CN1974527B - 从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，具体涉及从杜仲叶中制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法。它是将杜仲叶粉碎，用pH值为3～6的45％～55％乙醇溶液提取；取提取液上中极性的JD-1型大孔树脂柱进行饱和吸附，依次用水、20％～45％的乙醇溶液、60％～75％的乙醇溶液进行洗脱，分别得绿原酸粗品和含总黄酮的干粉；取绿原酸粗品上硅胶柱，用乙酸乙酯或丙酮或甲醇或乙醇进行洗脱，分段收集后洗脱液，减压浓缩，浓缩物用丙酮或水重结晶，得绿原酸精品。本发明的工艺简单，操作方便，大孔树脂可反复使用，综合成本低，用于工业化生产将有很好的前景。

Description

从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法

技术领域

本发明涉及以植物为原料提取制备有效成分的方法，具体涉及从杜仲叶中制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法。

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides)在我国是一种具有2000多年历史的中药材，其功效为补肝肾，强筋骨，安胎等；同时杜仲对治疗高血压症有特效。绿原酸和黄酮类化合物为杜仲叶主要有效成分，具有显著的生理活性。绿原酸为咖啡酰奎尼酸衍生物，具有利胆、抗菌、抗病毒、降压、升高白细胞及兴奋中枢神经系统等多种药理作用，是保健食品，药品、化妆品等工业的重要原料。绿原酸多从植物中提取，以往国内外提取绿原酸主要从生咖啡豆和金银花中获得。

杜仲叶为杜仲科落叶乔木杜仲的叶子，其绿原酸含量为1％～5.5％，一直以来人们都是以杜仲皮入药，而叶子往往被废弃。杜仲叶资源丰富、来源广泛，在提取绿原酸的同时还可以从杜仲叶中提取杜仲叶总黄酮，杜仲叶总黄酮具有抗菌、消炎、抗感冒、降血压、抗肿瘤及抗爱滋病等功效，因而以杜仲叶为原料提取绿原酸和总黄酮具有广阔的开发前景。

国内学者马希汉等“从杜仲叶中提取绿原酸纯品的研究”(西北林学院学报1996，11(2)：58-60)中报道用40％乙醇提取，铅沉淀法分离等手段对杜仲叶中绿原酸的提取分离进行了研究，此方法所用到的有机试剂较多，操作烦琐，得率较低(0.5％)，只适合于实验室小量制备。

专利CN1400199A公开了一种从杜仲叶中连续提取活性物质的方法。该法以水、甲醇或乙醇为提取剂，用水提取杜仲叶绿原酸和总黄酮的提取效率都不高；甲醇有毒，不适合工业化生产；乙醇提取成本较高，回收时对设备的要求高，因而存在一定局限性。该专利方法通过大孔树脂分离、乙酸乙酯萃取和混合溶剂重结晶等工序提取绿原酸和杜仲总黄酮。其中所用到的大孔树脂为非极性树脂，对绿原酸的吸附率不高；同时在绿原酸的精制过程中用乙酸乙酯反复萃取，该工艺操作麻烦，萃取过程易出现乳化现象，耗时长；而且精制时用乙酸乙酯-氯仿重结晶，采用二元溶剂体系重结晶，溶剂复杂，母液回收设备要求高，不易实现产业化。

专利CN1687435A公开了一种高纯度绿原酸工业化生产工艺。该工艺主要步骤是原料用石油醚预处理，加生物复合酶提取，提取液调酸乙酸乙酯萃取，碱中和萃取液后水相酸沉，酸沉沉淀重结晶。该工艺存在以下不足：该工艺前处理用石油醚脱脂，其石油醚用量为原料的2～3倍，溶剂耗用量大，但一般在短时间内不可能达到理想效果，同时需加生物复合酶浸渍24～36小时，这使得整个生产周期较长；同时工艺过程包括前处理，提取、浓缩、加酸萃取、碱中和、酸沉、重结晶等步骤，且在有些步骤中还加生物复合酶、还原复合酶等，工艺操作步骤多而烦琐，所涉及的试剂种类多，数量大，不适合工业化生产。

