CN114133401A - 一种白鲜碱单体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种白鲜碱单体的制备方法。对白鲜皮进行粉碎处理，通过热回流醇提取法提取白鲜皮，然后对白鲜皮醇提物进行初步的纯化，经过酸化、过滤、碱化、萃取、浓缩、冷冻、干燥纯化后的白鲜皮浸膏进行柱层析洗脱分离，第一次二氯甲烷混合溶剂梯度洗脱，第二次二氯甲烷单一溶剂等度洗脱，利用薄层检测合并，浓缩重结晶得到白鲜碱单体。并利用UV、FT‑IR、HPLC、1H‑NMR对分离的样品进行结构鉴定。白鲜皮为珍贵药材，本专利采用磁力搅拌器，升温快，提取效率高，并简化了白鲜碱纯化分离步骤，为白鲜碱的规模化放大提供科学理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及中药材单体化合物制备领域，具体为一种白鲜碱单体的制备方法。
背景技术
白鲜皮（Dictamnus dasycarpus Turcz）为芸香科白鲜属植物白鲜的干燥根皮，主要分布在我国分布于东北、陕西、甘肃、四川、江苏、河北、贵州等地。为我国传统中草药，味苦，性寒，具有祛风解毒、清热燥湿的功效。现代临床研究发现，白鲜皮具有抗炎、抗菌、抗癌、杀虫等生物活性，其中白鲜碱、梣酮、黄柏酮为白鲜皮的主要药效成分。梣酮是一种新型的保肝药物，同时还具有抗炎、抗菌等功效；黄柏酮是一种含量较高的柠檬苦素类化合物，可对昆虫幼虫产生拒食现象，同时还具有提高抑制微管作用的抗肿瘤药物的活性等功效；白鲜碱同样具有多种生物活性，它能抗炎，抗菌，抗真菌，舒张血管，对气管平滑肌有舒张作用等功效。
付永霞[付永霞.白鲜皮的抑菌作用[J].中国现代药物应用,2010,4(06):238-239],以白鲜碱为指标,利用正交实验优选白鲜皮提取工艺,提取条件为乙醇浓度75%、液料比1:5(mL/g)、提取时间2h，其白鲜碱含量是0.7835(mg/g)。梁红等[梁红, 韦宝韩, 黄光伟, 等. 正交试验法研究白鲜皮的提取工艺[J]. 广西轻工业, 2009, 25(05): 16-17]利用渗漉法最优的提取条件为药材破碎为1-2mm，加入7倍的60%乙醇，渗漉速度为4-5mL/min，白鲜碱含量为0.1722(mg/g)。苏伟梁等[苏伟梁,靳丽梅.正交法优选白鲜皮的提取工艺[J].黑龙江医药,2006(01):16-17].以白鲜碱为指标,利用正交实验优选白鲜皮提取工艺,提取条件为乙醇浓度80%、料液比1:6(mL/g)、回流时间1h，提取2次， 其白鲜碱含量是0.90(mg/g) 。李翔[李翔,张新申,邓赟,蒋小萍.从白鲜皮中同时制备梣酮、白鲜碱、黄柏酮单体的方法[J].四川大学学报(工程科学版),2007(04):68-72.]运用正交试验进行白鲜皮的提取工艺的优选，最佳的提取工艺为加入药材重量的6倍，乙酸乙酯回流提取3次,每次1 h。提取得到的白鲜碱浸膏进行一次硅胶柱层析分离，用石油醚一丙酮(20∶1至5∶1)梯度洗脱,收集重结晶即分离纯化出白鲜碱单体。白鲜碱单体得率为0. 034(mg/g)。
本发明对白鲜皮进行粉碎处理，通过热回流醇提取法提取白鲜皮，然后对白鲜皮醇提物进行初步的纯化，纯化后的白鲜皮浸膏进行柱层析洗脱分离，洗脱剂为二氯甲烷，利用薄层检测，最终得到分离的白鲜碱单体。并利用UV、IR、HPLC、1H-NMR对分离的单体的结构进行鉴定，为白鲜碱的规模化放大提供科学理论依据。
发明内容：
基于以上技术背景研究中存在的白鲜碱含量低和提取率低，用多相洗脱剂分离纯化白鲜碱成本高的问题，本发明采用磁力搅拌器，升温快，提取效率高，并简化了白鲜碱纯化分离步骤，为白鲜皮后续应用及市场需求提供科学理论依据。
一种如权利要求1所述采用一种白鲜碱单体的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
1. 白鲜碱的提取与含量测定
