion)을 통과시켜 반응용기 내부에 도달할 수 있도록 하는 물질을 나타낸다. 상기 마이크로웨이브 투과성 물질은 예를 들면, 열가소성 플라스틱(thermoplastic), 유리, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 투과성 물질은 유리-채워진 테플론, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 및 퍼플루오로알콕시 알칸(perfluoroalkoxy alkanes, PFA)과 같은 테플론, 폴리(메틸 메타크릴레이트, PMMA), 폴리에테르이미드(polyetherimide, PEI), 알루미늄 옥시드, 유리 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 반응용기는 유입구 및 유출구를 포함하고, 상기 유출구에는 유체가 흐를 수 있는 채널이 연결되어 있고, 상기 채널에는 각각 유체에 압력을 가할 수 있는 펌프 및 압력 조절기(back pressure regulator)가 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 압력 조절기는 역 압력 조절기일 수 있다. 상기 반응용기는 상기 반응용기 내의 온도를 조절하기 위한 온도 조절 장치에 연결된 것일 수 있다. 상기 온도 조절 장치는 상기 반응용기가 포함된 챔버로서 액체 매질이 포함된 것일 수 있다. 상기 반응용기에 포함된 반응혼합물에 마이크로웨이브를 조사하는 데 있어서, 상기 마이크로웨이브가 상기 반응용기가 포함된 상기 챔버를 통과하여야 하는 경우, 상기 챔버는 마이크로웨이브 투과성 재질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 챔버는 상기 반응용기, 예를 들면, 길죽한 관 또는 튜브를 포함하는 것이면 어느 형태든 가질 수 있다.
상기 액체 매질은 반응용기에 열을 전달할 수 있는 것이 된다. 상기 액체 매질은 상기 반응 혼합물 중 용매와 같을 수 있다. 또한, 상기 액체 매질은 물, C5-C10 알콜, C2-C6 디올(diol), C3-C6 트리올(triol), 그의 폴리머, 또는 그의 혼합물일 수 있다.
상기 반응용기의 유입구는 유체가 흐를 수 있는 채널이 연결되어 있어, 시료 또는 용매를 연속으로 도입할 수 있도록 된 것일 수 있다. 그에 따라서, 유입구로부터 유출구로 반응혼합물을 연속으로 흘려주고, 흘려주는 동안 마이크로웨이브를 조사함으로써 CBD를 연속으로 생산할 수 있다.
따라서, 상기 반응용기는 온도 조절기에 연결된 것일 수 있다. 상기 온도 조절기는 상기 반응용기가 관통하여 연결되어 있고, 액체를 담을 수 있는 온도 조절 챔버를 포함하는 것인일 수 있다. 상기 온도 조절 챔버는 마이크로웨이브 투과성 물질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 온도 조절 챔버는 마이크로웨이브 투과성을 가질 수 있다.
상기 반응용기는 그 내부의 반응혼합물에 마이크로웨이브가 조사될 수 있도록 마이크로웨이브 발생장치에 연결된 것일 수 있다. 마이크로웨이브 발생장치는 예를 들면, 상업적으로 이용한 가능한 것일 수 있다. 마이크로웨이브 발생장치는 예를 들면, CEM 사 마이크로웨이브 반응기(model no. 908005)일 수 있다. 상기 반응용기는 유입구 및 유출구에 유체 소통가능하게 연결된 채널을 포함할 수 있다. 상기 채널은 펌프가 연결되어 있어 유체 흐름을 조절할 수 있다.
상기 반응용기는 또한 물질을 검출하기 위한 검출기에 연결된 것일 수 있다. 상기 검출기는 적외선(IR) 센서, HPLC, MS 등을 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 칸나비스 속 식물은 Cannabis chemovars , Cannabis sativa, Cannabis indica, Cannabis ruderalis 등의 Cannabis sp., 야생종자, 변형체, 변종, 교잡종, 및 칸나비노이드를 포함한 식물 등을 포함할 수 있다. 또한, 칸나비스 속 식물은 살아있는 식물체 또는 건조 또는 비건조된 식물체일 수 있다. 또한, 칸나비스 속 식물체는 잎, 꽃봉오리, 열매, 겹털, 화포, 줄기, 뿌리, 또는 칸나비노이드를 함유할 수 있는 임의의 부위일 수 있다. 또한, 칸나비스 속 식물은 자웅이주 식물로서 암, 수에 따라 칸나비노이드 함량에 차이가 있을 수 있다. 칸나비스 속 식물은 암, 수, 또는 그 혼합물일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 임의의 용매를 칸나비스 (cannabis) 속 식물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 용매는 칸나비스 (cannabis) 속 식물 중 칸나비노이드 예를 들면, CBDA를 추출할 수 있는 것 또는 용해시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 용매는 물, 양성자성 용매, 비양성자성 용매, 또는 그의 혼합물일 수 있다. 상기 양성자성 용매는 C1-C6의 알콜, 또는 C1-C4의 알콜일 수 있다. 상기 비양성자성 용매는 C3-C10의 에스테르, C3-C10의 케톤, 또는 C1-C6의 비치환 또는 할로겐화 탄화수소일 수 있다. 상기 추출물은 칸나비노이드 CBDA와 CBD의 총 함량이 증가된 것일 수 있다.
