CN103145775B - 高纯度棒柄花苷a的制备及其质量控制方法 - Google Patents

Abstract

一种以大戟科棒柄花属植物棒柄花叶为原料，提供一种高纯度棒柄花苷A的制备方法、检测方法与用途，其方法是：先将大戟科植物棒柄花叶粉碎，用乙醇加热回流提取，乙醇提取物经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，用薄层色谱检测，收集含有棒柄花苷A的洗脱液，合并，减压浓缩，得到棒柄花苷A粗结晶；再用反相硅胶C-18柱制备高效液相法分离，对所收集的每一份洗脱液利用分析型高效液相色谱检测，合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间和98%以上的棒柄花苷A组分，减压浓缩，即可分别得到纯度在重量90%～98%之间的棒柄花苷A和纯度大于98%的棒柄花苷A组分，并采用薄层色谱和液相色谱进行质量控制。

Description

高纯度棒柄花苷A的制备及其质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种化合物单体制备领域，具体涉及一种高纯度棒柄花苷A的制备及其质量控制方法。

背景技术

化学对照品又称标准品，是中药质量标准研究、质量检测和质量控制的实物对照，中药化学对照品的研究，是中药标准化研究的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的基础与核心。

棒柄花苷A是一种苯丙素酚糖苷类化合物化学成分，是植物活性成分之一，也是许多植物和药品标准质量控制的指标性成分。目前尚未有相应的国家药品标准物质，国内外对棒柄花苷A中药化学对照品的系统研究未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对棒柄花苷A化学对照品进行研究，建立棒柄花苷A化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立棒柄花苷A化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。

棒柄花苷A作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的棒柄花苷A对照品，其市场需求很大，由于棒柄花苷A在药材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行棒柄花苷A中药化学标准品制备及其质量控制技术研究，解决高纯度棒柄花苷A化学对照品的问题，对中药现代化的作用是显而易见的，具有重大的实际意义和学术价值。

棒柄花苷A是从棒柄花植物分离得到的活性物质，从公开文献所知，仅有一篇文献报道棒柄花苷A的提取分离方法，如：1.【题名】棒柄花中反式-4-（1-丙烯基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷的化学结构分离鉴定【作者】刘布鸣 卢文杰 牙启康 陈家源【刊名】广西科学，2005，12（3）：214-215【文摘】：取大戟科植物棒柄花Cleidion brevipetiolatum Pax et Hoffm.，粉碎，用水提取数次，滤过，合并滤液，浓缩，过D101大孔树脂层析，用水洗脱，再用30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，浓缩，再进行硅胶柱层析，用氯仿、氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得粗结晶。将粗结晶反复进行硅胶H柱层析（加压）用氯仿-甲醇混合溶剂洗脱，得棒柄花素A结晶。经混合溶剂反复重结晶，得白色粉末结晶，经理化常数、UV、IR、¹HNMR、¹³CNMR、MS等波谱测试和解析，鉴定为反式4-（1-丙烯基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷。

上述方法采用传统的柱层析技术对反式-4-（1-丙烯基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷（棒柄花苷A）进行提取分离，分离得率低，生产周期长，提取量小，且纯度未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，该文献没有制备出高纯度的棒柄花苷A，也没有棒柄花苷A纯度与质量控制方法，无法满足高纯度棒柄花苷A化学对照品的需要。

发明内容

本发明的目的为了克服现有的棒柄花苷A纯度低、收率低或生产成本高的不足，以及无系统的棒柄花苷A的提取纯化与质量控制方法，提供一种高纯度棒柄花苷A的制备及其质量控制方法，该方法制备得到的棒柄花苷A纯度高、质量好，可以作为化学对照品或标准品，保证质量控制。

本发明是从大戟科棒柄花属植物棒柄花(Cleidion brevipetiolatum Pax et Hoffm.)中经提取、分离、精制、纯化而制得的棒柄花苷A，其化学名、分子式、结构式如下：

