CN111233807A - 一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制方法 - Google Patents

一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度山柰酚‑7,4′‑二甲醚的制备方法及其质量控制方法，本发明以拟草果的干燥果实为原料，建立山柰酚‑7,4′‑二甲醚化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立山柰酚‑7,4′‑二甲醚化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。本发明可为山柰酚‑7,4′‑二甲醚化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，具有潜在而不可估量的社会效益与经济效益。

Description

一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制 方法
技术领域
本发明涉及化合物制备技术领域，具体是一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制方法。
背景技术
化学对照品又称标准品，是中药质量标准研究、质量检测和质量控制的实物对照，中药化学对照品的研究，是中药标准化研究的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的基础与核心。
山柰酚-7, 4′-二甲醚作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的对照品，其市场需求很大。山柰酚-7, 4′-二甲醚是一种黄酮类化学成分，是拟草果等植物的活性成分之一，也是许多植物和药品标准质量控制的指标性成分。但是山柰酚-7, 4′-二甲醚在药材中的含量低，提取分离技术要求很高，制备高纯度的山柰酚-7, 4′-二甲醚难度很大。目前尚未有相应的国家药品标准物质，国内外对山柰酚-7, 4′-二甲醚中药化学对照品的系统研究未见报道。
山柰酚-7, 4′-二甲醚是从姜科植物拟草果（学名：Amomum paratsao-ko S.Q.Tong et Y.M.Xia）中分离得到的活性物质。从公开文献所知，山柰酚-7, 4′-二甲醚的提取分离过程和含量测定方法，主要有以下几种方法：
1.【题名】Dinorcassane diterpenoid from Boesenbergia rotunda rhizomescollected in Lower Myanmar：凹唇姜干燥根状茎（200 g），在30℃超声条件下用三氯甲烷(1L) 提取90 min（3次），得到三氯甲烷提取物（7.00 g），用硅胶柱色谱柱进行分离，以乙酸乙酯-正己烷（10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 50:50）梯度洗脱，合并得到7个流份（1: 372 mg; 2: 950 mg; 3: 200 mg; 4: 730 mg; 5: 567 mg; 6: 1.97 g; 7:1.50 g）。流份4（730 mg）经Cosmosil 75C18-OPN柱色谱（甲醇-水，5:1）得到2个子流份[4-1: 300 mg; 4-2: 100 mg]。子流份4-2（100 mg）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱（甲醇洗脱）得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（15.8 mg）（Nwet Nwet Win, May Mon Kyaw,Prema, et al.Dinorcassane diterpenoid fromBoesenbergia rotunda rhizomes collected in LowerMyanmar.Chemistry & Biodiversity，2019，16（4）：1-6.）。
2.【题名】Chemical composition, antioxidant and antibacterialactivities of Tamarix balansae J. Gay aerial parts：柽柳干燥地上部分粗粉（1.5kg），用80% 甲醇室温浸提（3 × 7L，24 h）。提取物减压浓缩，浸膏（120 g）用水分散（1L），过滤，依次用二氯甲烷和正丁醇萃取（3 × 300 mL）。回收溶剂，得到二氯甲烷萃取物1.5 g和正丁醇萃取物16 g。
正丁醇萃取物（12 g）经SC6（90 × 5.5 cm）聚酰胺柱色谱分离，甲苯-甲醇梯度洗脱（10:0→0:10），250 mL 搜集一次洗脱液，共得到23个流份。流份6经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-甲醇（9:1）洗脱，得到7个子流份，子流份3得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（4 mg）（AbbesBenmerache, Mounira Benteldjoune, Abdulmagid Alabdul Magid, et al.Chemicalcomposition, antioxidant and antibacterial activities of Tamarix balansae J.Gay aerial parts.Natural Product Research，2017，31（24）：2828-2835.）。
3.【题名】Two new antioxidant diarylheptanoids from the fruitsofAlpinia oxyphylla：益智干燥粗粉（10 kg），用95%乙醇于60℃浸提（3×100 L）48 h，提取液减压浓缩，浸膏混悬于水中，依次用石油醚（60-90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（100:0→0:100），通过薄层色谱检测，合并得到6个流份E1-E6。流份 E2（37g）经硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮洗脱（10:1）得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（16 mg）（Qing-Ya Bian, Shi-Yun Wang, Li-Jia Xu, etal.Two new antioxidant diarylheptanoids from the fruits ofAlpiniaoxyphylla.Journal of Asian Natural Products Research，2013，15（10）：1094-1099.）。