提取方法：采用磁力搅拌器转速250r/min热回流法80 g白鲜皮根皮，料液比为1：10 g/mL，乙醇浓度为80±0.16%，温度为80±2℃，提取次数为2次，每次提取1.5±0.01 h，最终白鲜皮醇提物12.09g，提取率为15.11±0.15%。测得白鲜皮醇提物中白鲜碱含量为2.84±0.15%。
2. 白鲜碱的纯化
将所得的白鲜皮醇提物用0.3% HCl溶液溶解，并调节pH值为1。减压过滤即得酸溶部分。利用浓氨水调节酸溶部分pH=9，减压过滤即得碱溶部分。然后用二氯甲烷溶液萃取，每次萃取时的体积比为溶液：二氯甲烷=3：1进行萃取。选择250 mL分液漏斗萃取2次，待乳化层分离完全，下层为有机层，上层为水相，合并两次萃取的二氯甲烷溶液，真空浓缩得白鲜碱浸膏。
3. 白鲜碱的分离
采用湿法装柱，将白鲜碱浸膏进行上样，上样体积为50 mL，柱层析流速为1.0 mL/min。在柱层析分离实验中，在第一次柱层析时选择二氯甲烷：甲醇=100：1、二氯甲烷：甲醇=100：2进行梯度洗脱每组5mL，得到13-20组馏分，合并浓缩进行二次洗脱。第二次洗脱时只采用二氯甲烷，收集5-12组馏分，薄层板鉴定相似的馏分并，浓缩重结晶后，得到白鲜碱单体24mg，得率为1.985±0.05mg/g。
4. 白鲜碱的结构鉴定
（1）紫外光谱法（UV）
通过紫外分光光度计在200~800 nm范围内对纯化分离的样品进行紫外全波长扫描，检测出最大吸收波长为236 nm，与白鲜碱对照品一致。
（2）红外光谱
红外光谱用于有机官能团的定性分析，。在红外光谱分析仪中4000 cm−1~ 400 cm−1范围扫描，连续扫描32次，测定样品吸收峰，IR(KBr) cm-1：3430为苯环上的(-C=N-)，1616.06(-C=C-)，1207.22(=C-OCH3)，1081.87(=C-O-C)，1577.48，1504.20，754.03(Ph)，与中国药典红外光谱白鲜碱对照品图谱一致
（3）高效液相（HPLC）
以236 nm作为检测波长，将分离出的样品、白鲜碱对照品、样品和白鲜碱对照品混合样品用甲醇溶液1：1配成1mg/mL的浓度，分别进样，结果保留时间一致，外标法计算得纯度为97.03±0.12%。
（4）核磁共振-氢谱
准备3 mg白鲜碱样品，溶剂为CDCl3，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，注入核磁管中，仪器为Bruker的超导核磁共振波谱仪，型号为AVANCEⅡ500，频率为400M Hz，溶剂为CDCl3，1H-NMR测定数据，结果：在δ6.99～8.20，为6个C-H，δ4.36信号为-OCH3基团的3个H，样品与对照品核磁共振氢谱信号峰一致。
结合紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱以及核磁的多重验证，证明分离的单体结构为白鲜碱。
借由上述技术方案，本发明至少具以下优点及有益效果：
（1）通过磁力搅拌器250r/min，热回流法醇为提法提取，提取率为15.11±0.15%，白鲜皮醇提物中白鲜碱含量为2.84±0.15%。采用磁力搅拌器，升温快，恒温控温效果更好，搅拌状态下溶剂与白鲜皮充分接触，提取效果好。
（2将白鲜皮醇提物经过酸溶、过滤、碱溶、萃取的纯化过程得到白鲜碱浸膏，然后分别采用二氯甲烷混合溶剂和单一溶剂为洗脱剂进行分离，结果洗脱效果佳，简化了洗脱操作，减少实验成本，提高了白鲜碱的产率。
（3）利用UV、IR、HPLC、1H-NMR对分离的单体的结构进行鉴定，多重验证为白鲜碱化合物。
在本专利提取纯化工艺的条件下，成功分离白鲜皮有效成分，为进一步开发白鲜皮资源奠定理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是白鲜碱的标准曲线；图2是第一次柱层析分离薄层色谱板（3-27）；图3是第一次柱层析分离薄层色谱板（13-30）；图4是第二次柱层析分离薄层色谱板（5-14）；图5是白鲜碱结构式；图6是白鲜碱单体紫外图；图7是白鲜碱单体红外光谱图光谱；图8是白鲜碱标准品液相色谱图；图9是白鲜碱单体液相色谱图；图10是碱单体和标准品混合样品液相色谱图；图11是白鲜碱单体的核磁图谱。