상기 추출물은 칸나비노이드 CBDA와 CBD의 총 함량이 중량 기준으로 1% 이상, 또는 5% 이상, 예를 들면, 1 내지 90%, 5 내지 90%, 5 내지 80%, 5 내지 70%, 5 내지 60%, 5 내지 50%, 5 내지 40%, 5 내지 30%, 5 내지 20%, 5 내지 10%, 5 내지 9%, 5 내지 8%, 5 내지 7%, 또는 5 내지 6%일 수 있다. 상기 추출물은 농축시 층 분리가 없으며, 용해도가 좋은 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 칸나비노이드 및 용매, 예를 들면 양성자성 용매를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은, 20℃, 25℃, 30℃, 또는 35℃ 내지 사용한 단일 용매 또는 혼합 용매의 환류 온도에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 양성자성 용매는 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이들의 혼합물, 또는 이들의 수용액인 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 칸나비노이드 및 용매, 예를 들면 비양성자성 용매를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 인큐베이션은, 20℃, 25℃, 30℃, 또는 35℃ 내지 사용한 단일 용매 또는 혼합 용매의 환류 온도에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 비양성자성 용매는 에틸아세테이트, 아세톤, 2-부탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 칸나비스 속 식물은 잎, 꽃봉오리, 열매, 겹털, 화포, 줄기, 뿌리, 또는 칸나비노이드를 함유할 수 있는 임의의 부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 추출물 전체 중량에 대하여 CBDA와 CBD의 함량이 1% 이상, 또는 5% 이상, 예를 들면, 1 내지 90%, 5 내지 90%, 5 내지 80%, 5 내지 70%, 5 내지 60%, 5 내지 50%, 5 내지 40%, 5 내지 30%, 5 내지 20%, 5 내지 10%, 5 내지 9%, 5 내지 8%, 5 내지 7%, 또는 5 내지 6%일 수 있다.
칸나비스 식물 또는 그 추출물에 함유된 CBDA의 탈카복시산 반응을 통한 CBD로의 전환 반응은 마이크로웨이브 조사를 통해 얻어질 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 용매, 또는 최종 산물 중 CBD 함량 또는 CBDA에 대한 CBD의 비율에 따라 적당한 온도가 선택될 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 60℃ 내지 150℃, 예를 들면 60 내지 140℃, 60 내지 130℃, 60 내지 120℃, 60 내지 110℃, 60 내지 100℃, 60 내지 90℃, 60 내지 80℃, 60 내지 70℃, 70 내지 140℃, 70 내지 130℃, 70 내지 120℃, 70 내지 110℃, 70 내지 100℃, 70℃ 내지 90℃, 70 내지 80℃, 80 내지 140℃, 80 내지 130℃, 80 내지 120℃, 80 내지 110℃, 80 내지 100℃, 80 내지 90℃, 90 내지 140℃, 90 내지 130℃, 90 내지 120℃, 90 내지 110℃, 90℃ 내지 100℃, 100 내지 140℃, 100 내지 130℃, 100 내지 120℃, 100 내지 110℃, 110 내지 140℃, 110 내지 130℃, 110 내지 120℃, 120 내지 140℃, 120 내지 130℃ 또는 130 내지 140℃ 일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 CBDA를 CBD로 전환하기에 충분한 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 CBDA를 CBD로 전환하기에 충분한 시간 상기 반응 혼합물을 상기 용기 중에 체류시키면서 수행하는 것일 수 있다. 상기 체류 시간은 상기 펌프에 의하여 조절하는 것일 수 있다. 또한, 상기 체류 시간은 상기 용기의 흐르는 방향 길이와 높이 사이의 비율에 따라 그 흐름 속도를 조절함으로써 수행될 수 있다.
