CN109180485B - 一种分离绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离绿原酸的方法，步骤如下：（1）制备填料：将氧化锌、氧化钙、中性氧化铝、轻质二氧化硅混合后搅拌均匀，在580～620℃活化，制得A组分；将A组分、葡聚糖凝胶和分散剂按重量比1：（2～3.5）：（40～70）混合，在40～55℃搅拌5～8h，静置，过滤除上清，干燥，制得填料B；（2）制备分离柱：将填料B和硅藻土依次进行装柱，用混合溶剂淋洗至柱子达到平衡，制得分离柱；（3）绿原酸分离：将待分离的绿原酸提取液上样于步骤（2）制备的分离柱，然后以混合溶剂为流动相进行洗脱。本发明的分离方法操作简单，分离时间短，得到的绿原酸纯度高。

Description

一种分离绿原酸的方法

技术领域

本发明属于天然产物分离提取技术领域，具体涉及一种分离绿原酸的方法。

背景技术

绿原酸是一种缩酚酸，属酚类化合物，具有广泛的药理活性，如抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等，目前已作为重要原料广泛用于保健品，药品、化妆品等工业。绿原酸多从植物中提取获得，目前国内外主要从生咖啡豆和金银花中提取绿原酸。杜仲叶中绿原酸含量为1％～5.5％，该含量在植物叶子中属于较高者，因此从杜仲叶中分离提取绿原酸具有广阔的开发前景。

目前已报道从天然植物中提取分离绿原酸的主要方法有溶剂提取法、物理场辅助提取法(超声场、微波场等)、醇沉法、乙酸乙酯萃取法、大孔树脂吸附分离法、超临界法、超滤法等。例如，专利CN1400199A公开了一种从杜仲叶中连续提取活性物质的方法，该法以水、甲醇或乙醇为提取剂，通过大孔树脂分离、乙酸乙酯萃取和混合溶剂重结晶等工序提取绿原酸和杜仲总黄酮。该方法使用的是非极性树脂，对绿原酸的吸附率不高；采取的乙酸乙酯萃取、乙酸乙酯-氯仿重结晶，操作麻烦、溶剂复杂、母液回收设备要求高。专利CN1687435A公开了一种高纯度绿原酸工业化生产工艺，主要步骤为原料经石油醚预处理、生物复合酶提取、提取液调酸、乙酸乙酯萃取、碱中和萃取液后水相酸沉、沉淀重结晶。专利CN1273964A公开了一种杜仲叶制备绿原酸工艺，主要步骤如下：超声预处理、高温提取、超滤、乙酸乙酯萃取、D-140树脂分离等。现有的从杜仲叶中分离提取绿原酸的方法，存在操作复杂繁琐、周期长、所用溶剂复杂、组分的回收率不高等缺陷。因此，随着市场上对绿原酸的需求不断上涨，如何从杜仲叶中有效分离得到高纯度、高回收率的绿原酸已成为亟待解决的问题。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。利用葡聚糖凝胶层析分离混合物，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

研究表明，杜仲叶与皮所含的化学成分基本一致，包括绿原酸、黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、氨基酸、多糖化合物以及多种微量元素等。利用水醇溶剂提取杜仲叶得到的提取物，其主要成分有绿原酸、黄酮类、木脂素和其他还有少量的无机盐以及小分子氨基酸等；提取物中大多数黄酮类化合物分子量比绿原酸小，少部分与绿原酸接近；大多数木脂素化合物分子量比绿原酸大，少部分与绿原酸接近。如果直接采用葡聚糖凝胶作为填料对杜仲叶提取物进行柱层析分离，不易将分子量与绿原酸接近的物质分离除去，而且层析后得到的绿原酸产品纯度低，收率低，无法实现绿原酸的有效分离纯化。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种分离绿原酸的方法。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种分离绿原酸的方法，包括以下步骤：

(1)制备填料：

a)、将6wt％～12wt％氧化锌、3wt％～8wt％氧化钙、30wt％～38wt％中性氧化铝、42wt％～61wt％轻质二氧化硅混合后搅拌均匀，得到混合料，将混合料在580～620℃焙烧活化10～15h，制得A组分；

b)、将A组分、葡聚糖凝胶和分散剂按重量比1：(2～3.5)：(40～70)混合，在40～55℃搅拌5～8h，冷却至室温后静置24～48h，过滤除上清，然后在60～78℃干燥，制得填料B；