4.【题名】A new diarylheptanoid from the rhizomes of Zingibermekongense：干燥根状茎粗粉（2.3 kg），依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇室温浸提（6 L×4）。回收溶剂得到正己烷活性粗提物（94.5 g）（细胞毒性和合胞体实验：IC5056.5 μg/mL、EC50 21.4 μg/mL；HIV-1-RT实验：浓度200 μg/mL时抑制率为32.0%）、乙酸乙酯活性提取物（53.5 g）（细胞毒性和合胞体实验：IC50 137.1 μg/mL、EC5030.3 μg/mL；HIV-1-RT 实验：浓度200 μg/mL时抑制率为73.1%）和无效的甲醇提取物（173.4 g）。
抗HIV-1 正己烷活性提取物（93.0 g），经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-正己烷和甲醇-二氯甲烷梯度洗脱得到7个流份A1-A7。Separation 流份A6（30.1 g）经硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯-正己烷梯度洗脱得到子流份E1-E12。子流份E5（1.82 g）经硅胶柱色谱分离二氯甲烷-甲醇洗脱得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（51.9 mg）（Arthittaya Chareonkla, ManatPohmakotr, Vichai Reutrakul, et al. A new diarylheptanoid from the rhizomesof Zingiber mekongense.Fitoterapia, 2011,82: 534-538.）。
5.【题名】Antioxidant and Antitumor Promoting Activities oftheFlavonoids from Hedychium thyrsiforme：Hedychium thyrsiforme干燥根状茎地上部分粗粉（800 g），依次用正己烷、二氯甲烷室温提取。正己烷上清液减压浓缩，得到3.5 g浸膏，经硅胶柱色谱分离，正己烷、二氯甲烷、丙酮依次增加极性洗脱，得到22个流份。通过薄层色谱检测，合并得到5个流份（A-E）。流份A通过制备薄层色谱得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（14mg）（JasriI1, L.Y. Moor, N.H. Lajis,et al. Antioxidant and AntitumorPromoting Activities of theFlavonoids from Hedychiumthyrsiforme.Pharmaceutical Biology，2003，41（7）：506-511.）。
6.【题名】A new benzofuran from Artemisia halodendron Turcz. ex Bess.：差不嘎蒿干燥地上部分（12 kg），用70%乙醇（95 L × 3）室温一周提取3次。合并提取液减压浓缩得到粗提物（1.2 kg）。粗提物分散于水中，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。二氯甲烷萃取部位（400 g），经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（v/v, 20:1, 10:1,7:1, 3:1, 0:100）梯度洗脱，得到11个流份A1-A11。Fr. A4 （15 g）经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯（18:1→1:1）梯度洗脱得到4个子流份（A41-A44）。Fr. A43（4.3 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇， 1:1分离，得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（34.1mg）（Jinfeng Sun, Wei Zhou, Cheng-Xi Wei, et al. A new benzofuran fromArtemisia halodendron Turcz. ex Bess.Natural Product research, 2019，33（2）：226-232.）。
7.【题名】Antibacterial constituents of Neohyptis paniculata：250 g 干燥地上部分，依次用正己烷、氯仿、甲醇索氏提取。这种用极性增大的溶剂连续萃取的方法可以根据代谢物的极性初步分离成分。正己烷和氯仿提取物均有抑菌活性，因此对这两种提取物进行进一步的分离纯化。
氯仿萃取物（5.5 g）经VLC（硅胶60H）进行分离，使用正己烷-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇极性递增的混合物洗脱。通过薄层色谱检测合并洗脱液，在中，用的VLC馏分经乙酸乙酯-石油醚（20-25%）洗脱后，进一步进行制备薄层色谱得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（16.6mg）。（M. Mukhlesur Rahman,Simon Gibbons. Antibacterial constituents ofNeohyptis paniculata.Fitoterapia, 2015，105：269-272.）。
8.【题名】Anti-inflammatory activity of compounds fromBoesenbergialongiflora rhizomes：差不嘎蒿干燥根茎（5 kg）粉末乙醇室温浸提四次（6L× 4），滤液用旋转蒸发仪浓缩。差不嘎蒿乙醇提取物562.5 g（11.3% w/w）。提取物（539g）悬浮于95% 甲醇，依次用正己烷、氯仿和水萃取，之后水层用乙酸乙酯萃取。每个部位蒸干得到正己烷、氯仿、乙酸乙酯和水部位。利用RAW264.7细胞对这些部位进行抗NO释放的评估。