상기 마이크로웨이브 조사 시간은 관의 굵기와 길이, 반응온도, 마이크로파 출력, 사용한 용매 및 최종 산물의 용도에 따라 달라질 수 있다. 여기서, "마이크로웨이브 조사 시간"은 마이크로웨이브 발생 장치의 가동 시간과는 별개로 반응 혼합물에 마이크로웨이브가 조사되는 시간을 나타낸다. 상기 마이크로웨이브 조사 시간은 반응물이 관을 통해 반응기 내에 흐르는 동안 마이크로웨이브에 노출되는 시간을 나타낸다. 따라서, 마이크로웨이브 발생 장치가 켜져 있더라도 반응물이 마이크로웨이브에 노출되지 않으면, 마이크로웨이브 조사 시간에 포함되지 않는다. 마이크로웨이브 조사 시간은 유속이 느릴수록 길어지게 된다. 상기 마이크로웨이브 조사 시간은 5 분 내지 180 분, 예를 들면, 10 분 내지 180 분, 10 분 내지 150 분, 10 분 내지 100 분, 10 분 내지 90 분, 20 분 내지 180 분, 20 분 내지 150 분, 20 분 내지 100 분, 20 분 내지 90 분, 30 분 내지 180 분, 30 분 내지 150 분, 30 분 내지 100 분, 30 분 내지 90 분, 5 분 내지 30 분, 5 분 내지 20 분, 5 분 내지 10 분, 10 분 내지 30 분, 10 분 내지 20 분, 또는 20 분 내지 30 분일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 상기 반응 혼합물을 펌프를 통하여 분당 0.010 내지 10 mL의 유량으로 흘려주면서 수행하는 것일 수 있다. 상기 유량은 예를 들면, 분당 0.010 내지 5.0 mL, 0.010 내지 2.0 mL, 0.010 내지 1.0 mL, 0.010 내지 0.50 mL, 0.010 내지 0.10 mL, 0.10 내지 10 mL, 0.10 내지 5.0 mL, 0.10 내지 2.0 mL, 0.10 내지 1.0 mL, 0.10 내지 0.50 mL, 0.50 내지 10 mL, 0.50 내지 5.0 mL, 0.50 내지 2.0 mL, 0.50 내지 1.0 mL, 1.0 내지 10 mL, 1.0 내지 5.0 mL, 1.0 내지 2.0 mL, 2.0 내지 10 mL, 2.0 내지 5.0 mL, 또는 5.0 내지 10 mL일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 가압하에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 마이크로웨이브 조사는 1 초과 100 기압, 예를 들면, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 30, 2 내지 20, 또는 2 내지 15 기압하에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사에서 상기 마이크로웨이브의 출력은 3W 내지 6 kW, 예를 들면, 10W 내지 6 kW, 10W 내지 3 kW, 10W 내지 1 kW, 10W 내지 500W, 10W 내지 100W, 10W 내지 70W, 10W 내지 50W, 또는 3W 내지 50W일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 마이크로웨이브 조사는 칸나비스 또는 그 추출물에 마이크로웨이브를 조사하여 가열하는 열적 반응(thermal reaction)을 의미한다. 마이크로웨이브는 300 MHz 내지 300 GHz, 예를 들면, 1000 MHz 내지 100 GHz, 1000 MHz 내지 50 GHz, 1000 MHz 내지 10 GHz, 또는 1000 MHz 내지 5 GHz의 주파수를 갖는 마이크로파일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 마이크로웨이브 조사는 500 내지 5000 MHz, 500 내지 4000 MHz, 1000 내지 5000 MHz, 1000 내지 3000 MHz, 2000 내지 4000 MHz, 또는 2000 내지 3000 MHz에수 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 생산 또는 분리되는 상기 칸나비노이드는 CBD일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사하는 단계에서, 상기 용매는 C1-C12의 알콜, 또는 그 수용액, 예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 또는 이들의 혼합물, 또는 그의 수용액일 수 있다. 상기 수용액은 50 내지 99% 에탄올 수용액일 수 있다. 상기 C1-C12의 알콜은 C1-C6, C1-C4, 또는 C2-C5의 알콜일 수 있다.
상기 마이크로웨이브 조사하는 칸나비스 속 식물 또는 그의 추출물에 함유된 CBDA 성분이 CBD 성분으로 10% 내지 100%, 예를 들면, 20% 내지 100%, 25% 내지 100%, 30% 내지 100%, 50% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 97% 내지 100%, 또는 100% 전환되도록 하는 것일 수 있다.
상기 반응 혼합물은 상기 용매 중에 용해된 CBDA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 CBDA는 1 ppm 내지 해당 용매에 대한 CBDA의 포화농도, 10 ppm 내지 해당 용매에 대한 CBDA의 포화농도, 50 ppm 내지 해당 용매에 대한 CBDA의 포화농도, 100 ppm 내지 해당 용매에 대한 CBDA의 포화농도, 200 ppm 내지 해당 용매에 대한 CBDA의 포화농도, 200 내지 10,000 ppm, 200 내지 5,000 ppm, 500 내지 10,000 ppm, 500 내지 5,000 ppm, 또는 500 내지 1,000 ppm의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
상기 반응 혼합물은 상기 용매 중에 용해된 CBDA 함유 대마 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 추출물은 1 ppm 내지 해당 용매에 대한 CBDA의 포화농도, 10 ppm 내지 해당 용매에 대한 상기 추출물의 포화농도, 50 ppm 내지 해당 용매에 대한 상기 추출물의 포화농도, 100 ppm 내지 해당 용매에 대한 상기 추출물의 포화농도, 200 ppm 내지 해당 용매에 대한 상기 추출물의 포화농도, 200 내지 10,000 ppm, 200 내지 5,000 ppm, 500 내지 10,000 ppm, 500 내지 5,000 ppm, 또는 500 내지 1,000 ppm의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 분리된 칸나비노이드는 분리물 전체 중량에 대하여 10 내지 100 중량%, 예를 들면 10 내지 99 중량%, 10 내지 95 중량%, 10 내지 90 중량%, 20% 내지 100 중량%, 20 내지 99 중량%, 20 내지 95 중량%, 또는 20 내지 90 중량%의 CBD를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 분리 방법은 CBD를 분리하는 단계일 수 있다.
상기 분리하는 단계는 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물은 크로마토그래피하는 것을 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 역상 C18 컬럼-크로마토그래피, 또는 역상 준 분취 고성능 액체크로마토그래피일 수 있다. 그 결과, 상기 반응 혼합물은 실리카겔을 이용한 용매의 극성별 분획물로 CBD 함량이 높은 혼합물 또는 분취용 액체크로마토그래피 분리를 통해서 CBD 단일 성분을 얻을 수 있다.