专利CN1273964A公开了一种杜仲叶制备绿原酸工艺。该工艺主要由超声预处理和高温提取、超滤、乙酸乙酯萃取、D-140树脂分离等步骤来完成，该专利主要存在以下不足：(1)提取前用超声预处理，工艺过程繁琐，成本高，工业上实现难度大；(2)绿原酸为热敏性成分，高温提取容易产生分解，按CN1273964A专利的提取条件在100℃提取80～120min，绿原酸的回收率仅为60％；(3)该专利工艺过程中步骤比较多，用到超滤、沉淀剂沉淀、大孔树脂等方法，工艺复杂，设备成本高，操作烦琐，而且在提取时温度选取还存在不合理等问题，因此，实现工业化生产的难度大。

随着市场上对绿原酸和杜仲叶总黄酮的需求不断增长，如何简便、快速地从杜仲叶中得到质量稳定、纯度高、收率高、安全可靠的绿原酸和总黄酮的工艺方法研究很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种工艺操作简便，成本低，无有害溶剂，得率高，适用于工业化生产的从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法。

为达到上述的目的，本发明是从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，其主要步骤是：(1)提取：是将杜仲叶粉碎成粗粉，用pH值为3～6的45％～55％乙醇溶液在60～70℃搅拌提取2～3次，每次提取时间0.5～2小时，合并提取液浓缩至原体积的1/8～1/15后离心，取上清液为杜仲叶的提取液；(2)分离：是取提取液上中极性的JD-1型大孔树脂柱进行饱和吸附，依次用水、20％～45％的乙醇溶液、60％～75％的乙醇溶液进行洗脱，弃去水洗脱液，收集20％～45％的乙醇溶液洗脱液浓缩成稠膏得绿原酸粗品，收集60％～75％的乙醇溶液的洗脱液浓缩成稠膏、干燥即得到杜仲叶总黄酮重量含量为40％～80％的干粉；(3)精制：是取绿原酸粗品用C₁-C₃脂肪醇或丙酮使刚溶解后加入硅胶或硅藻土拌样上硅胶柱，用乙酸乙酯或丙酮或甲醇或乙醇为洗脱剂进行洗脱，分段收集流分，以高效液相色谱法进行监测，含量高于90％的流分，减压浓缩，浓缩物用丙酮或水重结晶，结晶产物为纯度96％～99％的绿原酸精品，高效液相色谱法进行监测，含量低于90％的流分干燥后按绿原酸粗品的处理方法重新上硅胶柱分离。

提取时优化的工艺条件是取杜仲叶粉碎成粗粉，用pH＝4的45％乙醇溶液进行搅拌提取2～3次，每次提取时间0.5～2小时，合并提取液浓缩至原体积的1/10后离心，取上清液为杜仲叶的提取液。

分离上大孔树脂柱时，吸附提取液的流速以0.5～3个保留体积/小时，洗脱时的流速为2～5个保留体积/小时为佳；最优化的吸附提取液的流速为0.5个保留体积/小时，洗脱时的流速为2个保留体积/小时。

精制时是取绿原酸粗品用甲醇溶解后加硅胶拌样上硅胶柱进行洗脱为佳，并所用绿原酸粗品，以干品质量计与硅胶质量之比为1∶8～1∶20为佳，以1∶10为最优。具体操作是将称好量的100～400目硅胶装入柱长20～400cm，柱直径5～100cm的硅胶柱中，硅胶上柱可以用亲脂性溶剂分散后上柱或直接干法上柱，直接干法上柱可以加压使柱床压实。用适量C₁-C₃脂肪醇或丙酮使绿原酸粗品刚溶解后，加入相当于绿原酸粗品干重的0.5～2.5倍硅胶或硅藻土拌样上柱。硅胶柱分离时所用的单一溶剂洗脱系统为乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇。

