CN116693480B - 二氢白蜡酮a及其制备方法和应用 - Google Patents

二氢白蜡酮a及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

二氢白蜡酮A及其制备方法和应用，它涉及一种新化合物、制备方法及应用。本发明目的是为了提供新化合物二氢白蜡酮A、制备方法及其应用。二氢白蜡酮A分子式为C14H16O4，分子量为248.1049。制备方法：一、将白鲜皮粉碎用乙醇提取；二、回收乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取；三、乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱、制备型高效液相色谱等方法分离，得到二氢白蜡酮A。二氢白蜡酮A作为制备抗炎药物应用。本发明二氢白蜡酮A对LPS诱导的炎症小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的NO释放率的IC50为10.83μM/L，说明其具有较好的体外抗炎活性。本发明属于天然药物有效成分研究领域。

Description

二氢白蜡酮A及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种新化合物及其制备方法和应用。
背景技术
炎症是生物组织受到某种刺激如外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应；炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击导致身体受到损伤等等。文献报道炎症与癌症患者抑郁、疲劳、睡眠障碍等症状之间存在联系。因此，抗炎新药研究对提高人民生活质量具有重要意义。
白鲜皮为芸香科白鲜属植物白鲜(Dictamnus dasycarpus Turcz)的干燥根皮，始载于《神农本草经》。白鲜皮化学成分主要包括生物碱类、柠檬苦素类、倍半萜及其苷类、三萜类、苯丙素类、黄酮类、甾醇类、挥发油类等成分。现代药理学研究表明，白鲜皮具有抗菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、杀虫、抗氧化等多种药理作用。民间常用白鲜皮粉末止血消炎，但药效物质并不明确。
发明内容
本发明目的是为了提供一种具有体外抗炎活性的新化合物二氢白蜡酮A。
本发明的第二个目的是提供了二氢白蜡酮A的制备方法。
本发明的第三个目的是提供了二氢白蜡酮A在抗炎药物中的应用。
二氢白蜡酮A(dihydrofraxinone A)的分子式为C14H16O4，分子量为248.1049，分子结构式为：
所述二氢白蜡酮A的制备方法如下：
(1)将白鲜皮粉碎，用体积浓度为95％的乙醇进行提取，得到乙醇提取液；
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)、将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱；
取甲醇与水体积比为20:80的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:7的二氯甲烷和甲醇混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:7的洗脱物进行羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离，以甲醇为洗脱剂进行洗脱；
洗脱物经TLC分析后合并相同化学成分的馏分，得到3个合并馏分；取第2个洗脱合并馏分进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第72.58分钟出现的吸收峰，即得到二氢白蜡酮A；
步骤(3)制备高效液相色谱以乙腈与水体积比为26:74的乙腈和水为流动相，流速为3ml/分钟。
步骤(1)将白鲜皮粉碎后用索氏动态提取浓缩机组提取；索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定为85℃～90℃。
步骤(1)索氏动态提取浓缩机组浓缩条件为-0.05MPa～-0.08MPa。
步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。
所述二氢白蜡酮A作为制备抗炎药物活性成分的应用。
上述抗炎药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。
上述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。
所述二氢白蜡酮A作为抗炎药物的活性成分，用于抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞NO释放量。所述LPS诱导的炎症小鼠巨噬细胞是RAW264.7细胞。
本发明二氢白蜡酮A提取自白鲜皮，化学名为3-(furan-3-yl)-3a,7-dimethyl-hexahydro-isobenzofuran-1,6-dione，分子式为C14H16O4，分子量为248.104。
二氢白蜡酮A无色油状液体，比旋光度(c 1,MeOH)；UV(MeOH)：λmax：215nm。质谱数据显示HR-ESI-MS:m/z 271.0936[M+Na]+(计算值271.0947)，提示分子式为C14H16O4，不饱和度为7。
本发明方法获得的二氢白蜡酮A的纯度高，达到98.7％以上。
本发明的二氢白蜡酮A具有较强的抗炎活性，对LPS诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)NO释放量抑制作用的IC50为10.83μM/L。可将本发明的二氢白蜡酮A制成注射剂、冻干粉针、输液剂或口服制剂(包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液和缓控释制剂)等抗炎药物。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1、本发明首次获得了新化合物二氢白蜡酮A，而且该制备方法获得的二氢白蜡酮A的纯度高，达98.7％以上。
2、本发明二氢白蜡酮A具有较强的体外抗炎活性，对LPS诱导的炎症小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的NO释放率的IC50为10.83μM/L。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式二氢白蜡酮A的分子式为C14H16O4，分子量为248.1049，分子结构式为：
具体实施方式二：具体实施方式一所述二氢白蜡酮A的制备方法如下：
(1)将白鲜皮粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中，用体积浓度为95％的乙醇进行提取，得到乙醇提取液；
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)、将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱；
取甲醇与水体积比为20:80的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:7的二氯甲烷和甲醇混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:7的洗脱物进行羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离，以甲醇为洗脱剂进行洗脱；
收集淡色的中段洗脱物进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第72.58分钟出现的吸收峰，即得到二氢白蜡酮A；
步骤(3)制备高效液相色谱以乙腈与水体积比为26:74的乙腈和水为流动相，流速为3ml/分钟。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤(1)索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定为85℃～90℃。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤(1)索氏动态提取浓缩机组浓缩条件为-0.05MPa～-0.08MPa。其他与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。其他与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：具体实施方式一至五所述二氢白蜡酮A的应用，所述二氢白蜡酮A用于制备抗炎药物。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是所述抗炎药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。其他与具体实施方式六之相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。其他与具体实施方式六或七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是所述二氢白蜡酮A作为抗炎药物的活性成分，用于抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞NO释放量。其他与具体实施方式六至八之一相同。
采用下述实验验证本发明效果：
实验一：
二氢白蜡酮A的制备方法如下：
(1)将白鲜皮粉碎，置于索氏动态提取浓缩机组的提取罐中，用体积浓度为95％的乙醇进行提取，得到乙醇提取液；
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)、将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱；
取甲醇与水体积比为20:80的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:7的二氯甲烷和甲醇混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:7的洗脱物进行羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离，以甲醇为洗脱剂进行洗脱；
收集淡色的中段洗脱物进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第72.58分钟出现的吸收峰，即得到二氢白蜡酮A；
步骤(3)制备高效液相色谱以乙腈与水体积比为26:74的乙腈和水为流动相，流速为3ml/分钟。
步骤(1)索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定为85℃。
步骤(1)索氏动态提取浓缩机组浓缩条件为-0.05MPa。
步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。
本实验采用Waters2545制备型高效液相色谱，检测器为Waters2489型紫外检测器，检测波长为210nm及254nm。色谱柱的填料为C-18反相硅胶。
本实验用100kg白鲜皮粉碎、提取，最终获得二氢白蜡酮A为7.83mg，纯度达98.7％，二氢白蜡酮A的核磁共振数据如表1所示。
表1二氢白蜡酮A的1H-NMR(600MHz,CDCl3)及13C-NMR(150MHz,CDCl3)
Position δH(α/βJ in Hz) δC Position δH(α/βJ in Hz) δC
1 2.17,1H,m 32.4 7 43.8
1 1.87,1H,m 32.4 8 2.46,1H,m 55.5
2 2.57,1H,m 36.4 9 0.96,3H,s 22.6
2 2.42,1H,m 36.4 10 1.22,3H,d,J＝6.7 13.6
3 213.0 1’ 122.2
4 2.89,1H,m 42.5 2’ 7.60,1H,d,J＝0.6 142.0
5 178.7 3’ 7.56,1H,t,J＝1.7 145.4
6 5.66,1H,s 82.7 4’ 6.48,1H,d,J＝1.2 110.1
实验二：
将实验一制备的二氢白蜡酮A对LPS诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)NO释放量抑制作用进行检测：
一、将已达到对数生长期的RAW264.7细胞以1×105/孔接种于96孔板中，于5％CO2、37℃的培养箱中培养24h，用含有25ng/ml LPS的DMEM高糖完全培养基诱导处理24h设置模型组。
二、将实验一制备的二氢白蜡酮A配制为浓度为600mmol·L-1的DMSO溶液，用上述培养基进行梯度稀释，设置样品组浓度为60μM/L、30μM/L、15μM/L、7.5μM/L、3.75μM/L。
三、向经过步骤一处理的RAW264.7细胞中加入步骤二的药物处理24h，加入裂解液裂解细胞，取上清液，检测NO生成量。
四、连续重复步骤三3次，采取Logit法计算IC50值。测得实验一制备的二氢白蜡酮A对LPS诱导的炎症小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的NO释放率的IC50为10.83μM/L，具有较好抗炎活性。

