CN116514916B - 一种吲哚生物碱化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药提取分离、植物化学及医药技术领域，具体涉及一种吲哚生物碱化合物及其制备方法。本发明提供了从水半夏中提取的一种新化合物：以干燥的水半夏为原料，通过加水煎煮、减压浓缩、萃取、反相C18色谱分离等步骤得到一种新的吲哚生物碱化合物。本发明提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产；所得吲哚生物碱化合物具有抗增殖活性、抗肿瘤的作用，在制备治疗胃癌或肝癌的药物中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取分离、植物化学及医药技术领域，具体涉及从天南星科植物鞭檐犁头尖(Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume)的干燥块茎中提取、分离和鉴别的一种吲哚生物碱化合物及其制备方法。
背景技术
传统中药材水半夏是天南星科植物鞭檐犁头尖的干燥块茎；秋冬采挖块茎，除去外皮及须根，洗净、晒干即得；其性味气微，味辛辣，刺喉，嗅之刺鼻。水半夏功能主治为：燥湿，化痰，止咳；用于咳嗽痰多、支气管炎；外用鲜品治痈疮疖肿、无名肿毒、毒虫咬伤。
现代研究表明，水半夏主要含脂肪烃与脂肪酸类、生物碱类、黄酮类、氨基酸类、脑苷脂类、甾醇类等。生物碱广泛存在于自然界，具有复杂的环状结构，生物活性显著，是中草药中的有效成分之一。现有技术公开了水半夏中分离出的生物碱有以下四种化合物：
本发明人在对水半夏的成分进行研究的过程中，意外得到一种吲哚生物碱新化合物，在已有的文献中未见报道。本发明对该化合物进行了深入研究，证实其具有优于现有技术已公开生物碱化合物更加明显的抗肿瘤作用，同时降低了副作用，可以应用于制备治疗癌症或肿瘤的药物。
发明内容
基于背景技术所述，本发明提供了从水半夏中提取的一种新化合物，经研究发现该化合物具有抗肿瘤活性，同时本发明还提供一种针对该化合物的简便、快速的提取分离方法。本发明目的之一在于提供一种从水半夏中提取分离的新吲哚生物碱化合物，该吲哚生物碱化合物具有新型结构与药理活性，为水半夏药理作用研究提供了物质基础。本发明目的之二在于提供从水半夏中提取分离该吲哚生物碱化合物的方法，以干燥的水半夏为原料，通过加水煎煮、减压浓缩、萃取、反相C18色谱分离等步骤即得，整个提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。本发明目的之三在于提供该吲哚生物碱化合物抗肿瘤的作用，为发掘潜在的抗肿瘤新药提供有力依据。
为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：
本发明提供了一种从水半夏中提取分离的吲哚生物碱化合物，所述化合物的分子式为：C28H38N6O6，其化学结构式如下：
；
所述吲哚生物碱化合物用于制备抗胃癌或抗肝癌药物。
本发明还提供了上述吲哚生物碱化合物的提取分离方法，包括如下步骤：
步骤1、以干燥的水半夏为原料，粉碎后加水煎煮，再通过减压浓缩得到浓缩液；
步骤2、取步骤1所得浓缩液加水混悬，然后采用二氯甲烷进行萃取，所得萃取液减压浓缩至恒重；
步骤3、取步骤2萃取、浓缩所得物，经反相C18色谱柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，洗脱液经HPLC检视合并得到12个馏分；
步骤4、取步骤3所得其中一个馏分经HPLC检视，以乙腈-0.05%三氟乙酸水为流动相，采用反相高效制备液相色谱分离，得到吲哚生物碱化合物。
作为上述方案的进一步优选，步骤1中加水煎煮水的用量为水半夏质量的5倍；煎煮进行2-3次，每次煎煮时长为2-4 h。
作为上述方案的进一步优选，步骤1中减压浓缩于60-70℃条件下进行。
作为上述方案的进一步优选，步骤2萃取液减压浓缩于38-42℃条件下进行。
作为上述方案的进一步优选，步骤3中梯度洗脱所用甲醇和水的体积比为10：90、30：70、50：50、70：30、80：20、95：5，6个梯度体积比洗脱时间依次对应为8 h、8 h、7 h、5 h、5h、4 h。
作为上述方案的进一步优选，步骤4流动相乙腈-0.05%三氟乙酸水体积比为3：97，体积流量为10 mL/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明从干燥的水半夏中药材中提取分离得到了结构新颖的吲哚生物碱化合物，本发明还根据氢谱碳谱等相关数据确定了其分子构型。