中文名：棒柄花苷A

化学名：反式-4-（1-烯丙基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷

英文名：trans-4-（1-propenyl）-phenol-β-D-glucopyranoside

分子式：C₁₅H₂₀ O₆

结构式如下：

本发明的目的是通过以下方案来实现的：

本发明的高纯度棒柄花苷A的制备方法，包括以下工艺过程：：取大戟科棒柄花叶，粉碎，用体积浓度50～90％的乙醇提取2-8次，每公斤棒柄花的干燥叶子加入乙醇的体积量为5～10倍，滤过，合并滤液，浓缩，回收乙醇，得浸膏，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集含棒柄花苷A的流分，薄层色谱TLC检测合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的棒柄花苷A粗结晶；将粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，色谱柱为C-18柱，利用乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为255nm，柱温为25℃～35℃，收集棒柄花苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间和纯度大于重量98%以上的棒柄花苷A，减压浓缩，得到纯度重量90%～98%之间以及大于98%以上的棒柄花苷A；

所述的氯仿-甲醇体积配比为：100:0～50:50；

所述的制备高效液相色谱法的流动相乙腈-水体积配比为：15:85～50:50；

所述的分析HPLC条件为：色谱柱为C-18柱；流动相（体积比）乙腈：水溶液=20:80～50:50；检测波长为255nm；流速为0.6 mL/min～1.5mL/min。

本发明高纯度化合物的质量控制方法如下：（1）薄层色谱方法进行棒柄花苷A分析；（2）液相色谱方法进行棒柄花苷A分析。

所述的薄层色谱方法：薄层板：硅胶G板（10×20cm）。3种展开剂系统：体积比：系统（1）醋酸乙酯-石油醚（60～90℃）（1:1），系统（2）苯-丙酮（2:1），系统（3）（3）氯仿-甲醇（7:3）；点样：取本品适量，用甲醇制1mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20mg、40mg、60mg、80mg、100mg 。置展开缸分别展开，展距：15cm。定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105℃烘至斑点显色清晰，置白光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。

所述的液相色谱方法：色谱条件：色谱柱C-18，4.6′250mm，10mm ；流速：1mL/min；进样量：10～20mL；面积归一化法定量。系统条件（1）流动相：甲醇-水溶液体积比例（30:70～60:40）；检测波长：2550nm；系统条件（2）流动相：乙腈-水溶液体积比例（20:80～50:50）；检测波长：255nm；系统条件（3）流动相：乙腈-水溶液体积比例（20:80～50:50）；检测波长：210nm。

含量与纯度测定：精密称取于105℃干燥至恒重的对照品适量，加体积浓度80%甲醇水溶液制成每1mL含1mg的溶液，在测定条件下，进样20mL（约相当于20mg），注入液相色谱仪，用3个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，结果系统测定对照品含量在均98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%。

峰纯度检测：取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，棒柄花苷A的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。

结果：本发明分离、纯化的棒柄花苷A化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开系统5个不同浓度的TLC检测，2个流动相系统和2个不同波长的HPLC检测，同时对色谱峰用DAD做纯度检查，表明符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于98%。

与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

1、本发明首次从棒柄花中制备出纯度符合化学对照品要求（含量98%以上）的棒柄花苷A，解决了棒柄花苷A化学对照品的供应问题，为棒柄花药材及其制剂的质量控制提供了提供科学基础和保证。

2、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱层析即可得到纯度较高的棒柄花苷A，最后经制备高效液相色谱法制备出纯度达到98%以上的棒柄花苷A化学对照品，方法简便易行。

3、本发明分离速度快，生产周期短，适合批量化、工业化生产，有很好的应用前景。

4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确保产品的质量。

与本发明在广西科学，2005，12（3）：214-215发表的文章相比，本发明改进了提取方法，由原来的水提改为醇提，其优点是，能够将所有的有效成分完全提取出来，纯化手段由柱层析改为制备液相，速度加快，也使得提取的棒柄花苷A纯度达到重量98%以上，不浪费有用的中药材资源，节约了成本。