(2)制备分离柱：将填料B和硅藻土依次进行装柱，装柱后进行压实，然后用混合溶剂淋洗至柱子达到平衡(外观上无明显气泡夹杂)，制得分离柱，其中，所述分离柱的固定相分为上、下两段，上段的填料为硅藻土，下段的填料为填料B，上段和下段的长度比为1：(3～5)；

(3)绿原酸分离：将待分离的绿原酸提取液上样于步骤(2)制备的分离柱，然后以混合溶剂为流动相进行洗脱；

其中，所述混合溶剂为水、乙醇、丙酮三者的混合溶液。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(1)中，所述氧化锌的粒度为60～150目，所述氧化钙的粒度为80～100目，所述中性氧化铝的粒度为200～400目，所述轻质二氧化硅的粒度为300～500目。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(1)中，所述葡聚糖凝胶为G-10或G-15，。更加优选地，所述葡聚糖凝胶为G-10。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(1)中，所述分散剂是体积分数为10％～20％的乙醇水溶液。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(2)中，所述硅藻土的粒度为500～800目。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(2)中，所述分离柱固定相上段和下段的长度比为1：3。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(2)中，所述分离柱固定相的总长度为60～150cm。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(2)中，所述分离柱的径高比为1：(5～8)；更加优选为1：8。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，所述混合溶剂中水、乙醇、丙酮的体积比为(3～6)：(2～4.5)：1。更加优选地，所述混合溶剂中水、乙醇、丙酮的体积比为5.2：3.6：1。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(3)中，所述流动相的洗脱压力为150～300kPa，洗脱流速为15～25ml/min。

根据上述分离绿原酸的方法，优选地，步骤(3)中，所述绿原酸提取液为杜仲叶用体积分数为40％～70％的乙醇水溶液进行提取得到的提取液。更加优选地，所述绿原酸提取液的制备方法为：将干燥的杜仲叶粉成细末，按料液比1：(15～30)向杜仲叶粉末中加入乙醇体积分数为40％～70％的乙醇水溶液混合均匀，于30～55℃、pH3.5～4.5的条件下超声处理15～30min，超声功率为200～350W；超声处理完毕后过滤，对滤液进行浓缩、干燥，得到绿原酸粗品；然后将绿原酸粗品用乙醇溶解，制得绿原酸提取液。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：

(1)本发明先将氧化锌、氧化钙、中性氧化铝和轻质二氧化硅按比例混合配制成混合料，由于中性氧化铝和轻质二氧化硅均为多孔、高分散度的结构，比表面积大，易吸附氧化锌、氧化钙，经580～620℃高温活化处理后，混合料中性氧化铝和轻质二氧化硅微孔表面的吸附性能、表面活性和热稳定性得到了大幅度的提高，更有利于中性氧化铝和轻质二氧化硅与氧化锌、氧化钙稳定结合，经活化后制备得到的A组分吸附活性高、稳定性强。而且，氧化锌、氧化钙、中性氧化铝和轻质二氧化硅对羟基有亲和性，而葡聚糖凝胶又含有较多的羟基，经过活化处理后，A组分结构上对葡聚糖羟基的结合更好。因此，经过活化处理，能够提高A组分与葡聚糖凝胶的吸附力，使得A组分与葡聚糖结合更牢固，有利于提高制得的填料B的结构稳定性，从而进一步提高绿原酸的分离效率。