具体实施方式
以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施方案一 白鲜碱的提取与含量测定
1.提取
先将白鲜皮根茎洗净、烘干、用粉碎机粉碎成块状后备用。称取粉碎后的白鲜皮根皮80 g于1000 mL三口圆底烧瓶中，倒入80%乙醇溶液800 mL溶解，通过磁力搅拌器温度设定在80℃，转速250r/min，加热至沸腾， 提取时间1.5小时，减压过滤，重复两次以上步骤。合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩，条件为转速150r/min，温度90℃，随后利用蒸发皿90℃水浴蒸至浸膏状，冷冻干燥，最终得白鲜皮醇提物。
结果为：提取方法：80 g白鲜皮，料液比为1：10 g/mL，乙醇浓度为80±0.16%，温度为80±2℃，提取次数为2次，每次提取1.5±0.01 h，最终得到白鲜皮醇提物12.09 g，提取率为15.1±0.15%%。
2. 含量测定
使用电子分析天平精密称取白鲜碱标准品，用无水乙醇溶解，配置成浓度为0.02g/mL标准品溶液，稀释成0.004 g/mL、0.006 g/mL、0.008 g/mL、0.010 g/mL、0.012 g/mL，5份梯度浓度的样品，采用酶标仪测量各浓度标准溶液的吸光度A，以白鲜碱标准溶液浓度（g/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制出标准曲线，计算得线性回归方程。
用分析天平精密称取白鲜皮乙醇粗提物10 mg，用移液枪移取1 mL 80%乙醇配置成0.01 g/mL浓度溶液，通过酶标仪测出5组乙醇粗提物的吸光度，根据已得出白鲜碱标准曲线，代入计算，取其平均值，得到白鲜碱含量。按照以下公式计算含量：
式中：C：浓度（mg/mL）； V：稀释倍数（mL）；m0：白鲜皮醇提物的质量（g）；m：白鲜皮质量（g）。
采用酶标仪精密测量0.004 g/mL、0.006 g/mL、0.008 g/mL、0.010 g/mL、0.012g/mL这5组梯度浓度标准溶液的吸光度A，以白鲜碱标准溶液浓度（g/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制出标准曲线，计算得线性回归方程Y=1.92x+3.2589，R2=0.9992，在2-12mg/mL之间成良好线性关系。标准曲线绘制如图1所示。用电子分析天平精密称取白鲜皮醇提物10 mg，用移液枪移取1 mL 80%乙醇溶液溶解样品，超声震荡混合均匀后，利用酶标仪测量五组数据，代入线性回归方程中，取其平均值，最终得到白鲜皮醇提物白鲜碱含量为2.84%±0.15%。
实施方案二 白鲜碱的纯化分离
1.纯化
将所得的白鲜皮醇提物用0.3% HCl溶液溶解，并调节pH值为1。减压过滤上述溶液，保留滤液，即得酸溶部分。利用浓氨水调节酸溶部分pH=9，压过滤上述溶液，保留滤液，即得碱溶部分。
然后用二氯甲烷溶液萃取，每次萃取时的体积比为溶液：二氯甲烷=3：1进行萃取。选择250 mL分液漏斗萃取2次，待乳化层分离完全，下层为有机层，上层为水相，合并两次萃取的二氯甲烷溶液，真空浓缩得到纯化部分白鲜碱浸膏。
2.分离
(1)装柱
本次实验采用湿法装柱（砂芯层析柱1.5×25））称取20 g柱层层析硅胶于烧杯中，倒入二氯甲烷，超声处理20分钟，流动相液面与硅胶面相接近且平行时，缓慢倒入的样品，尽可能的使硅胶面和样品层都保持平整。
(2)柱层析分离
将白鲜皮醇提物经过酸溶、过滤、碱溶、萃取过程得到白鲜碱浸膏进行上样，上样体积为50 mL，柱层析流速为1.0 mL/min。在柱层析分离实验中，在第一次柱层析时选择二氯甲烷：甲醇=100：1、二氯甲烷：甲醇=100：2进行梯度洗脱，第二次洗脱时只采用二氯甲烷。收集5mL每瓶的洗脱液，进行薄层层析点板检测。