具有NO抑制活性的氯仿部位（30.0 g）（IC50=5.5 μg/ml）经硅胶柱色谱分离，正己烷、正己烷-氯仿（9:1, 8:2, 6:4,4:6, 2:8）、氯仿、氯仿-乙酸乙酯（9:1, 8:2, 6:4, 4:6,2:8）、乙酸乙酯-甲醇（9.5:0.5, 9:1）依次增加极性洗脱。250 mL 搜集一次洗脱液，通过薄层色谱检测合并共得到13 个流份（F1-F13）。流份F6（IC50=2.8 μg/ml; 11.6 g）经硅胶柱色谱（400 g）分离，正己烷、正己烷-氯仿（9:1, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8）、氯仿、氯仿-乙酸乙酯（9.5:0.5, 9:1）溶剂系统洗脱，得到四个子流份（A-D）。F6子流份C经硅胶柱色谱分离，用与流份F6相同的溶剂系统洗脱，得到山柰酚-7, 4′-二甲醚（32 mg）。（Teeratad Sudsai,Samran Prabpai, Palangpon Kongsaeree, et al. Anti-inflammatory activity ofcompounds from Boesenbergia longiflora rhizomes.Journal of Ethnopharmacology,2014，154（2）：453-461.）。
上述方法从不同角度论述了山柰酚-7, 4′-二甲醚的提取分离方法，分离纯度较高，但纯度大多数未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，无法满足高纯度山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品的需要。而关于山柰酚-7, 4′-二甲醚的测定，及对山柰酚-7,4′-二甲醚化学对照品的质量控制与评价的研究，现有技术中未见相关报导。
今后生产的各种药品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分析测试技术来获得发展和提高，否则将很容易失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈重要。“安全、有效和质量可控”的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场的制约关键，技术壁垒给发展中药产业带来了困难。因此，进行中草药化学成分的研究及质量标准规范化研究是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。
因此，对山柰酚-7, 4′-二甲醚进行质量标准研究，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制山柰酚-7, 4′-二甲醚质量的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造条件，具有重大的实际意义和学术价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法及其质量控制方法， 解决高纯度山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品的问题，
本发明参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品进行研究，建立了山柰酚-7, 4′-二甲醚的批量提取工艺，纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。
本发明通过以下技术方案实现：
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为90～98%及纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
本发明的工艺流程如图1所示。
具体地，所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的5～10倍，甲醇的体积浓度为70～100%，回流提取次数为2～5次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～A分钟，洗脱系统为石油醚；B～C分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为10～100:1；所述A为10～30，所述B为11～50，所述C为30～70。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。结果如图2所示。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为2～5:1，温度20～30 ℃，静置48～96小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为5～10 mL/min，检测波长为350～370nm，柱温为25～35℃。
步骤 5）所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为60～80:20～40。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5～10μm；流速0.8～1.2ml/min；进样量：10～20μL；面积归一化法定量；系统条件为以下两个条件的其中之一：
条件一：流动为相甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为70～80:20～30，检测波长260～365 nm；
条件二：流动为乙腈-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为60～70:30～40，检测波长260～365nm。
优选地，条件一中流动相甲醇与0.1%磷酸水溶液的体积配比为80:20。
本发明所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，也可适用于从益智果实中提取山柰酚-7,4′-二甲醚。益智果是姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的果实，别名：益智仁、益智子。
本发明的山柰酚-7, 4′-二甲醚是从姜科植物拟草果（学名：Amomum paratsao-ko S.Q.Tong et Y.M.Xia）的果实经提取、分离、精制、纯化而制得，其化学名、分子式、结构式如下：
中文名：山柰酚-7, 4′-二甲醚；
化学名：3,5-二羟基-7, 4′-二甲氧基黄酮（3,5-dihydroxy-7,4′-dimethoxy-flavone）；
英文名：kaempferol-7, 4′-dimethyl ether；
分子式：C17H14O6；
结构式：
Figure 801571DEST_PATH_IMAGE002
本发明对于产品山柰酚-7, 4′-二甲醚的质量控制方法如下：
一、含量与纯度测定：
精密称取于105℃干燥至恒重的对照品适量，加50%甲醇溶液制成每1ml含1mg的溶液，在测定条件下，进样20μl（约相当于20μg），注入液相色谱仪，用优选的3个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法和主成分自身对照法计算含量，结果系统测定对照品含量均在98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%。结果见表1。采用自身对照法测得山柰酚-7, 4′-二甲醚候选化学对照品色谱纯度为99.85（n=3），杂质总含量均在2.0 %以下。