2、本发明以干燥的水半夏为原料，通过加水煎煮、减压浓缩、萃取、反相C18色谱分离等步骤得到该吲哚生物碱化合物，整个提取分离工艺操作简单、易于控制，适合工业化生产。
3、体外生物活性实验表明，本发明吲哚生物碱化合物对人胃癌及肝癌细胞具有一定的抗增殖活性，在制备治疗胃癌或肝癌的药物中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明吲哚生物碱化合物结构图。
图2为本发明吲哚生物碱化合物UV光谱图。
图3为本发明吲哚生物碱化合物MS图。
图4为本发明吲哚生物碱化合物1H-NMR谱图。
图5为本发明吲哚生物碱化合物13C-NMR谱图。
图6为本发明吲哚生物碱化合物COSY谱图。
图7为本发明吲哚生物碱化合物HMBC谱图。
图8为本发明吲哚生物碱化合物HSQC谱图。
图9为本发明吲哚生物碱化合物NOESY谱图。
图10为本发明HMBC谱图解析。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
试验采用的设备有：安捷伦1260型液相色谱仪；岛津20-AD型制备高效液相色谱仪；Sartorius BP211D型电子天平；Autopol IV-T/V旋光仪；Varian UNITY INOVA 600超导核磁共振仪；Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q TOF高分辨质谱仪；电热恒温水浴锅；EYELASB-1000旋转蒸发仪，EYELA A-1000 S型循环水真空泵。C18反相填料为YMC产品；制备色谱柱为YMC(10 μm, 250×20 mm)；柱色谱硅胶、薄层色谱硅胶；水为Milli-Q一级水；Thermo热电FC酶标仪、IC1000细胞计数仪、莱卡DMIL倒置显微镜、低速离心机、二氧化碳恒温培养箱，色谱所用试剂为色谱级试剂，其他所用试剂均为分析纯。
实施例1吲哚生物碱化合物的制备
1、取干燥的水半夏10 kg，粉碎成65目左右的粗粉，加入其5倍重量的去离子水煎煮三次（第一次煎煮4 h，后两次每次2 h），随后65℃下减压浓缩得到4 L浓缩液；将所得浓缩液加适量水混悬，依次采用3 L二氯甲烷、3 L乙酸乙酯、3 L正丁醇进行萃取，最终将萃取液分别减压浓缩至恒重（二氯甲烷萃取液40℃下减压浓缩、乙酸乙酯萃取液40℃下减压浓缩、正丁醇萃取液60℃下减压浓缩），得到二氯甲烷萃取浓缩物38.0 g、乙酸乙酯萃取浓缩物16.3 g、正丁醇萃取浓缩物168.0 g。
2、取所得二氯甲烷萃取浓缩物，经反相C18色谱柱层析分离，用甲醇-水（体积比10：90、30：70、50：50、70：30、80：20、95：5）梯度洗脱（6个梯度体积比洗脱时间依次对应为8 h、8h、7 h、5 h、5 h、4 h），收集洗脱液，每500 mL收集一份共得58份洗脱液，依次编号1-58，把收集的58份洗脱液依次按编号顺序从小到大经HPLC检视，检视相同组分的合并成一份馏分，依次给所得馏分编号，得到12个馏分记为Fr.B1-B12；其中Fr.B1馏分为收集的编号1-8的洗脱液合并得到。
3、取馏分Fr.B1经HPLC检视，以乙腈-0.05%三氟乙酸水（体积比3：97）为流动相，采用反相高效制备液相色谱分离（体积流量10.0 mL/min），得到一种新的吲哚生物碱化合物（纯度为98.5%）。
实施例2吲哚生物碱化合物结构解析与鉴定
取本发明实施例1所制吲哚生物碱化合物，其为淡黄色固体，微溶于甲醇、水，易溶于DMSO；UV (CH3OH) λmax: 200 nm。UPLC-Q-TOF-MSm/z: 555.2927 [M+H]+(calcd forC28H38N6O6H, 555.2927)，结合氢谱碳谱确定其分子式为C28H38N6O6。
1H-NMR谱低场区显示一组苯环氢信号δH: 7.47 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-Trp-4)，7.30 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-Trp-7)，7.03 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-Trp-6)，6.94 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-Trp-5)；三个氨基氢信号δH: 8.26 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-Val)，8.19 (1H,d,J= 8.1 Hz, H-Trp)，7.80 (1H, t,J= 5.4 Hz, H-Gly)（出峰三个氨基氢信号8.26为缬氨酸氨基氢，8.19为色氨酸9号位氨基氢，7.80为甘氨酸氨基氢）；六个连氮亚甲基氢信号δH: 3.65 (1H, m, H-Gly-1a)，3.56 (1H, m, H-Gly-1b)，2.53 (1H, dd,J= 7.5, 10.6Hz, H-Pro-2a)，2.77 (1H, m, H-Pro-2b)，3.56 (1H, m, H-Pro-2'a)，3.65 (1H, m, H-Pro-2'b)；十个亚甲基氢信号δH: 3.00 (1H, dd,J= 7.1, 14.5 Hz, H-Trp-8a)，3.10(1H, m, H-Trp-8b)，1.49 (1H, m, H-Pro-3a)，1.41 (1H, m, H-Pro-3b)，1.90 (1H, m,H-Pro-4a)，1.56 (1H, m, H-Pro-4b)，1.90 (1H, m, H-Pro-3'a)，1.74 (1H, dd,J= 5.9,12.0 Hz, H-Pro-3'b)，2.01 (1H, m, H-Pro-4'a)，1.86 (1H, m, H-Pro-4'b)；五个连氮次甲基氢信号δH: 6.99 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-Trp-2)，4.63 (1H, t,J= 6.9 Hz, H-Trp-9)，4.30 (1H, t,J= 8.6 Hz, H-Val-2)，3.56 (1H, m, H-Pro-5)，4.43 (1H, dd,J= 3.8,8.4 Hz, H-Pro-5')；一个次甲基氢信号δH: 2.01 (1H, m, H-Val-1)；此外，1H-NMR谱还给出两组甲基氢信号δH: 0.86 (3H, d,J= 6.5 Hz, H-Val-1α)，0.92 (3H, d,J= 6.5 Hz,H-Val-1β)。
13C-NMR谱有28个碳信号，包括一组吲哚基碳信号δC: 128.1 (C-Trp-3α)，118.5(C-Trp-4)，118.9 (C-Trp-5)，121.2 (C-Trp-6)，111.6 (C-Trp-7)，136.4 (C-Trp-7α)，124.2 (C-Trp-2)，109.8 (C-Trp-3)，一个亚甲基碳信号28.4 (C-Trp-8)，一个连氮次甲基基碳信号52.9 (C-Trp-9)，一个羧基碳信号171.3 (C-Trp-10)，由此推断，化合物中含有色氨酸残基片段；一个次甲基碳信号30.6 (C-Val-1)，一个连氮次甲基碳信号56.2 (C-Val-2)，一个羧基碳信号170.3 (C-Val-3)，两个甲基碳信号19.0 (C-Val-1α)，19.6 (C-Val-1β)，说明其中含有缬氨酸残基片段；一个连氮亚甲基碳信号42.4 (C-Gly-1)，一个羧基碳信号171.6 (C-Gly-2)，推测其中含有甘氨酸残基片段；两组吡咯杂环碳信号46.8 (C-Pro-2)，25.9 (C-Pro-3)，30.6 (C-Pro-4)，60.3 (C-Pro-5)，47.5 (C-Pro-2')，24.8 (C-Pro-3')，29.7 (C-Pro-4')，59.8 (C-Pro-5')，两个羧基碳信号173.7 (C-Pro-6)，171.7 (C-Pro-6')，推测含有两个脯氨酸残基片段。
HMBC谱中，其中氨基氢信号δH: H-Val (8.26)和δC: C-Trp-10 (171.3)相关，表明缬氨酸连接在色氨酸的10号位置；氨基氢信号δH: H-Trp (8.19)和δC: C-Pro-6 (173.7)相关，表明色氨酸连接在脯氨酸的6号位置；脯氨酸中连氮次甲基氢信号δH: H-Pro-5 (3.56)和甘氨酸δC: C-Gly-2 (171.6)相关，同时，甘氨酸中连氮亚甲基氢信号δH: H-Gly-1a(3.65)和δH: H-Gly-1b (3.56)与脯氨酸δC: C-Pro-6' (171.7)相关，表明甘氨酸连接在另一脯氨酸的6'位置，进一步证明了上述推论（图10）。
该吲哚生物碱化合物结构如图1所示；UV光谱图如图2所示；MS图如图3；1H-NMR谱、13C-NMR谱、COSY谱、HMBC谱、HSQC谱、NOESY谱分别见图4-图9，由图4-图9确证了本申请的化合物结构。
该吲哚生物碱化合物的波谱数据归纳如下。
