CN102133298B - 一种双水相萃取白英中总皂苷的方法 - Google Patents

一种双水相萃取白英中总皂苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种双水相萃取白英中总皂苷的方法。本发明的特征在于：将白英药材粉碎，加入溶剂，固液浸提，过滤除杂后得到白英粗提液；取上述白英粗提液，浓缩至原来体积的1/5，加入无水乙醇/硫酸铵形成的双水相系统，加水使系统总量为一定值，混匀，静置后分为上下两相；取出含有大量白英总皂苷的无水乙醇相，对其进行减压浓缩，得到白英总苷提取物。本发明的有益效果是：提高了白英总皂苷的萃取率，所使用的溶剂低毒，有利于环保，同时方法本身既简便又经济。

Description

一种双水相萃取白英中总皂苷的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种双水相萃取白英中总皂苷的方法。
背景技术
白英为茄科植物Solanum lyratum Thunb. 的干燥全草，又名白毛藤，主产于江苏、浙江、江西，性微寒，味苦。最早见于《本经》记载，列为上品，为传统中药。具有清热解毒、祛风化痰、除湿等功效，用于治疗癌症肿瘤、疱疹、疟疾、黄疸、水肿、淋病、风湿性关节炎、白带异常等病证。白英含有多种化学成分，主要有甾体皂苷类、甾体生物碱类、有机酸类等化合物。其中皂苷类成分主要包括以薯蓣皂苷元、替告皂苷元、雅姆皂苷元等皂苷元为母核的多种甾体皂苷。药理研究显示白英中总皂苷在体内外均具有一定的抗肿瘤作用，且存在一定的选择性。
现代研究证实以薯蓣皂苷元为母核的甾体皂苷具有抗肿瘤、改善心血管功能、调节免疫、抗血小板聚集、降血脂等多种药理作用，同时也是目前合成各种甾体激素类药物的重要原料。因此，含此类成分中药的应用前景十分广阔，是备受关注的天然化合物之一。
白英中的皂苷大多以糖苷形式存在，一般提取时多采用水、甲醇、乙醇水溶液做提取溶剂，用正丁醇做萃取剂。另据报道，有人采用大孔吸附树脂的方法提取分离皂苷类化合物。采用正丁醇萃取，使用的溶剂毒性较大，而且需重复三次，操作繁琐；采用大孔吸附树脂，前处理方法复杂，而且提取率较低，费时。
双水相萃取技术(Aqueous two-phase extraction, ATPS)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相，利用被分离物在两相中分配的不同而分离的技术。双水相萃取技术以其萃取条件温和，分相快速、处理容量大、回收率高、能耗低、萃取原理简便、设备投资费用少、操作简单，且不存在有机溶剂残留问题等优点，目前已在生物化学，细胞生物学和生物化工等领域得到广泛应用。中草药有效成分分子中多具有疏水性结构，因此双水相萃取技术在中草药有效成分分离纯化中的应用是当前研究的热门。
发明内容
为了避免现有技术的不足之处，本发明提供了一种双水相萃取白英中总皂苷的方法，这种方法不但避免了有毒溶剂的使用，提高了白英中总皂苷的提取率，而且方法本身操作简便、经济。
本发明的技术方案为：
（1）固液浸提：将白英药材粉碎，加入溶剂，固液浸提，过滤除杂后得到白英粗提液；
（2）双水相萃取：取上述白英粗提液，浓缩至原来体积的1/5，加入无水乙醇/硫酸铵形成的双水相系统，加水使系统总量为一定值，混匀，静置后分为上下两相；
（3）减压蒸馏，真空干燥：取出含有大量白英总皂苷的无水乙醇相，对其进行减压浓缩，得到白英总皂苷提取物。
上述加入的无水乙醇质量分数为系统总量16%-30%，加入的硫酸铵质量分数为系统总量的17%-22%。
为了进一步提高白英总皂苷的回收率，本发明可进一步优化反应条件、步骤。
（1）在固液浸提中，加入的溶剂为甲醇、乙醇、水或者它们的组合溶液，加热回流提取1小时，提取三次。合并三次提取后的滤液，减压蒸馏，真空干燥。
（2）在双水相萃取中，无水乙醇质量分数为16%-30%，硫酸铵的质量分数为17%-22%，分相温度为30℃-80℃，分相时间为10分钟，pH为5. 0-9.0。
（3）在减压蒸馏，真空干燥中，减压蒸馏的温度为70℃-80℃。
利用高氯酸显色，可见分光光度法测定双水相萃取体系中白英总皂苷的浓度，按公式（1）计算回收率。
回收率：Y=RK/(1+RK)×100%                     (1)
相比：R=Vt/Vb
分配系数：K=Ct/Cb
   Vt、Vb——分别是上下相体积(ml)
Ct、Cb——分别是上下相白英总皂苷的质量浓度(μg/ml)
总皂苷的含量测定采用分光光度法，对照品和样品的吸收光谱图如图1、图2。
具体步骤如下：称取一定量的白英总皂苷提取物，精密称定，加入一定体积的高氯酸，在65℃水浴中加热15min，立即取出于冰水冷却放置15min，以空白溶液做参比，在410 nm波长处测定吸光度，代入标准曲线计算白英中总皂苷的含量。
      薯蓣皂苷元的含量测定：采用高效液相法，对照品和样品的色谱图如图3、图4。
具体步骤如下：称取一定量的白英总皂苷提取物，精密称定，加入一定量的2mol/L的盐酸，在100℃的水浴中加热水解2h，冷却后加入适量氯仿，加热回流萃取三次，每次15min,合并氯仿萃取液，水浴蒸干，甲醇定容至一定刻度的容量瓶，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液，进样20μl，即得。采用外标法定量。平行测定3份。
与已有技术相比，本发明所提供的双水相萃取白英中总皂苷的方法的优点在于：
（1）分相迅速，回收率高
在实验中观察到，采用双水相萃取法，约10分钟即可分相，并且没有乳化层，缩短了实验周期，且回收率高。
（2）过程集成
双水相萃取既达到了预处理的目的，又浓缩了料液，浓缩倍数达到4倍以上。
（3）避免了有毒溶剂正丁醇的使用，采用了低毒的无水乙醇，利于环保且节约试剂。
（4）界面张力小，有助于两相之间的质量传递。
（5）大量杂质可与固体物质一同除去，有利于纯化样品。
（7）易于工艺放大和连续操作，与后续纯化工序可直接相连，无需进行特殊处理。
（8）本发明方法简单，易于掌握，且条件温和，整个操作过程在常温常压下进行。
附图说明
图 1 为薯蓣皂苷元对照品紫外吸收光谱图
横坐标为吸收波长(nm)，纵坐标为吸光度(A)，最大吸收波长为410 nm。
图 2 为总皂苷提取物紫外吸收光谱图
横坐标为吸收波长(nm)，纵坐标为吸光度(A)，最大吸收波长为410 nm。
图 3 为薯蓣皂苷元对照品高效液相色谱图
横坐标为时间(t)，纵坐标为响应(mv)，保留时间为12.17 min。