表1 HPLC（系统一、系统二、系统三）归一化法定量分析结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
二、峰纯度检测：
取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，山柰酚-7, 4′-二甲醚的HPLC色谱峰>98%，其色谱图为单一峰，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。结果见图3、图4、图5。
本发明对HPLC色谱分析方法学考察如下：
色谱条件：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，甲醇-0.1%磷酸水（80:20）为流动相，检测波长350 nm，进样量20 μl；流量1mL/min。
一、线性关系考察
取山柰酚-7, 4′-二甲醚候选化学对照品，于105 ℃干燥至恒重，取约5 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为50.5 μg/mL的对照品储备液。分别吸取对照品储备液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至，摇匀，按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程为Y=0.0152X-0.0217，R=0.9997。山柰酚-7, 4′-二甲醚候选化学对照品在进样量为5.05～30.30 μg范围内具有较好的线性关系。
二、重现性、稳定性与精密度考察
取同一供试品6份，分别按上述方法及色谱系统测定，记录山柰酚-7, 4′-二甲醚色谱图及峰面积积分值，计算含量，结果平均含量99.74%，RSD为0.07%，说明该方法重现性良好。
取同一供试品溶液，在室温下放置2，4，6，8，10，12，24 h，依法进样测定，记录山柰酚-7, 4′-二甲醚色谱图及峰面积积分值，结果显示RSD=0.12%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。
取同一供试品溶液，连续进样6次，记录山柰酚-7, 4′-二甲醚色谱图及峰面积，结果RSD=0.09%，说明仪器精密度良好。
三、方法的耐用性考察考察
采用了3根不同厂家和品牌的色谱柱，分别进行保留时间、理论板数、分离度和杂质分离效果测定，在上述分析条件下，山柰酚-7, 4′-二甲醚峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度大于1.5，按山柰酚-7, 4′-二甲醚峰计算理论板数不低于4000时，可满足测定要求，如表2所示。
表2 保留时间、理论板数及分离度
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本发明的有益效果：
1、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱色谱后重结晶即可得到纯度较高的山柰酚-7, 4′-二甲醚，最后经高效制备液相色谱法制备出纯度达到98%以上的山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品，方法简便易行。
2、本发明生产所获得化合物经光谱分析确认为山柰酚-7, 4′-二甲醚。本发明先将拟草果的干燥果实粉碎，用甲醇回流提取，合并提取液后回收甲醇，再用石油醚萃取，得到石油醚萃取物；再经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，用薄层色谱检测，收集含有山柰酚-7,4′-二甲醚的洗脱液，合并，减压浓缩，重结晶，得到山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；再用高效液相制备色谱法分离纯化，对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱检测，分别得到纯度为90%～98%的山柰酚-7,4′-二甲醚和纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚组分。
3、本发明通过对山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品进行研究，建立山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。本发明可为山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，具有潜在而不可估量的社会效益与经济效益。
4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查，含量测定及质量控制，确保产品的质量。本发明工艺设计合理，工艺简单，分离速度快，生产周期短，所得产品纯度高，质量可控，适合工业化生产，具有很好的应用前景。
5、本发明从拟草果果实中制备出纯度符合化学对照品要求，含量在98%以上的山柰酚-7, 4′-二甲醚，解决了山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品的供应问题，为拟草果及其他含有山柰酚-7, 4′-二甲醚成分的药品的质量控制提供了提供科学基础和保证。
附图说明
图1是高纯度山柰酚-7, 4′-二甲醚的制备工艺流程图；
图2-1、2-2、2-3分别是山柰酚-7, 4′-二甲醚三种展开系统薄层色谱图；
图3是山柰酚-7, 4′-二甲醚高效液相色谱图；
图4是山柰酚-7, 4′-二甲醚高效液相色谱三维光谱图；
图5是山柰酚-7, 4′-二甲醚5点光谱图；
图6是山柰酚-7, 4′-二甲醚红外光谱图；
图7是山柰酚-7, 4′-二甲醚紫外吸收光谱图；
图8是山柰酚-7, 4′-二甲醚1H-NMR核磁共振光谱图；
图9是山柰酚-7, 4′-二甲醚13C-NMR核磁共振光谱图；
图10是山柰酚-7, 4′-二甲醚质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的甲醇量的百分数是体积百分数，v/v 表示溶液的体积比。
实施例1