(2)本发明利用葡聚糖凝胶具有立体网状结构、含有大量的羟基且在分散剂中会发生溶胀的特点，将葡聚糖凝胶、A组分和分散剂(乙醇水溶液)在40～55℃搅拌5～8h，然后进行室温静置，使葡聚糖凝胶充分溶胀，溶胀后的葡聚糖凝胶孔径变大，能够吸附A组分，通过搅拌能促使葡聚糖凝胶吸附更多的A组分，而且A组分能够进入葡聚糖凝胶的内部，填充在葡聚糖凝胶的立体网状结构中，由于A组分的填充，使得葡聚糖凝胶的孔径减小，比表面积增大；此外，溶胀吸附后进行干燥处理，可以使溶胀过大的葡聚糖凝胶颗粒体积减小，使得A与葡聚糖凝胶结合更趋向与均相化。因此，本发明制备的填料B具有孔径小、比表面积大的特点。将填料B和硅藻土依次装柱，制成上段为硅藻土、下段为填料B的分离柱对杜仲叶提取物进行分离，硅藻土相当于一个预分离过程，能够吸附除去杜仲叶提取物中的无机物或者盐类等大部分杂质，经过硅藻土的预分离再采用本发明制备的填料进行分离，能够去除杜仲提取物中的大部分杂质，大大提高了绿原酸的分离效果，分离得到的绿原酸纯度高；解决了直接利用葡聚糖凝胶作为填料分离杜仲叶提取物存在的分离效率低、绿原酸纯度低的难题。

(3)本发明通过控制分离柱固定相上段和下段的长度比例以及固定相的总长度，能够实现对杜仲叶提取物中绿原酸的有效分离，分离后得到的绿原酸产品纯度高，回收率高，而且分离纯化过程操作简单，因此，可以大规模推广应用。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。

实施例1：制备填料B

填料B的制备方法具体包括以下步骤：

a)、将6wt％～12wt％氧化锌、3wt％～8wt％氧化钙、30wt％～38wt％中性氧化铝、42wt％～61wt％轻质二氧化硅混合后搅拌均匀，得到混合料，将混合料在580～620℃活化10～15h，制得A组分；其中，所述氧化锌的粒度为60～150目，所述氧化钙的粒度为80～100目，所述中性氧化铝的粒度为200～400目，所述轻质二氧化硅的粒度为300～500目；

b)、将A组分、葡聚糖凝胶和分散剂按重量比1：(2～3.5)：(40～70)混合，在40～55℃搅拌5～8h，冷却至室温后静置24～48h，过滤除上清，然后在60～78℃干燥，制得填料B；其中，所述葡聚糖凝胶为G-10或G-15，所述分散剂是体积分数为10％～20％的乙醇水溶液。

在制备填料B的方法中，各参数的具体设置情况参见表1中各个具体的实施例。

表1制备用于分离绿原酸的分离柱填料的具体实施例

实施例2：制备分离柱

取相同规格(柱子内径为3.5cm)的分离柱，采用干法装柱的方式将实施例1制备的填料B和粒度为500～800目硅藻土依次进行装柱，用真空泵进行抽气压实，然后用混合溶剂淋洗至柱子达到平衡，制得分离柱；所述分离柱的径高比为1：(5～8)，分离柱的固定相分为上、下两段，上段为硅藻土，下段为填料B，上段和下段的长度比为1：(3～5)；所述混合溶剂为水、乙醇、丙酮按体积比5.2：3.6：1混合得到的混合溶剂。

在制备分离柱的方法中，各参数的具体设置情况参见表2中各个具体的实施例。

表2制备分离柱的具体实施例

实施例3：制备绿原酸提取液

绿原酸提取液的制备方法包括以下步骤：

(1)将新鲜的杜仲叶晾干，将干燥后的杜仲叶研磨成粒度为50目的杜仲叶粉末；

(2)将杜仲叶粉末与乙醇体积分数为40％～70％的乙醇水溶液按料液比1：(15～30)混合均匀，在温度为30～55℃、pH3.5～4.5的条件下超声提取15～30min，超声功率为200～350W，超声处理完毕后过滤，对滤液进行浓缩、干燥，得到绿原酸粗品；然后将绿原酸粗品用无水乙醇溶解(1g绿原酸粗品用10ml无水乙醇溶解)，制得绿原酸提取液。