通过对棒柄花苷A化学对照品进行研究，建立棒柄花苷A化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立棒柄花苷A化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。研究结果可为棒柄花苷A化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。今后生产的各种产品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分析测试技术来获得发展和提高，否则将失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈重要，“安全、有效和质量可控”的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场的制约关键，技术壁垒给发展中药产业带来了困难，因此，进行中草药化学成分的研究及质量标准规范化研究是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。毫无疑问，对棒柄花苷A进行质量标准研究，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制棒柄花苷A质量的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造条件，具有重大的实际意义和学术价值。

附图说明

图1是高纯度棒柄花苷A的制备工艺流程图；

图2是棒柄花苷A色谱峰紫外吸收光谱图；

图3是棒柄花苷A色谱峰纯度检查5点光谱图；

图4是棒柄花苷A DAD峰纯度检查HPLC色谱图；

图5是棒柄花苷A质量控制的HPLC检测色谱图。

具体实施方式

实施例一：取大戟科植物棒柄花的叶子5kg，粉碎成100目以下，体积浓度50％的乙醇提取3次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得乙醇提取物，得浸膏，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇体积比（100:0～95:5）梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比（95:5）洗脱部分，用TCL检测，收集含有棒柄花苷A的流分，合并，浓缩，得到棒柄花苷A粗结晶。将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C-18柱；体积比：流动相：乙腈:水=22:78；检测波长：255nm；流速：5mL/min），收集棒柄花苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测（色谱柱：C-18柱；流动相（体积比）：乙腈:0.2%磷酸溶液=28:72；检测波长：255nm；流速：1mL/min）合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于重量98%以上的棒柄花苷A，减压浓缩，得到纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的棒柄花苷A白色粉末。

实施例二：取大戟科植物棒柄花的叶子5kg，粉碎成100目以下，60％的乙醇提取4次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得乙醇提取物，得浸膏，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇（100:0～90:10）梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比（90:10）洗脱部分，用TCL检测，收集含有棒柄花苷A的流分，合并，浓缩，得到棒柄花苷A粗结晶。将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C-18柱；体积比：流动相：乙腈:水=20:80；检测波长：255nm；流速：5mL/min），收集棒柄花苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测（色谱柱：C-18柱；体积比：流动相：乙腈:0.2%磷酸溶液=30:70；检测波长：255nm；流速：1mL/min）合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的棒柄花苷A，减压浓缩，得到纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的棒柄花苷A白色粉末。

实施例三：取大戟科植物棒柄花的叶子5kg，粉碎成100目以下，80％的乙醇提取5次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得乙醇提取物，得浸膏，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇（100:0～85:15）梯度洗脱，收集体积比：氯仿-甲醇（85:15）洗脱部分，用TCL检测，收集含有棒柄花苷A的流分，合并，浓缩，得到棒柄花苷A粗结晶。将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C-18柱；体积比：流动相：乙腈:水=25:75；检测波长：255nm；流速：5mL/min），收集棒柄花苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测（色谱柱：C-18柱；流动相：乙腈:0.2%磷酸溶液=40: 60；检测波长：255nm；流速：1mL/min）合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的棒柄花苷A，减压浓缩，得到纯度在重量90%～98%之间以及纯度大于98%以上的棒柄花苷A白色粉末。

高纯度棒柄花苷A的质量控制方法：

【薄层鉴别】 取本品加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，在同一硅胶G板上，分别按0.5mg、1mg、3mg、5mg、10mg不同的浓度梯度点样，以醋酸乙酯-石油醚（60～900C）（1:1）、苯-丙酮（2:1）、氯仿-甲醇（7:3）三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%乙醇磷钼酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置白光下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。

【含量测定】照高效液相色谱法（中国药典2010年版附录VI D）测定。

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2%磷酸溶液（28:72）为流动相；检测波长255nm，理论板数按棒柄花苷A峰计算应不低于3000。

测定法  取于105℃干燥至恒重的本品适量，精密称定，加体积浓度80%甲醇水溶液制成每1mL含1mg的溶液，摇匀，精密量取 20mL注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，主成分（棒柄花苷A C₁₅H₂₀O₆）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。