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，得到纯度为95%及纯度为99.6%的山柰酚-7, 4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的9倍，甲醇的体积浓度为85%，回流提取次数为4次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～20分钟，洗脱系统为石油醚；21～50分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为10:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为2:1，温度20 ℃，静置96小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱；流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为5 mL/min，检测波长为365nm，柱温为25℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为80:20。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5μm；流速1.0ml/min；进样量：20μL；系统条件为：流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液的体积配比为80:20，检测波长350 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例2
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为97%及纯度大于98.5%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的7倍，甲醇的体积浓度为90%，回流提取次数为3次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～20分钟，洗脱系统为石油醚；21～40分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为12:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为3:1，温度25 ℃，静置56小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为8 mL/min，检测波长为350nm，柱温为30℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为75:25。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5μm；流速1.1ml/min；进样量：15μL；面积归一化法定量；系统条件为：流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液的体积配比为70:30，检测波长260 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例3
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为93%及纯度大于98.2%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的5倍，甲醇的体积浓度为100%，回流提取次数为2次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～25分钟，洗脱系统为石油醚；25～50分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为15:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为4:1，温度28 ℃，静置72小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为7 mL/min，检测波长为350nm，柱温为35℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为60～80:20～40。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5μm；流速1.2ml/min；进样量：10μL；面积归一化法定量；系统条件为：流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液的体积配比为75:25，检测波长260 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例4
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为95%及纯度大于98.9%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的10倍，甲醇的体积浓度为75%，回流提取次数为5次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～30分钟，洗脱系统为石油醚；31～50分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为10:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为5:1，温度30 ℃，静置48小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为7 mL/min，检测波长为365nm，柱温为25℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为75:25。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，10μm；流速1.2ml/min；进样量：10μL；面积归一化法定量；系统条件为：乙腈-0.1%磷酸水溶液的体积配比为60:40，检测波长365 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例5
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为96%及纯度大于99.0%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的8倍，甲醇的体积浓度为85%，回流提取次数为4次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～25分钟，洗脱系统为石油醚；25～50分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为12:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为4:1，温度26 ℃，静置85小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为5 mL/min，检测波长为365nm，柱温为25℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为80:20。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，10μm；流速0.8ml/min；进样量：10μL；面积归一化法定量；系统条件为：流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液的体积配比为80:20，检测波长365 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例6