在绿原酸提取液的制备方法中，各参数的具体设置情况参见表3中各个具体的实施例。

表3制备绿原酸提取液的具体实施例

实施例4：绿原酸的分离纯化

一种分离绿原酸的方法，具体步骤如下：

将实施例3-1制备的绿原酸提取液上样于实施例2-1制备的分离柱上，上样量为12ml，以水、乙醇、丙酮按体积比(3～6)：(2～4.5)：1的比例混合制成的混合溶剂为流动相进行洗脱，洗脱压力为150～300kPa，洗脱流速控制在15～25ml/min，收集洗脱液。采用薄层色谱分析方法检测洗脱液，同时对照绿原酸标准品，确定绿原酸组分的洗脱次序，将含有绿原酸的洗脱液合并后进行旋转蒸发干燥，得到绿原酸纯品。各参数的具体设置情况参见表4中各个具体的实施例。

表4绿原酸分离方法的各个具体实施例

具体实施例	水、乙醇、丙酮的体积比	洗脱压力	洗脱流速
				实施例4-1	5.2：3.6：1	210kPa	20ml/min
实施例4-2	3：4.5：1	150kPa	15ml/min
				实施例4-3	6:2:1	300kPa	25ml/min
实施例4-4	5:4:1	250kPa	20ml/min

实施例5：不同分离方法对绿原酸分离效果的对比实验

分别采用实施例2-1、实施例2-2、实施例2-3、实施例2-4、实施例2-5、实施例2-6、对比例2-7、对比例2-8、对比例2-9制备的分离柱按实施例4-1所述的分离绿原酸的方法对实施例3-1制备的绿原酸提取液进行分离，得到绿原酸纯品，然后采用高效液相色谱分析法对各个绿原酸纯品进行纯度检测，并计算绿原酸的回收率(回收率＝绿原酸纯品中绿原酸的质量/绿原酸粗品中绿原酸的质量*100％)，结果见表5。其中，高效液相色谱的检测条件为：C18色谱柱(200mm×4.6mm，10μm))，以甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱(甲醇：0～2min，22％；2～6min，22～60％；6～20min，60％；20～24min，60～22％；24～28min，22％)，流速0.8ml/min，柱温30℃；检测器波长327nm。

表5不同分离柱对绿原分离纯化效果对比

具体实施例	采用的分离柱	绿原酸纯品的纯度/％	绿原酸的回收率/％
				实施例5-1	实施例2-1	98.3	93.2
实施例5-2	实施例2-2	96.6	91.7
				实施例5-3	实施例2-3	95.0	82.3
实施例5-4	实施例2-4	94.1	77.9
				实施例5-5	实施例2-5	95.6	81.5
实施例5-6	实施例2-6	97.5	88.2
				对比例5-7	对比例2-7	71.1	65.2
对比例5-8	对比例2-8	85.2	76.8
				对比例5-9	对比例2-9	35.1	43.5

从实施例5-1、5-2、5-3、5-4对绿原酸的分离结果可以看出，随着分离柱径高比比值的减小，绿原酸的纯度和回收率都逐渐增大。这是因为柱子的直径不变时，柱子越长，组分在柱子上经历的路径更长，也就是说“组分在柱子上相对的分离时间更长”，而且，各组分之间洗脱距离会更远，容易将各组分充分分开，减少因组分少量重叠而对洗脱液进行“掐头去尾”操作造成的组分损失，对于组分的收集也更充分，分离出来组分的纯度更高，回收率也更高。而且实际研究过程中发现，当分离柱的径高比达到1:8后，分离柱直径不变，继续增大分离柱的高度时，绿原酸的纯度和回收率无明显变化，因此，为了避免物料浪费，本发明的绿原酸的分离方法采用的分离柱的径高比最优为1:8。

从实施例5-1、5-5、5-6对绿原酸的分离结果可以看出，当分离柱固定相下段填料B的长度不变时，随着分离柱固定相上段和下段的长度比比值的增大，绿原酸的纯度和回收率都逐渐增大，这是因为上段硅藻土的主要作用就是除去绿原酸粗品中的无机物，硅藻土填料的长度太短，无机物在经过硅藻土后不能完全除去，就会进入下端填料，影响下端填料的分离效果，因此需要适当增加上段硅藻土填料的长度。实际研究过程中也发现，当分离柱固定相上段硅藻土的长度和下段填料B的长度比达到1:3时，绿原酸的纯度和回收率达到最高；随后再继续增加上段硅藻土的长度，绿原酸的纯度和回收率无明显变化，因此，为了避免原料浪费，分离柱固定相上段硅藻土的长度和下段填料B的长度比选取1:3为最优。