역상 C18 컬럼 크로마토그래피에 의한 분리 방법은 실험실에서 일반적인 방법으로 사용되는 분리방법으로, 분리할 시료의 양에 따라 사용되는 유리관의 직경과 역상 C18의 사용량이 달라질 수 있으나, 통상은 유리관의 경우 내경 1 내지 10 cm, 길이 10 내지 100 cm의 관과 선택된 관 높이에 50 내지 70%의 역상 C18이 채워진 관을 사용하는 것일 수 있다. 사용되는 용리액의 조성은 시료의 양과 실리카 겔 관에 따라 다소 차이가 있으며, 예를 들면 메탄올:물:에틸아세테이트=1:1:0 내지 1:0:0 내지 0:0:1 부피비의 혼합용매를 혼합비에 따라 순차적으로 사용하는 것일 수 있다.
역상 준 분취용 HPLC에 의한 분리 조건은, 시료의 양과 사용되는 컬럼의 크기에 따라 달라질 수 있으나, 통상은 역상 분취용 HPLC (고정상: Phenomenex 사 Luna C18(2) 컬럼, 입자크기 10 μm, 길이 250x10 mm)을 액체 크로마토그래피 (Shimadzu) 기기에 준비하고 시료를 초기 용리액에 용해하여 주입한 뒤, 용리액을 아세토니트릴:물=50:50 (v/v)로 전개시켜 60 내지 90분간 아세토니트릴:물=100:0 (v/v)로 증가시키면서 분리하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효 성분으로 포함하는 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토용 약학 조성물을 제공한다. 상기 칸나비노이드는 CBD일 수 있다. 상기 칸나비노이드는 분획물, 단일 화합물 또는 그 혼합물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 칸나비노이드는 단순 열처리 가공물에 비해 CBD의 함량이 현저히 높음으로써 증가된 CBD의 약효를 갖는다. CBD는 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토 작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 마이크로웨이브 조사에 의하여 이러한 효과가 단순 열처리 가공물에 비해 현저히 증가될 수 있다.
다른 양상은 상기한 따른 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품용 조성물을 제공한다. 상기 칸나비노이드는 CBD일 수 있다. 상기 칸나비노이드는 분획물, 단일 화합물 또는 그 혼합물일 수 있다. 상기 식품은 기능성 식품, 또는 건강기능성 식품일 수 있다. 식품의 기능적 성분은 약학성분이 일부 함유된 안전한 식품 조성물이고 식품적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물을 제공한다. 상기 화장품은 일반 화장품, 또는 기능성 화장품일 수 있다. 화장품의 기능적 성분으로 알려진 CBD는 항산화 또는 항염증 등에 효과를 갖는 조성물일 수 있다. 상기 화장품용 조성물은 화장품에 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 질병은 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토 작용일 수 있다.
다른 양상은 상기 상기한 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에게 적용하는 단계를 포함하는, 화장하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의하면, 추출물에 함유된 CBDA는 연속식 마이크로웨이브 조사를 통해 CBD로 전환할 수 있다. 상기 방법은 칸나비노이드 함유 추출물을 관 형태의 용기를 통하여 흘려 주면서 마이크로웨이브 조사를 수행하는 것에 의하여 CBDA의 탈카복시산 반응을 시간당 많은 용량으로 수행하면서도, 20 내지 100%의 높은 CBD 함량을 갖는 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 의하면 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토 작용용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 의하면 식품, 특히 기능성 식품으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 화장품용 조성물에 의하면 항산화 또는 항염증 기능의 일반 화장품, 또는 기능성 화장품에 사용될 수 있다.
도 1은 연속식 마이크로웨이브 가공 장치의 모식도를 나타낸다.
도 2는 CBDA를 농도별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 3은 CBD를 농도별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 4는 원료 대마 잎 추출물의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다. 이하에서 "원료 대마 잎 추출물"은 실시예 1에서 얻어진 에틸아세테이트 용매로 추출한 추출물을 나타낸다.
도 5는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 70 ℃에서 1.0 mL 용량의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 6은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 70 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.05 mL/min로 흘려 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 7은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL 용량의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 8은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.05 mL/min로 흘려 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 9는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.025 mL/min로 흘려 40 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 10은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.017 mL/min로 흘려 60 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 11은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 12는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.05 mL/min로 흘려 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 13은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 14는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.025 mL/min로 흘려 40 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 15는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.017 mL/min로 흘려 60 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 16은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 100 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.20 mL/min로 흘려 5 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 17은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 100 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 18은 부탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 19는 이소프로판올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 20은 80% 에탄올 수용액 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 21은 에틸아세테이트 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 22는 아세토니트릴 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 23은 아세톤 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 24는 헥산 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 25는 1,2-디클로로에탄 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 26은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 10,000 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 27은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 10,000 ppm 용액을 95 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 28은 실험예 2에서 분리한 CBD의 순도 확인을 위해 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 대마 추출물 제조
본 실시예에서 사용된 대마는 식품의약품안전처와 서울지방식품의약품안전청의 마약류(대마) 학술연구자 허가(제1564호) 및 대마시료 양수·양도 승인 절차를 거쳐 대한민국 경상북도 상주시에 소재한 제이헴프코리아로부터 기탁받아 사용하였다. 대마 씨 껍질, 대마 잎, 대마 줄기, 및 대마 뿌리는 2018년 10월에 수확하였고 세절하여 사용하였다. 대마 부위 중 칸나비노이드류가 비교적 많이 함유된 세절된 대마 잎 200 g과 에틸아세테이트 2.0 L를 5.0 L 삼각 플라스크에 넣고 초음파 추출기 (Sonics, VC505)로 1시간 기기의 40% 파워 즉, 200W로 초음파를 조사한 후 24시간 실온에서 인큐베이션하는 것을 2회 반복하였다.