分段收集的流分以HPLC法进行监测，含量高于90％的流分合并后进行重结晶，重结晶所用的溶剂为丙酮或热水；含量低于90％的流分干燥后按绿原酸粗品的处理方法重新上硅胶柱分离。

本发明中所述的杜仲叶总黄酮的含量用紫外分光光度法测定(尉芹，王冬梅，马希汉等.杜仲叶总黄酮含量测定方法研究[J].西北农林科技大学学报，2001，29(5)：119-123)，绿原酸的含量用高效液相色谱(HPLC)测定(张凤云，毛富春，张康健等.杜仲叶中绿原酸的测定方法比较[J].西北林学院学报，1996，11(2)：54-47)。

绿原酸和总黄酮的提取率、回收率和收率定义为：

绿原酸的收率＝(得到的绿原酸质量/原料杜仲叶的质量)×100％

绿原酸的提取率＝(得到的绿原酸质量/原料杜仲叶中的绿原酸的质量)×100％

绿原酸的回收率＝(所得产物中绿原酸质量/所投原料的绿原酸质量)×100％

绿原酸的解吸率＝(所得产物中绿原酸质量/树脂中吸附的绿原酸质量)×100％

总黄酮的收率＝(得到的总黄酮质量/原料杜仲叶的质量)×100％

总黄酮的提取率＝(得到的总黄酮质量/所投原料的总黄酮质量)×100％

本发明的有益效果

本发明从杜仲叶中制备高纯度绿原酸和总黄酮，绿原酸和总黄酮的得率得到很大程度的提高，其与上述专利方法的比较结果如下表所示。

不同专利方法对绿原酸和总黄酮提取效果的比较

1、采用本发明所提供的方法，产品质量稳定，目标成分含量高，收率好，是一种安全可靠的制备工艺。

2、本法工艺流程简单，操作方便，是适合于工业化生产的制备方法。

3、绿原酸的精制过程无污染，用单一的溶剂进行分离和重结晶，此工艺简单、操作方便，所用溶剂易于回收，时间短，所有溶剂均可回收使用，便于工业化生产。

综上所述，本发明的工艺简单，操作方便，大孔树脂和硅胶可以反复使用，综合成本低，用于工业化生产将有很好的前景。

下面通过具体实施例阐述本发明的技术方案和有益效果。

具体实施方式

实施例所用的杜仲叶中绿原酸含量为2.31％，总黄酮含量为6.35％。

实施例1提取工艺条件的选择：

(1)杜仲叶粉碎对绿原酸和总黄酮提取率的影响

实验方法：将杜仲叶5.0kg用45％pH＝4的乙醇溶液40L，在70℃下进行搅拌提取两次，第一次用25L溶剂提取2小时，第二次用15L溶剂提取1小时，提取液浓缩至4L后静置1.0小时离心，取上清液干燥，分别计算绿原酸和总黄酮的提取率。结果如下表所示

由上表可知，将杜仲叶粉碎，增加原料与提取溶剂的接触面积，提高了有效成分的提取率。将杜仲叶粉碎成粗粉、中粉和细粉时，杜仲叶绿原酸和总黄酮提取率都得到很大程度的提高，且粉碎成粗粉、中粉或细粉时提取率相差不大；但是原料太细提取时不好操作，故考虑将杜仲叶粉碎成粗粉。

(2)提取溶剂pH值对提取率的影响

实验方法：杜仲叶粗粉5.0kg用45％，pH值不同的乙醇溶液40L在70℃下进行搅拌提取两次，第一次用25L溶剂提取2小时，第二次用15L溶剂提取1小时，提取液浓缩至4L后静置1.0小时离心，取上清液干燥，分别计算绿原酸和总黄酮的提取率。结果如下表所示

实验结果显示采用45％，pH＝2的乙醇提取时，绿原酸和总黄酮的提取率都不高，不控制提取溶剂的pH值时提取率也不是太理想，采用45％，pH＝3～6的乙醇搅拌提取，增加提取溶剂的穿透力，提高了绿原酸和总黄酮的提取率。