实施例5-1和5-7采用分离柱的径高比、固定相上段和下段的长度比均相同，其区别点是实施例5-7制备填料B时采用的A组分没有经过焙烧活化处理。从实施例5-1和5-7对绿原酸的分离结果来看，实施例5-7制得的绿原酸纯品的纯度和回收率都远低于实施例5-1，这是因为A组分没有进行焙烧活化处理，A组分中中性氧化铝和轻质二氧化硅微孔表面的吸附性能和表面活性较低，不利于A组分与葡聚糖凝胶之间的吸附结合，导致A组分不能牢固吸附在葡聚糖凝胶上，制备得到的填料B稳定性差；在洗脱的过程中，A组分容易被洗脱液从葡聚糖的立体网状结构中洗出，致使绿原酸的分离效果较差。

从实施例5-1和对比例5-8(实施例5-1和对比例5-8的区别点是对比例5-8采用的分离柱填料只有填料B)对绿原酸的分离结果来看，只采用填料B作为分离柱的固定相对绿原酸提取液进行分离纯化时，制得的绿原酸纯品的纯度和回收率明显要低于实施例5-1。

从实施例5-1和对比例5-9对绿原酸的分离结果来看，仅采用硅藻土作为填料对绿原酸提取液进行分离纯化时，得到的绿原酸纯品的纯度非常低，绿原酸的回收率也很低，这是因为硅藻土只能除去绿原酸提取液中的无机物、盐类等杂质，对提取液中有机物成分不能进行有效分离，因此绿原酸的分离效果最差，得到的绿原酸纯品纯度最低。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种分离绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备填料：

a）、将6wt%～12wt%氧化锌、3wt%～8wt%氧化钙、30wt%～38wt%中性氧化铝、42wt%～61wt%轻质二氧化硅混匀，得到混合料，将混合料在580～620℃焙烧活化10～15h，制得A组分；所述氧化锌的粒度为60～150目，所述氧化钙的粒度为80～100目，所述中性氧化铝的粒度为200～400目，所述轻质二氧化硅的粒度为300～500目；

b）、将A组分、葡聚糖凝胶和分散剂按重量比1：（2～3.5）：（40～70）混合，在40～55℃搅拌5～8h，冷却至室温后静置24～48h，过滤除上清，然后在60～78℃干燥，制得填料B；所述葡聚糖凝胶为G-10或G-15；

（2）制备分离柱：

将填料B和硅藻土依次进行装柱，装柱后进行压实，然后用混合溶剂淋洗至柱子达到平衡，制得分离柱，其中，所述分离柱的固定相分为上、下两段，上段的填料为硅藻土，下段的填料为填料B，上段和下段的长度比为1：（3～5）；

（3）绿原酸分离：

将待分离的绿原酸提取液上样于步骤（2）制备的分离柱，然后以混合溶剂为流动相进行洗脱；所述绿原酸提取液为杜仲叶用体积分数为40%～70%的乙醇水溶液进行提取得到的提取液；

其中，所述混合溶剂为水、乙醇、丙酮三者的混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的分离绿原酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分散剂为体积分数为10%～20%的乙醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的分离绿原酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述硅藻土的粒度为500～800目。

4.根据权利要求1所述的分离绿原酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分离柱的径高比为1：（5～8）。

5.根据权利要求1所述的分离绿原酸的方法，其特征在于，所述混合溶剂中水、乙醇、丙酮的体积比为（3～6）：（2～4.5）：1。

6.根据权利要求1所述的分离绿原酸的方法，其特征在于，所述绿原酸提取液的制备方法为：将干燥的杜仲叶粉成细末，加入体积分数为40%～70%的乙醇水溶液混合均匀，于30～55℃、pH3.5～4.5的条件下超声处理15～30min，超声功率为200～350W；超声处理完毕后过滤，对滤液进行浓缩、干燥，得到绿原酸粗品；然后将绿原酸粗品用乙醇溶解，制得绿原酸提取液。