具体实施方式

从图1中了解到，具体工艺为：

取大戟科棒柄花的干燥叶子，粉碎，用体积浓度50%乙醇提取2～8次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集含棒柄花苷A的流分，薄层色谱TLC检测合并，浓缩，即得纯度为重量80～90％的棒柄花苷A粗结晶；将粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，色谱柱为C-18柱，利用乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为255nm，柱温为25℃～35℃，收集棒柄花苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在重量90%～98%之间和纯度大于98%以上的棒柄花苷A，减压浓缩，得到纯度重量90%～98%之间以及大于98%以上的棒柄花苷A。

从图2看出，棒柄花苷A的紫外光谱在255±1nm处有最大吸收峰，为共轭双键的π→π*跃迁所产生的紫外特征吸收波长，紫外光谱与棒柄花苷A化学结构相符。

从图3看出，棒柄花苷A的5点色谱峰的光谱纯度检查，5点光谱完全重合，表明为单一纯物质峰。

从图4看出，棒柄花苷A的二极管阵列DAD峰纯度检查HPLC色谱图为单一的峰，表明为纯物质峰。

从图5看出，保留时间10分钟左右为主成分棒柄花苷A，主成分含量大于98.0%，各杂质峰面积总和不超过2.0%，其质量控制的HPLC检测色谱图峰结果数据信息如下：

Claims (2)

1.一种高纯度棒柄花苷A的制备方法，其特征在于：工艺过程如下：取大戟科棒柄花叶，粉碎，每公斤棒柄花的干燥叶子用5～10倍重量的体积浓度50～90％的乙醇回流提取2～8次，滤过，合并滤液，浓缩，回收乙醇，得浸膏，经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集含棒柄花苷A的流分，薄层色谱TLC检测合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的棒柄花苷A粗结晶；将粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，色谱柱为C-18柱，利用乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为255nm，柱温为25℃～35℃，收集棒柄花苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在重量含量90%～98%或大于98%以上的棒柄花苷A，减压浓缩，得到重量含量90%～98%或大于98%以上的棒柄花苷A白色粉末；

所述的棒柄花苷A是反式-4-（1-烯丙基）-苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；

所述的氯仿-甲醇体积配比为：100:0～50:50；

所述的制备高效液相色谱法的流动相乙腈-水体积配比为：15:85～50:50；

所述的分析HPLC条件为：色谱柱为C-18柱；流动相为体积比：乙腈：水溶液=20:80～50:50；检测波长为255nm；流速为0.6 mL/min～1.5mL/min。

2.一种如权利要求1高纯度棒柄花苷A的检测方法，其特征在于：采用薄层色谱分析方法或HPLC分析方法，所述的薄层色谱分析方法：薄层板：硅胶G板；3种展开剂系统：体积比：系统（1）醋酸乙酯-石油醚，60～90℃时为1:1，系统（2）苯-丙酮为2:1，系统（3）氯仿-甲醇为7:3；点样：取本品适量，用甲醇制1mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20mg、40mg、60mg、80mg、100mg；置展开缸分别展开，展距：15cm；定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105℃烘至斑点显色清晰，置白灯下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；

所述的液相色谱方法：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250mm，10μm；流速：0.6～1.5mL/min；进样量：10～20μL；面积归一化法定量；系统条件（1）流动相：甲醇-水溶液体积比例30:70～60:40；检测波长：255nm；系统条件（2）流动相：乙腈-水溶液体积比例15:85～50:50；检测波长：255nm；系统条件（3） 流动相：乙腈-水溶液体积比例15:85～50:50；检测波长：210nm；

含量与纯度测定：精密称取于105℃干燥至恒重的对照品适量，加体积比80%甲醇水溶液制成每1mL含1mg的溶液，在测定条件下，进样20μL，注入液相色谱仪，用2个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，结果系统测定对照品含量在均98%以上；杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%；

峰纯度检测：取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，棒柄花苷A的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。