(3)提取过程中搅拌对提取率的影响

实验方法：将杜仲叶粗粉5.0kg用45％，pH＝4的乙醇溶液40L在70℃下进行提取两次，第一次用25L溶剂提取2小时，第二次用15L溶剂提取1小时，提取液浓缩至4L静置1.0小时离心，取上清液干燥，分别计算绿原酸和总黄酮的提取率。结果如下表所示

实验结果显示采用搅拌提取杜仲叶粗粉，增加提取溶剂与杜仲叶的接触面积，采用搅拌绿原酸和总黄酮提取率比不搅拌时有较大的提高。

(4)提取温度对提取率的影响

实验方法：杜仲叶粗粉5.0kg用45％，pH＝4的乙醇溶液40L在不同温度条件下进行提取两次，第一次用25L溶剂提取2小时，第二次用15L溶剂提取1小时，提取液浓缩至4L后静置1.0小时离心，取上清液干燥，分别计算绿原酸和总黄酮的提取率。结果如下表所示

实验结果显示温度在40℃和90℃时，绿原酸和总黄酮的提取率较低，控制温度在60～70℃提取杜仲叶粗粉，绿原酸和总黄酮都能够很好的溶出，提取率有很大的提高。

结论：本专利提取过程中将杜仲叶粉碎成粗粉并搅拌，增加原料与提取溶剂的接触面积，同时采用45％～55％，pH＝3～6的乙醇提取杜仲叶粗粉，增加提取溶剂的穿透力，提高了有效成分的提取率。因此，提取的最优工艺是将杜仲叶粉碎成粗粉，用45％～55％，pH值为3～6的乙醇溶液在60～70℃进行提取2～3次，每次提取时间0.5～2小时，合并提取液浓缩至原体积的1/10后离心，取上清液为杜仲叶的提取液。

实施例2分离工艺的选择

(1)大孔树脂类型的选择对分离效果的影响

实验方法：将5kg杜仲叶粗粉用45％，pH＝4的乙醇溶液在70℃进行提取2次，每次提取时间1.5小时，合并提取液浓缩至4L后离心，取上清液为杜仲叶的提取液，测定提取液折干重量为0.9kg、绿原酸质量含量为11.3％和总黄酮质量含量为30.5％。将提取液平均分成7份，用大孔树脂进行静态饱和吸附，分别计算不同类型树脂对绿原酸和总黄酮的吸附容量和解吸率。大孔树脂主要选择非极性树脂XDA-5、LSA-20、D140，极性树脂NKA-II、HPD-400、HPD-400A和本发明方法中的中极性树脂JD-1。

通过对不同类型的树脂比较，结果显示中极性树脂JD-1型对杜仲叶中的绿原酸和总黄酮吸附容量大、解吸率高，是非常适合于分离绿原酸和杜仲总黄酮的树脂。同时JD-1树脂符合药用要求的大孔吸附树脂质量标准，它具备吸附容量大.容易洗脱和再生的特点，使用起来极其方便而且安全可靠。

(2)大孔树脂吸附和洗脱流速对分离效果的影响

实验方法：将5kg杜仲叶粗粉用45％，pH＝4的乙醇溶液40L在70℃进行提取2次，每次提取时间1.5小时，合并提取液浓缩至4L后离心，取上清液为杜仲叶的提取液，测定提取液折干重量为0.9kg、绿原酸质量含量为11.3％和总黄酮质量含量为30.5％。将所得提取液平均分成6份，分别上JD-1大孔树脂柱中进行饱和吸附和洗脱，吸附流速为0.5～3个保留体积/小时，洗脱流速为2～5个保留体积/小时，经过实验考察可知最优分离的吸附流速为0.5个保留体积/小时，最优洗脱流速为2个保留体积/小时，实验结果如下表所示。流速的大小对大孔树脂的分离有一定的影响，吸附时流速太大，有效成分不能很好的吸附在树脂上，流速太小又使生产周期延长。