(3) 检测
选择50×100 mm规格的高效硅胶板G型，点板斑点直径2~3 mm为宜，收集组分为2mL，3个馏分一点板，每块板最右侧的点为白鲜碱标准品，在紫外灯照射下观察。展开剂为二氯甲烷：甲醇=10：0.1。挥干展开剂后，用紫外灯254 nm和365 nm灯光下照射观察薄层板。白鲜碱在UV 365 nm下可以观察到蓝色荧光，UV 254 nm下有明显的绿色暗斑。样品和白鲜碱标准品比较比移值（Rf值），薄层板上和标准品Rf值一致且紫外灯下性状相似的馏分收集到一起。
结果如图2所示，第一次柱层析分离共收集到30个馏分，左侧板为3，6，9，12，15，标准品点板情况，可观察到3-12馏分无白鲜碱化合物；右侧板为18，21，24，27，标准品点板情况，18馏分白鲜碱含量较多，21馏分含量较低且杂质较多，其余馏分无白鲜碱。图3为左侧板为13-17以及标准品点板展开情况，右侧板为18-20以及标准品点板展开情况。如图3所示，13-20馏分都有白鲜碱化合物，但还含有其他杂质，需要进行二次柱层析分离。
第二次柱层析薄层色谱板分离情况如图4所示。合并浓缩13-20馏分进行上样，柱层析洗脱剂为二氯甲烷单相洗脱，收集到14个馏分，在254 nm和365 nm紫外灯照射下，观察到5-12馏分为白鲜碱单体化合物，合并5-12馏分，浓缩、重结晶，精密称量所得样品为24mg，得率为1.985±0.05mg/g。
实施方案三 白鲜碱的结构鉴定
本专利分别通过紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱、核磁共振氢谱对分离出的白鲜碱单体化合物按照标准结构（图5）进行结构鉴定。
(1) 紫外光谱法（UV）
取1 mg分离样品，用1mL 80%乙醇溶液溶解，配1 mg/mL ，空白对照为80%乙醇溶液，在紫外-可见分光光度计200~800 nm范围进行全波长扫描，由此得出最大吸收波长为236 nm。如图6所示，与白鲜碱对照品图谱一致。
(2) 红外光谱法（IR）
精密称取分离后样品2 mg和干燥后的溴化钾100 mg混匀，用玛瑙研钵研磨后通过压片机压片，压片厚度在1 mm为宜，并且平滑无裂痕。在红外光谱分析仪中4000 cm−1~ 400cm−1范围扫描，连续扫描32次，测定样品吸收峰，扫描样品前要扫除空气峰。
如图7所示，3430为苯环上的(-C=N-)，1616cm-1 (-C=C-)，1207cm-1 (=C-OCH3)，1081 cm-1 (=C-O-C)，1577、1504和754cm-1 (Ph)。对比样品与对照品产品红外特征峰一致，可以鉴定样品为白鲜碱化合物。
(3) 高效液相（HPLC）
高效液相条件：色谱柱采用KromaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，高效液相采用赛默飞Ultimate 3000，使用Chromeleon 7.2软件处理图像及数据，流动相为甲醇-水(60: 40)，流速为1.0 mL/min，紫外检测器检测波长为236 nm，柱温箱温度为30℃，保留时间为30 min，进样体积为20 μL。
将分离出的白鲜碱单体样品、白鲜碱对照品、白鲜碱单体样品和白鲜碱对照混合样品用甲醇溶液1：1配成1mg/mL的浓度，分别进针，HPLC条件如上，观察峰面积以及保留时间一致，以此判断化合物性质。
如图8所示，白鲜碱对照相对峰面积为99.46%，保留时间为17.07±0.16 min。如图9所示，分离出的白鲜碱单体相对峰面积为99.50%，保留时间为17.07±0.18 min。如图10所示，白鲜碱加样混标进针后，可观察出白鲜碱峰面积单一对称，保留时间为16.94±0.15min。根据图8-图10 ，保留时间和峰形一致，确证为白鲜碱，外标法计算得纯度为97.03±0.12%。
(4) 核磁共振-氢谱