图 4 为总皂苷提取物的高效液相色谱图
横坐标为时间(t)，纵坐标为响应(mv)，保留时间为12.17 min。
具体实施方式
    以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1） 固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，其中无水乙醇质量分数为25%，硫酸铵的质量分数为17%，pH为5.8，30℃ 放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为76.8%。
（3）取出无水乙醇相，置于70℃减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。
实施例2：
（1） 固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，其中无水乙醇质量分数为25%，硫酸铵的质量分数为22%，pH为5.8，30℃放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为77.0%。
（3）取出无水乙醇相，置于75℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。实施例3：
（1）固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，其中无水乙醇浓度为16%，硫酸铵浓度为20%，pH为5.8，30℃放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为65.4%。
（3）取出无水乙醇相，置于80℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。
实施例4：
（1）固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，其中无水乙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为20%，pH为5.8，30℃放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为94.5%。
（3）取出无水乙醇相，置于70℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。
实施例5：
（1）固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，，其中无水乙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为20%，pH为5.0，30℃放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为93.5%。
（3） 取出无水乙醇相，置于70℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。
实施例6：
（1）固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，，其中无水乙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为20%，pH为9.0，30℃放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为92.4%。
（3）取出无水乙醇相，置于80℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。
实施例7：
（1）固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重反复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，其中无水乙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为20%，分相温度为30℃，pH为7.0，放置10分钟，静置分相。其中总皂苷在无水乙醇相的收率为95.2%。
（3）取出无水乙醇相，置于75℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物.
实施例8：
（1）固液浸提
取粉碎的白英药材约1.0 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重反复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
（2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵双水相系统，其中无水乙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为20%，分相温度为80℃，pH为7.0，放置10分钟，静置分相。
其中总皂苷在无水乙醇相的收率为95.4%。
（3）取出无水乙醇相，置于70℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。
实施例9：
    （1）固液浸提
取粉碎的白英药材三批，各约50 g，精密称定，在90℃水浴中用体积分数为70%乙醇热回流提取1h，重复3次后过滤，滤液加热浓缩得浸膏，以水分散至原滤液体积的1/5，即得白英样品溶液。
     （2）双水相萃取
取上述白英样品溶液，加入无水乙醇/硫酸铵(质量分数比1.5:1)双水相系统，，其中无水乙醇浓度为30%，硫酸铵浓度为20%，分相温度为30℃，调节pH为7.0，放置10分钟，静置分相。
     （3） 取出无水乙醇相，置于70℃下减压蒸馏，真空干燥后得到白英总皂苷提取物。计算收率分别为0.311%，0.316% 和0.300%，平均收率为0.309%。
（4）含量测定
按总皂苷的含量测定项下方法测定总皂苷的含量；按薯蓣皂苷元含量测定项下方法测定薯蓣皂苷元的含量，结果见表1。
表 1 白英总皂苷提取物中总皂苷及薯蓣皂苷元的含量
批号 20101001 20101002 20101003
总皂苷的含量(%) 86.6 89.1 86.9
薯蓣皂苷元的含量(%) 18.2 18.0 17.0