초음파 처리된 세절된 대마 잎 및 에틸아세테이트의 혼합물을 여과지를 통하여 여과하여 얻음 추출액을 감압하에 증발 농축하여 CBDA 및 CBD를 포함하는 대마 잎 추출물 17.6 g을 얻었다.
실시예 2 : 연속식 마이크로웨이브 가공 장치의 제작
연속식 마이크로웨이브 가공 장치는 미국 CEM 사에서 제조된 마이크로웨이브 반응기(모델번호 908005)를 사용하였고, 10 mL 플로우셀 악세사리(Flow Cell Accessory, 모델번호 908910)의 반응 챔버에 PTFE 및 PFA 재질로 된 튜브를 삽입하여 연속식 반응기를 제작하였다. 이후 연속식 반응기 챔버에 물을 채우고 삽입된 튜브의 한쪽 말단 즉, 반응 혼합물이 유입되는 유입구 쪽 튜브에 송액펌프(YMC-KP 시리즈)를 연결하고 반대쪽 말단 즉, 반응 혼합물이 유출되는 유출구 쪽 튜브에는 역압력 조절기 (Back Pressure Regulator) 75 psi (UPCHURCH, P-786)를 연결하여 사용하였다 상기 튜브는 외경(O.D.) 1/16 inch이고, 내경(I.D.) 1.0 mm이고, 길이 127.4 cm이고, 내관 용량은 1.0 mL이었다. 상기 튜브가 포함되는 챔버의 부피는 10mL이었다. 상기 챔버는 그 채워진 물의 열을 상기 튜브에 전달함으로써 온도 조절기로서 작용한다.
도 1은 연속식 마이크로웨이브 가공 장치의 모식도를 나타낸다.
실시예 3-25 : 대마 잎 추출물의 연속식 마이크로웨이브 가공
실시예 1에서 얻어진 에틸아세테이트 추출물의 연속식 마이크로웨이브 가공을 실시하였다. 구체적으로는, 대마 추출물을 에탄올에 200 ppm 농도로 녹인 후, 연속식 반응기의 반응 온도를 70 ℃로 설정하고 마이크로웨이브 최대 파워 45W, 주파수 2450 MHz에서 10분 (실시예 3) 및 20분 (실시예 4) 동안 연속식 마이크로웨이브 방식으로 가공하였다. 이와 같은 방식으로 80 ℃로 10분 (실시예 5) 및 20분 (실시예 6), 40분 (실시예 7) 및 60분 (실시예 8), 90 ℃로 10분 (실시예 9), 20분 (실시예 10), 30분 (실시예 11), 40분 (실시예 12) 및 60분 (실시예 13), 100 ℃로 5분 (실시예 14), 및 10분 (실시예 15) 동안 마이크로웨이브를 조사하여 가공물을 수득하였다. 다음으로, 연속식 반응기의 반응 온도를 90 ℃로 30분 설정하고, 용매를 부탄올 (실시예 16), 이소프로판올 (실시예 17), 80% 에탄올 수용액 (실시예 18), 에틸아세테이트 (실시예 19), 아세토니트릴 (실시예 20), 아세톤 (실시예 21), 헥산 (실시예 22) 및 1,2-디클로로에탄 (실시예 23)으로 하여 마이크로웨이브를 조사하여 가공물을 수득하였다. 다음으로, 대마 추출물을 에탄올에 10,000 ppm 농도로 녹인 후, 30분 동안 90 ℃ (실시예 24) 및 95 ℃ (실시예 25)로 마이크로웨이브를 조사하여 가공물을 수득하였다.
각각의 반응시간은 송액펌프의 유속을 조절하여 제어하였으며 마이크로웨이브 조사 시 파워는 3 내지 45W이었고, 함량 분석은 실험예 1의 분석법에 따라 실시하였다. 유속에 따른 반응시간은 다음과 같다: 0.2 mL/min은 5분, 0.1 mL/min은 10분, 0.05 mL/min은 20분 및 0.033 mL/min은 30분, 0.025 mL/min은 40분 및 0.017 mL/min은 60분. 여기서 반응 시간은 반응물이 연속식 반응기 내 튜브에 체류하는 시간을 나타낸다. 상기 마이크로웨이브 조사 시 파워는 튜브 내경의 크기에 따라 달라질 수 있다.