Claims (8)

1.二氢白蜡酮A，其特征在于所述二氢白蜡酮A的分子式为C14H16O4，分子量为248.1049，分子结构式为：
2.权利要求1所述二氢白蜡酮A的制备方法，其特征在于所述二氢白蜡酮A的制备方法如下：
(1)将白鲜皮粉碎，用体积浓度为95％的乙醇进行提取，得到乙醇提取液；
(2)将步骤(1)得到的乙醇提取液进行浓缩后用水进行分散得到混悬液，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；
(3)、将步骤(2)得到的乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:0、100:1、100:2、100:5、100:10的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:10的洗脱物进行反相硅胶柱色谱分离，用体积比为10:90、20:80的甲醇和水的混合溶剂依次洗脱；
取甲醇与水体积比为20:80的洗脱物进行硅胶柱色谱分离，用体积比为100:3、100:5、100:7的二氯甲烷和甲醇混合溶剂依次洗脱；
取二氯甲烷与甲醇体积比为100:7的洗脱物进行羟丙基葡聚糖凝胶柱色谱分离，以甲醇为洗脱剂进行洗脱，并将洗脱物合并相同化学成分的馏分，取第2个洗脱合并馏分进行制备型高效液相色谱分离，收集洗脱时间为第72.58分钟出现的吸收峰，即得到二氢白蜡酮A；
步骤(3)制备高效液相色谱以乙腈与水体积比为26:74的乙腈和水为流动相，流速为3ml/分钟。
3.根据权利要求2所述的二氢白蜡酮A的制备方法，其特征在于步骤(1)将白鲜皮粉碎后用索氏动态提取浓缩机组提取；索氏动态提取浓缩机组压力设定为常压提取，提取温度设定为85℃～90℃。
4.根据权利要求3所述的二氢白蜡酮A的制备方法，其特征在于步骤(1)索氏动态提取浓缩机组浓缩条件为-0.05MPa～-0.08MPa。
5.根据权利要求2所述的二氢白蜡酮A的制备方法，其特征在于步骤(2)中混悬液密度为1.25g/ml。
6.权利要求1所述二氢白蜡酮A在制备抗炎药物中的应用，其中二氢白蜡酮A作为抗炎药物的活性成分，用于抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞NO释放量。
7.根据权利要求6所述二氢白蜡酮A在制备抗炎药物中的应用，其特征在于所述抗炎药物的剂型包括注射剂、冻干粉针剂、口服制剂。
8.根据权利要求7所述二氢白蜡酮A在制备抗炎药物中的应用，其特征在于所述口服制剂包括片剂、颗粒剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、口服液、缓控释制剂。
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