实施例3绿原酸精制过程的工艺选择

(1)硅胶用量对绿原酸硅胶柱分离的影响

实验方法：取绿原酸粗品0.25kg(含量为24.5％)用100ml甲醇使溶解，用125g硅胶拌样上硅胶柱，硅胶柱中硅胶用量为绿原酸粗品干重的6～15倍，再用乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱，分段收集后减压浓缩，分段收集的流分以HPLC法进行监测，含量高于90％的流分合并浓缩干燥。结果显示硅胶用量少于绿原酸粗品干重6倍时绿原酸粗品没有得到很好的分离，90％的绿原酸收率不高，当硅胶用量大于粗品干重15倍时，不仅浪费硅胶，而且损失的绿原酸也多，所以硅胶用量是绿原酸粗品6～15倍量时比较适宜，其中硅胶的质量是绿原酸粗品干重的10倍为最优。具体实验结果如下表所示。

(2)流动相对绿原酸硅胶柱分离的影响

实验方法：取绿原酸粗品0.25kg(含量为24.5％)用100ml甲醇使溶解，用125g硅胶拌样上硅胶柱，用洗脱剂进行洗脱，分段收集后减压浓缩，分段收集的流分以HPLC法进行监测，含量高于90％的流分合并浓缩干燥。结果表明，所选的乙醇、丙酮、乙酸乙酯和甲醇为洗脱剂绿原酸回收率都在85％以上，以乙酸乙酯的效果为优。乙酸乙酯-氯仿和乙酸乙酯-甲酸-水虽然洗脱效果也好，但是混合溶剂体系回收设备要求高，不易于产业化。具体实验结果如下表所示。

(3)重结晶溶剂对绿原酸精制的影响

实验方法：将同一批得到的含量为90％的绿原酸用溶剂法进行重结晶。具体实验结果如下表所示。

结论：由上表可以看出，用以上三种溶剂对绿原酸进行重结晶时，乙酸乙酯的效果没有水和丙酮效果好，乙酸乙酯重结晶很难得到纯度高于96％的绿原酸精品。所以重结晶工艺以丙酮或水进行重结晶。

实施例4称取杜仲叶粗粉5.0kg，，配制45％的乙醇40L，用浓盐酸调pH为4，在60～70℃下进行搅拌提取两次(第一次用25L乙醇溶液提取2小时，第二次用15L乙醇溶液提取1小时)，滤过，合并提取液，浓缩至4L后静置1.0小时离心。取上清液加入处理好的大孔树脂柱中进行饱和吸附，依次用水、45％乙醇、65％乙醇进行洗脱，吸附提取液的流速为0.5个保留体积/小时，解吸时的流速为2个保留体积/小时，弃去水洗液，收集45％乙醇溶液洗脱液浓缩得到绿原酸稠膏0.23kg，收集65％乙醇溶液洗脱液，浓缩成稠膏、干燥得到杜仲叶总黄酮含量为80％的干粉0.31kg，收率为4.96％。取绿原酸稠膏0.2kg用50ml甲醇溶解后加入0.1kg的硅胶拌样上硅胶柱，分离所用硅胶质量是2kg，以乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱。分段收集流分，合并90％以上绿原酸减压浓缩得到绿原酸0.078kg，浓缩物用丙酮重结晶，可获得纯度99.9％的绿原酸精品0.072kg，总收率为1.44％。

实施例5将杜仲叶粗粉5.0kg按实施例4的方法进行工艺，所不同的是大孔树脂分离时依次用水、35％乙醇、75％乙醇进行洗脱，吸附提取液的流速为1.0个保留体积/小时，解吸时的流速为2.5个保留体积/小时。上硅胶柱时用丙酮进行洗脱。最后得纯度99.5％的绿原酸精品0.07kg，总收率为1.40％；得到总黄酮含量为58％的干粉0.35kg，收率为4.06％。