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为95%及纯度大于98.3%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的6倍，甲醇的体积浓度为95%，回流提取次数为3次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～15分钟，洗脱系统为石油醚；15～30分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为10:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为2.5:1，温度27 ℃，静置60小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为8 mL/min，检测波长为366nm，柱温为30℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为70:30。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5μm；流速1.2ml/min；进样量：20μL；面积归一化法定量；系统条件为：流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液的体积配比为70:30，检测波长365 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
实施例7
一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，包括以下步骤：
1) 取益智果的干燥果实5kg，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为90.3%及纯度大于98.1%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的10倍，甲醇的体积浓度为100%，回流提取次数为5次。
步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～15分钟，洗脱系统为石油醚；15～30分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为10:1。
步骤 4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤 4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为4:1，温度26 ℃，静置85小时。
步骤 5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为5 mL/min，检测波长为365nm，柱温为25℃。所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为80:20。
所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5μm；流速1.1ml/min；进样量：15μL；面积归一化法定量；系统条件为：流动相甲醇-0.1%磷酸水溶液的体积配比为70:30，检测波长260 nm；面积归一化法定量，主成分（山柰酚-7,4′-二甲醚）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过 2.0%。
对实施例1-7制备得到的产品进行结构确证如下：
理化常数：山柰酚-7, 4′-二甲醚为黄色针状晶（甲醇），熔点173～175℃，溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮。
波谱数据鉴定：
1、红外吸收光谱（IR）
仪器：Bruker TENSOR 27FTIR；仪器校正和检定聚苯乙烯薄膜的IR谱，符合中国药典2015年版的规定；
样品制备方法：取样品适量，溴化钾压片；
测得的红外吸收光谱图见图6。
表3 山柰酚-7, 4′-二甲醚红外光谱数据
Figure DEST_PATH_IMAGE005
解析：
3310 cm-1：-OH的伸缩振动；1658 cm-1：C=O的伸缩振动；1594 cm-1~1417 cm-1芳环骨架振动；1259 cm-1、1154 cm-1：C-O-C；1087 cm-1、1032 cm-1：芳环C-H面内弯曲振动；879 cm-1、833 cm-1：芳环C-H面外弯曲振动。
、紫外吸收光谱（UV）
仪器：日本岛津UV-2550型紫外光谱仪；
仪器校正和检定，符合中国药典2015年版的规定；
溶剂：分析纯甲醇；
供试液：取样品适量，加甲醇配制成每1 mL含20 μg的溶液；
测得的紫外吸收光谱图见图7。
表4 山柰酚-7, 4′-二甲醚UV数据
溶剂 最大吸收 最大吸收峰(nm)
甲醇 364 267
解析：
紫外光谱在364、267nm处有两个最大吸收峰，为羟基与苯环共轭的p→π及双键、羰基与苯环共轭的π→π*跃迁所产生的峰。从紫外光谱图得知，结构中含有不饱和共轭体系的发色团和助色团。
、核磁共振谱
（1）1H-NMR 核磁共振谱
仪器：德国BRUKER AV-400；
溶剂：DMSO-d 6，内标TMS；
测得的1H-NMR 核磁共振波谱图见图8。
表5 1H-NMR 核磁共振谱数据表
Figure 812963DEST_PATH_IMAGE006
（2）13C-NMR 核磁共振谱
仪器：德国 BRUKER 100 MHz；
溶剂：DMSO-d 6，内标TMS；
测得的13C-NMR核磁共振波谱图见图9。
表6 13C-NMR 核磁共振谱数据
Figure DEST_PATH_IMAGE007
4、质谱（MS）
仪器：Thermo QE FOCUS 液质联用色谱仪
测试条件：流动相甲醇-0.1%甲酸水溶液，85:15；电离方式HESI源；正离子模式；电离能量30eV；分辨率70000。质谱图见图10。
测定数据见表7。
表7 ESI/MS质谱数据
实测值<i>m</i>/<i>z</i> 理论值<i>m</i>/<i>z</i>