准备3 mg白鲜碱样品，溶剂为CDCl3，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，注入核磁管中，完全溶解混匀后倒入核磁管中，仪器为Bruker的超导核磁共振波谱仪，型号为AVANCEⅡ500，频率为400M Hz。通过1H-NMR判断白鲜碱单体化合物结构。
表1白鲜碱氢谱测定值数据及归属
| Position | 测定值 | 文献值 |
| 1 | 8.20(1H,br d,J = 8.5 ) | 8.23 (1H,br d,J=8.4) |
| 2 | 7.39(1H,t,J=8.5) | 7.42 (1H,t,J=8.4) |
| 3 | 7.61(1H,t,J=8.5) | 7.67 (1H,t,J=8.4) |
| 4 | 7.94(1H,br d,J=8.5) | 8.00 (1H,br d,J=8.4) |
| 5 | 6.99(1H,d,J=2.4) | 7.03 (1H,d,J=2.4) |
| 6 | 7.55(1H,d,J=2.4) | 7.59 (1H,d,J=2.4) |
| 7 | 4.36(3H,s) | 4.40 (3H,s) |
溶剂为CDCl3，频率为400M Hz。1H-NMR测定数据、归属及其文献值见表1，与文献报道数据一致，氢谱信号出现在δ6.99～8.20，为6个C-H，δ4.36信号为-OCH3基团的3个H。如图11所示，样品与对照品核磁共振氢谱信号峰一致。
通过紫外光谱、红外光谱、高效液相色谱与核磁色谱的多重验证，证明本专利分离的单体化合物为白鲜碱。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.本发明公开一种白鲜碱单体的制备方法，通过热回流醇提取法提取白鲜皮，然后对白鲜皮醇提物进行酸化、过滤、碱化、萃取、浓缩、冷冻、干燥纯化和柱层析洗脱分离，第一次二氯甲烷混合溶剂梯度洗脱，第二次二氯甲烷单一溶剂等度洗脱，利用薄层检测合并，浓缩重结晶得到白鲜碱单体，用UV、IR、HPLC、1H-NMR对分离单体的进行结构鉴定为白鲜碱。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于采用热回流法乙醇为溶剂，80g白鲜皮，磁力搅拌器转速250r/min，料液比为1：10 g/mL，乙醇浓度为80±0.16%，温度为80±2℃，提取次数为2次，每次提取1.5±0.01 h，得白鲜皮醇提物12.09g，提取率为15.11±0.15%，测得白鲜皮醇提物中白鲜碱含量为2.84±0.15%。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于将所得的白鲜皮醇提物用0.3% HCl溶解，调节pH值为1，减压过滤即得酸溶部分；利用浓氨水调节酸溶部分pH=9，减压过滤即得碱溶部；然后用二氯甲烷溶液萃取，体积比为溶液：二氯甲烷=3：1，萃取2次，待乳化层分离完全，合并两次萃取溶液，浓缩得白鲜碱浸膏。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于分离部分，采用湿法装柱，将白鲜碱浸膏进行上样，上样体积为50 mL，柱层析流速为1.0 mL/min；在第一次柱层析时选择二氯甲烷：甲醇=100：1、二氯甲烷：甲醇=100：2进行梯度洗脱每组5mL，得到13-20组馏分，合并浓缩进行二次洗脱；第二次洗脱时只采用二氯甲烷，收集5-12组馏分，通过薄层鉴定合并馏分，浓缩重结晶后，得到白鲜碱单体24mg，得率为1.985±0.05mg/g。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于纯化分离的样品紫外最大吸收波长为236 nm与白鲜碱光谱图一致；与白鲜碱标准红外光谱对比一致；高效液相色谱法保留时间与白鲜碱对照品时间一致；与白鲜碱对照品氢谱信号峰一致，多重验证本分离的单体结构为白鲜碱。
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