表1 吲哚生物碱化合物的13C-NMR、1H-NMR谱数据
实施例3化合物体外抗肿瘤活性测定
实验用药物：
阴性对照：生理盐水；待测药物：本发明吲哚生物碱。
测试原理：
CCK-8法：活细胞的线粒体中存在着与NAAP（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶Ⅱ）相关的脱氢酶，可将黄色的WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）还原为高度水溶性的橙黄色甲臜（Formanzan）产物，死细胞中此酶消失，CCK-8不被还原。用 DMSO（二甲亚砜）溶解甲臜后可用酶标仪在450 nm处检测光密度（OA），光密度值与活细胞数成正比。
所用细胞株为：BGC-823（人胃癌细胞）和BEL-7402（人肝癌细胞）。
试验方法：
CCK-8法：取对数生长期细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液，计数后稀释成1×104cell/mL，接种于96孔培养板中，100 µL每孔。每一个样品5-7个细胞浓度梯度，每组4-6个复孔，培养2-4小时使细胞贴壁，然后实验组加入不同浓度的药物，对照组加等量培养基，100 µL/孔。将96孔板置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养48小时后，每孔加入10 µL的CCK-8指示剂培养4小时后，在Multiskan go酶标仪上测定450 nm处的吸光度。按照下列公式计算肿瘤细胞生长抑制率，再以药物浓度对肿瘤细胞生长抑制率为作图得到计量曲线，从曲线上读出药物的半数抑制浓度（IC50）值。肿瘤细胞生长抑制率（%）=（1-实验孔测定值/对照组测定值）×100%。
实验结果见下表：
表2 吲哚生物碱化合物对BGC-823的抑制作用
表3 吲哚生物碱化合物对BEL-7402的抑制作用
结果表明该化合物对人胃癌细胞和人肝癌细胞均有抑制作用，呈现出一定的抗肿瘤活性，以期为发掘潜在的抗肿瘤先导化合物提供参考。
最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种从水半夏中提取分离的吲哚生物碱化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为：C28H38N6O6，其化学结构式如下：
；
所述吲哚生物碱化合物用于制备抗胃癌或抗肝癌药物。
2.一种如权利要求1所述吲哚生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、以干燥的水半夏为原料，粉碎后加水煎煮，再通过减压浓缩得到浓缩液；
步骤2、取步骤1所得浓缩液加水混悬，然后采用二氯甲烷进行萃取，所得萃取液减压浓缩至恒重；
步骤3、取步骤2萃取、浓缩所得物，经反相C18色谱柱层析分离，用甲醇-水梯度洗脱，HPLC检视合并得到12个馏分；
其中，梯度洗脱所用甲醇和水的体积比为10：90、30：70、50：50、70：30、80：20、95：5，6个梯度体积比洗脱时间依次对应为8 h、8 h、7 h、5 h、5 h、4 h；HPLC检视合并得到馏分的操作为：收集洗脱液，每500 mL收集一份共得58份洗脱液，依次编号1-58，把收集的58份洗脱液依次按编号顺序从小到大经HPLC检视，检视相同组分的合并成一份馏分，依次给所得馏分编号，得到12个馏分记为Fr.B1-B12，Fr.B1馏分为收集的编号1-8的洗脱液合并得到；
步骤4、取步骤3所得Fr.B1馏分经HPLC检视，以乙腈-0.05%三氟乙酸水为流动相，采用反相高效制备液相色谱分离，得到吲哚生物碱化合物；
其中，流动相乙腈-0.05%三氟乙酸水体积比为3：97，体积流量为10 mL/min。
3.根据权利要求2所述吲哚生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤1中加水煎煮水的用量为水半夏质量的5倍；煎煮进行2-3次，每次煎煮时长为2-4 h。
4.根据权利要求2所述吲哚生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤1中减压浓缩于60-70℃条件下进行。
5.根据权利要求2所述吲哚生物碱化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤2萃取液减压浓缩于38-42℃条件下进行。
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