실험예 1 : 추출물 및 연속식 마이크로웨이브 가공물의 칸나비노이드 분석
(1) 실험 방법
CBDA 및 CBD 검증선 값을 기준으로 하여 상기 실시예에서 얻어진 대마 추출물과 가공 추출물의 칸나비노이드를 3회 반복분석하여 재현성을 확인하였다. 실험에 사용된 CBDA 및 CBD 단일성분은 대마 잎 원료로부터 직접 분리한 순도 97.1%의 CBDA와 96.3%의 CBD를 사용하였다. 일반적인 검량선 측정 방법에 따라 CBDA와 CBD를 각각 10, 25, 50, 100, 및 250 ppm으로 물 중에 녹여 표준 용액을 제조하고, 이를 이용하여 검증선을 작성하였다. 울트라 거동 액체 크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)에서 사용한 용출 용매인 A는 물이고 용출 용매 B는 아세토니트릴이며, 2개의 펌프를 이용하여 각각 펌핑하여 사용하였다. 상기 표준 수용액 3 ㎕를 시린지를 이용하여 분석용 역상 컬럼 (Phenomenex Luna Omega 1.6 μ Polar C18, 150 Х 2.1 mm)에 주입시키고, 70 부피 %의 A, 30 부피 %의 B의 조성을 갖는 용출 용매를 0.3 mL/분의 유속으로 흘렸다. 그 후, 용출 용매 B의 부피 %를 100 % (20 분), 100 % (23 분), 및 30 % (26 분)로 점차적으로 변화시켰다. 상기 과정 후 컬럼에서 분리된 각 성분을 UV 스펙트럼을 통하여 분석하였다.
(2) 실험 결과
실험 결과, 대마 잎 추출물에 대해 UPLC 분석에 의해 컬럼에서 분리된 각 성분을 UPLC 크로마토그램을 통하여 분석한 결과 도 4 내지 도 27의 피크를 얻었다.
도 2는 CBDA를 농도별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 3은 CBD를 농도별로 분석하여 작성한 검증선을 나타낸다.
도 4는 원료 대마 잎 추출물의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다. 실시예 1에서 얻어진 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 5는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 70 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 6은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 70 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.05 mL/min로 흘려 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 7은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 8은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.05 mL/min로 흘려 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 9는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.025 mL/min로 흘려 40 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 10은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 80 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.017 mL/min로 흘려 60 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 11은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 12는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.05 mL/min로 흘려 20 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 13은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 14는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.025 mL/min로 흘려 40 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 15는 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.017 mL/min로 흘려 60 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 16은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 100 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.20 mL/min로 흘려 5 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 17은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 100 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.10 mL/min로 흘려 10 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 18은 부탄올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 19는 이소프로판올 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 20는 80% 에탄올 수용액 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 21은 에틸아세테이트 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 22는 아세토니트릴 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 23은 아세톤 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 24는 헥산 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 25는 1,2-디클로로에탄 중 대마 잎 추출물의 200 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 26은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 10,000 ppm 용액을 90 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
도 27은 에탄올 중 대마 잎 추출물의 10,000 ppm 용액을 95 ℃에서 1.0 mL의 튜브에 송액펌프를 통해 유속 0.033 mL/min로 흘려 30 분간 마이크로웨이브 가공 처리한 가공물 중의 칸나비노이드 성분을 분석한 UPLC 크로마토그램이다.
또한, 대마 추출물의 연속식 마이크로웨이브 가공 후 얻어진 UPLC 크로마토그램에서 CBDA와 CBD의 함량을 계산한 결과를 표 1에 정리하였다.
구분 온도(℃)-시간(min) CBDA CBD CBDA+
CBD		 CBD 수율* CBD 함량% =
{CBD/(CBDA+CBD)}×100
실시예 1 - 68.2 mg 8.9 mg 77.1 mg 13.0% 11.5%
실시예 3 70-10 55.0 mg 17.6 mg 72.6 mg 25.6% 24.2%
실시예 4 70-20 46.9 mg 25.1 mg 72.0 mg 36.5% 34.9%
실시예 5 80-10 40.6 mg 31.4 mg 72.0 mg 45.7% 43.6%
실시예 6 80-20 25.8 mg 41.2 mg 67.0 mg 60.0% 61.5%
실시예 7 80-40 10.3 mg 55.3 mg 65.5 mg 80.5% 84.3%
실시예 8 80-60 4.3 mg 58.2 mg 62.4 mg 84.7% 93.1%
실시예 9 90-10 17.4 mg 50.0 mg 67.4 mg 72.8% 74.2%
실시예 10 90-20 6.3 mg 59.3 mg 65.6 mg 86.3% 90.3%
실시예 11 90-30 n.d** 63.7 mg 63.7 mg 92.8% 100%
실시예 12 90-40 n.d** 62.1 mg 62.1 mg 90.4% 100%
실시예 13 90-60 n.d** 58.9 mg 58.9 mg 85.7% 100%
실시예 14 100-5 25.4 mg 36.9 mg 62.3 mg 53.7% 59.2%
실시예 15 100-10 n.d** 58.7 mg 58.7 mg 85.4% 100%
* CBD 수율 = (CBD mg / 68.7 mg (100% 전환시의 이론 CBD 량)×100** n.d = not detected
표 1은 실시예 1의 대마 잎 추출물을 에탄올에 200 ppm의 농도로 녹인 후 연속식 마이크로웨이브 방식으로 가공하고 CBDA 및 CBD 함량을 추출물 1 g 당 mg 단위로 나타냈다. 초기 대마 잎 추출물(실시예 1)에서는 칸나비노이드는 CBDA 68.2 mg, CBD 8.9 mg으로 CBD가 11.5%이지만 연속식 마이크로웨이브 조사 온도와 시간에 따라 탈카복시산 반응이 일어나면서 CBDA가 CBD로 전환되어 가공물 내 CBD의 함량이 증가되는 것이 확인되었다. 마이크로웨이브 가공 온도는 70 내지 100 ℃에서 5 내지 10 ℃ 간격으로 실험하였고, 온도에 대한 시간의 영향을 확인하기 위해서 5 내지 60분 사이로 측정하였다. 결국 가공 온도와 시간이 증가할수록 CBD로 전환되는 양이 증가하는 경향이 나타나 90 ℃, 30분에서 CBDA가 CBD로 100% 전환되어 CBD 수율 90.8%의 결과를 얻었으나, 이후 실질적인 CBD의 수율이 감소하는 경향을 보였다. 100 ℃, 10분에서도 CBDA가 모두 CBD로 100% 변환되었지만 실질적인 CBD 수율은 85.4%이었다.