Claims (7)

1.一种双水相萃取白英中总皂苷的方法，其特征在于：
（1）固液浸提：将白英药材粉碎，加入溶剂，固液浸提，过滤除杂后得到白英粗提液，所述溶剂为甲醇、乙醇、水或者它们的组合溶液；
（2）双水相萃取：取上述白英粗提液，浓缩至原体积的1/5，加入无水乙醇/硫酸铵形成的双水相系统，加水使系统总量为一定值, 混匀，静止后分为上下两相，
（3）减压蒸馏，真空干燥：取出含有大量白英总皂苷的无水乙醇相，对其进行减压浓缩，得到白英总皂苷提取物。
2.根据权利要求 1 所述的一种双水相萃取白英总皂苷的方法，其特征在于：在固液浸提中，加体积分数为70%、体积为白英药材10倍量的乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1小时。
3.根据权利要求 1 所述的一种双水相萃取白英总皂苷的方法，其特征在于：加入的无水乙醇与硫酸铵质量分数比为1.5:1。
4.根据权利要求 1或3所述的一种双水相萃取白英总皂苷的方法，其特征在于：加入的无水乙醇质量分数为16%-30%，加入的硫酸铵质量分数为17%-22%。
5.根据权利要求 1 所述的一种双水相萃取白英总皂苷的方法，其特征在于：在双水相萃取中，分相温度为30℃-80℃，分相时间为10分钟。
6.根据权利要求 1 所述的一种双水相萃取白英总皂苷的方法，其特征在于：在双水相萃取中，其pH为5.0-9.0。
7.根据权利要求 1 所述的一种双水相萃取白英总皂苷的方法，其特征在于：在减压蒸馏，真空干燥中，减压蒸馏的温度为70℃-80℃。
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