315.08524[M+H]<sup>+</sup> 315.08686
测定结果：测定样品准分子离子峰m/z 315.08524 [M+H]+，测得其MS质量数为314，山柰酚-7, 4′-二甲醚的化合物分子式为C17H14O6相符。计算不饱和度为：Ω=（2×17+2-14）/2=11，符合本品结构。
综合上各光谱数据，各理化常数和光谱数据与山柰酚-7, 4′-二甲醚化合物结构相符，并与文献值基本一致，产品确定为山柰酚-7, 4′-二甲醚。
结果：本发明分离、纯化的山柰酚-7, 4′-二甲醚化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开系统5个不同浓度的TLC检测；3个流动相系统和3个不同波长的HPLC检测，结果符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于98%。

Claims (10)

1.一种高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1) 取拟草果的干燥果实，粉碎，用甲醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收甲醇，得浸膏；
2）浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩，得石油醚萃取物；
3）石油醚萃取物经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，收集含山柰酚-7,4′-二甲醚的流分；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，用氯仿-甲醇进行重结晶，得到纯度为重量含量80～90％的山柰酚-7,4′-二甲醚粗结晶；
5）将山柰酚-7, 4′-二甲醚粗结晶用高效液相制备色谱法分离纯化，收集山柰酚-7,4′-二甲醚素组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱法检测，将保留时间相同且纯度为 90～98%的山柰酚-7, 4′-二甲醚合并，并将保留时间相同且纯度纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚合并，分别进行减压浓缩，即可得到纯度为90～98%及纯度大于98%的山柰酚-7,4′-二甲醚。
2.根据权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：所述步骤 1）中甲醇的加入量为药材重量的5～10倍，甲醇的体积浓度为70～100%，回流提取次数为2～5次。
3.根据权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱参数为：0～A分钟，洗脱系统为石油醚；B～C分钟，洗脱系统为石油醚-乙酸乙酯，比例为10～100:1；所述A为10～30，所述B为11～50，所述C为30～70。
4.根据权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
三种展开剂系统：系统一，石油醚-丙酮-冰醋酸体积比为4:1:0.1；系统二，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸体积比为6:1:0.1；系统三，环己烷-三氯甲烷-冰醋酸体积比为3:1:0.3；
点样：用甲醇制成100 μg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为 2μg、4 μg、6μg、8μg、10μg；置展开缸分别展开，展距为10 cm；
定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；结果在薄层色谱中，可见黄绿色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
5.根据权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：步骤4）所述重结晶的条件为：氯仿与甲醇的体积比为2～5:1，温度20～30 ℃，静置48～96小时。
6.根据权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：步骤5）所述高效液相制备色谱法的参数如下：色谱柱为C-18柱，流动相为甲醇-0.2%乙酸水溶液，流速为5～10 mL/min，检测波长为350～370nm，柱温为25～35℃。
7.根据权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：所述步骤6）的高效液相色谱法具体为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，5～10μm；流速0.8～1.2ml/min；进样量：10～20μL；面积归一化法定量；系统条件为以下两个条件的其中之一：
条件一：流动为相甲醇-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为70～80:20～30，检测波长260～365 nm；
条件二：流动为乙腈-0.1%磷酸水溶液，两者体积配比为60～70:30～40，检测波长260～365 nm。
8.根据权利要求6所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：步骤5）所述的流动相中甲醇与0.2%乙酸水溶液的体积配比为60～80:20～40。
9.根据权利要求7所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，其特征在于：所述的系统条件一的流动相中，甲醇与0.1%磷酸水溶液的体积配比为80:20。
10.权利要求1所述的高纯度山柰酚-7,4′-二甲醚的制备方法，应用于从益智果实中提取山柰酚-7,4′-二甲醚。
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Assignee: GUANGXI JIAJIN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE & PHARMACEUTICAL SCIENCE

Contract record no.: X2023980046070

Denomination of invention: Preparation method and quality control method of a high-purity kaempferol-7,4 '- dimethyl ether

Granted publication date: 20230811

License type: Common License

Record date: 20231108