또한, 용매별 대마 추출물의 연속식 마이크로웨이브 가공 후 얻어진 UPLC 크로마토그램에서 CBDA와 CBD의 함량을 계산한 결과를 표 2에 정리하였다.
구분 용매 CBDA CBD CBDA+
CBD		 CBD 수율* CBD 함량% =
{CBD/(CBDA+CBD)}×100
실시예 1 - 68.2 mg 8.9 mg 77.1 mg 13.0% 11.5%
실시예 11 EtOH n.d** 63.7 mg 63.7 mg 92.8% 100%
실시예 16 BuOH 28.2 mg 36.3 mg 64.5 mg 52.8% 56.3%
실시예 17 IPA 40.4 mg 27.4 mg 67.9 mg 39.9% 40.4%
실시예 18 80% EtOH 2.2 mg 28.0 mg 30.2 mg 40.8% 92.7%
실시예 19 EtOAc 68.1 mg 8.4 mg 76.5 mg 12.2% 11.0%
실시예 20 MeCN 68.0 mg 8.3 mg 76.3 mg 12.1% 10.9%
실시예 21 acetone 64.0 mg 10.9 mg 74.9 mg 15.9% 14.6%
실시예 22 hexane 68.0 mg 8.3 mg 76.3 mg 12.1% 11.0%
실시예 23 DCE 65.3 mg 9.6 mg 75.0 mg 14.0% 12.8%
* CBD 수율 = (CBD mg / 68.7 mg (100% 전환시의 이론 CBD 량)×100** n.d = not detected
표 2는 실시예 1의 대마 잎 추출물을 각각의 용매에 200 ppm의 농도로 녹인 후 상기 표1에서 CBD 수율이 가장 높았던 실시예 11 조건(90 ℃, 30분)에서 연속식 마이크로웨이브 방식으로 가공하고 CBDA 및 CBD 함량을 추출물 1 g 당 mg 단위로 나타냈다. 실시예 11에서는 CBD 수율이 92.8%였으나, BuOH(부탄올), IPA(이소프로판올) 및 80% EtOH 수용액에서는 각각 52.8%, 39.9% 및 40.8%로 수율은 낮지만 반응이 진행되는 것을 확인하였다.
그러나, EtOAc(에틸아세테이트)와 같은 에스테르 계열 용매, MeCN(아세토니트릴)와 같은 니트릴 계열 용매, acetone(아세톤)과 같은 케톤 계열 용매, hexane(헥산)과 같은 탄화수소 계열 용매 및 DCE(1,2-디클로로에탄)과 같은 할로겐화 탄화수소 계열 용매에서는 반응이 거의 진행되지 않는 것이 확인되었다.
또한, 고농도 대마 추출물의 연속식 마이크로웨이브 가공 후 얻어진 UPLC 크로마토그램에서 CBDA와 CBD의 함량을 계산한 결과를 표 3에 정리하였다.
구분 온도(℃)-시간(min)-농도(ppm) CBDA CBD CBDA+CBD CBD 수율* CBD 함량% =
{CBD/(CBDA+CBD)}×100
실시예 1 - 68.2 mg 8.9 mg 77.1 mg 13.0% 11.5%
실시예 11 90-30-200 n.d** 63.7 mg 63.7 mg 92.8% 100%
실시예 24 90-30-10,000 2.8 mg 61.7 mg 64.5 mg 89.8% 95.7%
실시예 25 95-35-10,000 n.d** 62.9 mg 62.9 mg 91.5% 100%
* CBD 수율 = (CBD mg / 68.7 mg (100% 전환시의 이론 CBD 량)×100** n.d = not detected
표 3은 실시예 1의 대마 잎 추출물을 에탄올에 10,000 ppm의 농도로 녹인 후 상기 표 1에서 CBD 수율이 가장 높았던 실시예 11 조건(90 ℃, 30분)에서 연속식 마이크로웨이브 방식으로 가공하고 CBDA 및 CBD 함량을 추출물 1 g 당 mg 단위로 나타냈다. 실시예 11에서는 CBD 수율이 92.8%였으며, 같은 조건에서 추출물 농도를 10,000 ppm으로 반응하였을 때 CBD가 89.8%의 수율로 생성되었으며, 온도를 95 ℃로 높였을 때 CBD를 91.5%의 고수율로 얻을 수 있었다.