实施例6将杜仲叶粗粉5.0kg按实施例4的方法进行工艺，所不同的是杜仲叶粗粉用50％，pH＝5乙醇溶液50L在60℃下进行搅拌分三次提取，每次1小时，提取液浓缩后静置0.5小时离心。大孔树脂分离时依次用水、20％乙醇、65％乙醇进行洗脱，用适量丙酮溶解绿原酸粗品后加入相当于绿原酸粗品干重1.0倍量硅胶拌样上硅胶柱，分离所用硅胶质量是绿原酸粗品干重的15倍，以甲醇为洗脱剂进行洗脱。最后得纯度98.5％的绿原酸精品0.069kg，总收率为1.38％；得到总黄酮含量为66％的干粉0.32kg，收率为4.22％。

实施例7将杜仲叶粗粉5.0kg按实施例4的方法进行工艺，所不同的是用适量乙醇溶解绿原酸粗品后加入相当于绿原酸粗品干重1.0倍量硅胶拌样上硅胶柱，分离所用硅胶质量是绿原酸粗品干重的10倍，以乙醇为洗脱剂进行洗脱。最后得纯度98.2％的绿原酸精品0.071kg，收率为1.39％；得到总黄酮含量为65％的干粉0.35kg，收率为4.55％。

Claims (6)

1.一种从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，包括将杜仲叶用乙醇溶液提取；提取物经大孔树脂柱分离得绿原酸粗品和杜仲叶总黄酮；分离所得的绿原酸粗品经精制得高纯度绿原酸三个步骤，其特征在于：提取是将杜仲叶粉碎成粗粉，用pH值为3～6的45％～55％乙醇溶液在60～70℃搅拌提取2～3次，每次提取时间0.5～2小时，合并提取液浓缩至原体积的1/8～1/15后离心，取上清液为杜仲叶的提取液；分离是取提取液上中极性的JD-1型大孔树脂柱进行饱和吸附，依次用水、20％～45％的乙醇溶液、60％～75％的乙醇溶液进行洗脱，弃去水洗脱液，收集20％～45％的乙醇溶液洗脱液浓缩成稠膏得绿原酸粗品，收集60％～75％的乙醇溶液的洗脱液浓缩成稠膏、干燥即得到杜仲叶总黄酮重量含量为40％～80％的干粉；精制是取绿原酸粗品用C₁-C₃脂肪醇或丙酮使刚溶解后加入硅胶或硅藻土拌样上硅胶柱，用乙酸乙酯或丙酮或甲醇或乙醇为洗脱剂进行洗脱，分段收集流分，以高效液相色谱法进行监测，含量高于90％的流分，减压浓缩，浓缩物用丙酮或水重结晶，结晶产物为纯度96％～99％的绿原酸精品；高效液相色谱法进行监测，含量低于90％的流分按绿原酸粗品的处理方法重新上硅胶柱进行分离。

2.如权利要求1所述的从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，其特征是所说的提取过程是采用pH值为4的45％乙醇溶液提取，合并提取液浓缩至原体积的1/10后离心，取上清液为杜仲叶的提取液。

3.如权利要求1所述的从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，其特征是所说的分离过程是上大孔树脂柱时，吸附提取液的流速为0.5～3个保留体积/小时，洗脱时的流速为2～5个保留体积/小时。

4.如权利要求3所述的从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，其特征是所说的分离过程中上大孔树脂柱时，吸附提取液的流速为0.5个保留体积/小时，洗脱时的流速为2个保留体积/小时。

5.如权利要求1所述的从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，其特征在于所说的精制过程是取绿原酸粗品用甲醇溶解后加硅胶拌样上硅胶柱进行洗脱，所用硅胶的量，以绿原酸粗品干品质量计与硅胶质量之比为1∶8～1∶20。

6.如权利要求5所述的从杜仲叶制备高纯度绿原酸和总黄酮的方法，其特征在于所说的精制时所用硅胶的量，以绿原酸粗品干品质量计与硅胶质量之比为1∶10。