따라서, 상기한 방법에 의하면 100 ℃ 또는 그 미만의 낮은 온도에서 짧은 시간 안에 고수율로 탈카복시산 반응이 진행되는 결과를 얻었다. 또한, 연속식 마이크로웨이브 가공방식을 통하여 CBD가 고함유된 가공물을 대량생산할 수 있는 방법을 개발하게 되었다.
상기 실험 결과, 대마 추출물을 연속식 마이크로웨이브 방식으로 가공하였을 때 원료 대마의 주요 칸나비노이드 성분인 CBDA가 기존 문헌, 학술연구 및 특허 등에서 증명되어온 약학적 효능이 우수한 CBD로 더욱 효율적으로 변환시킬 수 있었다.
예를 들면, 대마 잎의 주요 칸나비노이드 성분 중량에 대하여 CBD 함량이 20% 내지 100% 함유된 마이크로웨이브 조사 가공물을 대량으로 얻을 수 있게 되었다.
실험예 2 : 대마 추출물의 마이크로웨이브 연속 가공을 통한 CBD 생산
(1) 실험 방법
상기 연속식 반응 방법의 24시간 지속 반응을 테스트하기 위한 실험을 위하여 실시예 1에서 얻어진 에틸아세테이트 대마 추출물을 건조 후 에탄올에 10,000 ppm 농도로 녹이고 CBD 생산 최적 조건인 실시예 25의 조건을 활용하여 연속 반응기의 반응 온도를 95 ℃로 설정하고 마이크로웨이브 최대 파워 45W, 주파수 2450 MHz에서 30분 간 마이크로웨이브 조사를 받는 조건으로 실시하였다. 총 반응시간은 내부 부피가 1.0 mL의 튜브에 펌프를 0.033 mL/min로 24시간으로 설정하여 송액하였으며 마이크로웨이브 조사 시 파워는 3 내지 45W이었고, 함량 분석은 실험예 1의 분석법에 따라 실시하였다.
(2) 실험 결과
실험 결과, 24시간 동안 처리된 에탄올 가공물 47.5 mL에서 에탄올을 감압농축기를 이용하여 제거하고 얻어진 농축물이 475 mg이었고, 이를 역상 준 분취용 크로마토그래피를 통해 분리한 결과 CBD를 32.5 mg 얻을 수 있었다.
결론적으로, 실시예 25 조건에서 24시간 동안 연속식 마이크로웨이브 가공이 안정적으로 수행되었고 CBDA의 탈카복시산 반응을 통해 순도 99.2%의 CBD 32.5 mg을 제조할 수 있었다.
도 28은 실험예 2 가공물에서 분리한 CBD의 순도 확인을 위해 분석한 UPLC 크로마토그램이다.

Claims (24)

  1. 칸나비스 속 식물 또는 그 추출물 및 용매를 포함하는 반응 혼합물을 반응용기 중에서 마이크로웨이브 조사하는 단계로서, 상기 마이크로웨이브 조사는 상기 반응 혼합물을 반응용기 유입구로부터 반응용기 유출구를 통하여 흘려 주면서 수행하는 것인 단계를 포함하는 칸나비노이드를 생산하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사된 반응 혼합물로부터 칸나비노이드를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 물, 양성자성, 비양성자성 용매, 또는 이들의 혼합물 중 하나 이상을 칸나비스 (cannabis sp.) 속 식물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어진 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 칸나비스 속 식물은 잎, 꽃봉오리, 열매, 겹털, 화포, 줄기, 또는 칸나비노이드를 함유할 수 있는 임의의 부위를 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 추출물 전체 중량에 대하여 CBDA와 CBD의 함량이 5 중량 % 이상인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 60℃ 내지 150℃에서 수행하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 CBDA를 CBD로 전환하기에 충분한 시간 동안 수행하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 연속식 반응기 내에서 5분 내지 180 분 동안 수행하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 가압하에서 수행되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 2 내지 100 기압하에서 수행하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 300 MHz 내지 300 GHz의 주파수로 수행하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사는 3W 내지 6 kW의 전력으로 수행하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 칸나비노이드는 CBD인 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 마이크로웨이브 조사하는 단계에서, 상기 용매는 C1-C12의 알콜 또는 그 수용액인 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 용매는 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 및 50 내지 99% 에탄올 수용액인 것인 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 분리된 칸나비노이드는 분리물 전체 중량에 대하여 20 내지 100 중량%의 CBD를 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 반응용기는 용기 유입구와 용기 유출구 사이에 관을 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 반응용기는 마이크로웨이브 투과성 물질로 된 것인 방법.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 반응용기는 온도 조절기에 연결된 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 온도 조절기는 상기 반응용기가 관통하여 연결되어 있고, 액체를 담을 수 있는 온도 조절 챔버를 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 온도 조절 챔버는 마이크로웨이브 투과성 물질을 포함하는 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 항간질, 신경보호, 혈관이완, 항암, 항염증, 항당뇨, 항균, 진통, 골다공증 개선, 면역 개선 또는 진토용 약학 조성물.
  23. 청구항 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 건강기능식품용 조성물.
  24. 청구항 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 방법에 의하여 분리된 칸나비노이드를 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물.
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