CN113577823A - 葡聚糖凝胶色谱柱及脐血间充质干细胞外泌体的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡聚糖凝胶色谱柱及脐血间充质干细胞外泌体的分离方法，所述葡聚糖凝胶色谱柱包括U型柱管、脱脂棉球和收集管；所述U型柱管内部设置有葡聚糖凝胶，并且底部设置有收集口，所述收集口上设置有开关；所述脱脂棉球设置于所述收集口内；所述收集管位于所述收集口的下方。本发明葡聚糖凝胶色谱柱够快速分离得到外泌体，仅仅通过自身重力实现体积超过300ml的外泌体分离，无需真空抽离，操作简单，效率高，此外，该葡聚糖凝胶可以重复使用，降低了分离制备成本。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外泌体分离制备技术领域，具体涉及一种葡聚糖凝胶色谱柱及脐血间充质干细胞外泌体的分离方法。
背景技术
目前脐血间充质干细胞外泌体的制备技术基本上都是利用超速离心，从细胞培养液中分离沉淀而获得，这个过程中导致许多分子量接近的杂质也随之沉淀，得到的是一种带有外泌体的混合物。这些方法得到的外泌体纯度都不是很高，运用上也会受到限制。而使用色谱柱凝胶过滤法进行过滤则可以获得更为纯净的外泌体，由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的凝胶柱对样品进行分子大小的选择性分离，便可获得外泌体。凝胶柱过滤法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。外泌体的粒径较蛋白质和脂类物质大，能够快速通过分离柱；而蛋白质和脂类物质与填料间的相互作用力较大，通过色谱柱的速度较慢，从而实现外泌体与杂质的高效分离，以得到纯度较高的外泌体。该技术操作简单、使用方便、富集效率高。然而，常规色谱柱对于上样量有严格的要求，一般在0.5mL以内，否则会降低外泌体的分离效率。此外，由于蛋白质和脂类的严重污染，该色谱柱无法多次重复使用(<3次)，限制了该产品的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡聚糖凝胶色谱柱及脐血间充质干细胞外泌体的分离方法，该葡聚糖凝胶色谱柱能够快速分离得到外泌体，效率高，而且该葡聚糖凝胶可以重复使用，降低了分离制备成本。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种葡聚糖凝胶色谱柱，所述葡聚糖凝胶色谱柱包括U型柱管、脱脂棉球和收集管；
所述U型柱管内部设置有葡聚糖凝胶，并且底部设置有收集口，所述收集口上设置有开关；
所述脱脂棉球设置于所述收集口内；
所述收集管位于所述收集口的下方。
优选地，所述葡聚糖凝胶色谱柱还包括固定支架、环套、连杆和固定螺丝；
所述环套设置在所述U型柱管外壁上；
所述连杆一端与所述环套连接，另一端通过所述固定螺丝固定在所述固定支架上。
优选地，所述葡聚糖凝胶占所述U型柱管体积的0.15～0.3倍，所述U型柱管的体积为800～1200ml。
本发明第二方面提供一种采用上述葡聚糖凝胶色谱柱分离脐血间充质干细胞外泌体的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将葡聚糖凝胶进行溶胀，再置于所述U型柱管中；
(b)在所述U型柱管中添加灭菌去离子水进行搅拌，然后，打开所述收集口开关进行排液，重复2～4次；
(c)将脐血干细胞培养液进行高速离心，收集上清液；
(d)将所述上清液缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡后，打开所述收集口开关，采用所述收集管收集排出液，待液面降至距葡聚糖凝胶表面0～0.5cm时，关掉所述收集口开关，将生理盐水缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡，再打开所述收集口开关，继续收集排出液，其中，排出液按照每管5～7ml进行收集；
(e)采用全波长紫外分光光度仪对每管排出液进行测定，并进行高倍显微镜观察，根据测定和观察结果确定含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管；
(f)按照收集时间将含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的第一管和最后一管进行去除，再将中间的收集管进行合并，即得脐血间充质干细胞外泌体。
优选地，所述步骤(c)中，高速离心的离心力rcf不低于12000g。
优选地，所述步骤(d)中，上清液的添加体积为所述葡聚糖凝胶体积的0.3～0.5倍。
优选地，所述步骤(e)中还包括标记含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的收集时间和顺序，作为后续处理的参照。
优选地，所述步骤(a)中，溶胀包括：
将葡聚糖凝胶置于去离子水中加热煮沸3～5h。
优选地，所述方法还包括：
葡聚糖凝胶使用3～4次后，将葡聚糖凝胶置于去离子水进行高温煮沸4～5h，然后，再继续装柱使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明葡聚糖凝胶色谱柱够快速分离得到外泌体，仅仅通过自身重力实现体积超过300ml的外泌体分离，无需真空抽离，操作简单，效率高，此外，该葡聚糖凝胶可以重复使用，降低了分离制备成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例提供的葡聚糖凝胶色谱柱的结构示意图；
附图中，
1-U型柱管；2-脱脂棉球；3-收集管；4-葡聚糖凝胶；5-收集口；6-开关；7-固定支架；8-环套；9-连杆；10-固定螺丝。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种葡聚糖凝胶色谱柱，如图1所示，该葡聚糖凝胶色谱柱包括U型柱管1、脱脂棉球2、收集管3、固定支架7、环套8、连杆9和固定螺丝10；
U型柱管1内部设置有葡聚糖凝胶4，并且底部设置有收集口5，收集口5上设置有开关6；
脱脂棉球2设置于收集口5内；
收集管3位于收集口5的下方；
环套8设置在U型柱管1外壁上；
连杆9一端与环套8连接，另一端通过固定螺丝10固定在固定支架7上。
本发明葡聚糖凝胶色谱柱够快速分离得到外泌体，仅仅通过自身重力实现体积超过300ml的外泌体分离，无需真空抽离，操作简单，效率高，此外，该葡聚糖凝胶可以重复使用，降低了分离制备成本。
在本发明中，对U型柱管1中葡聚糖凝胶4的添加量不作严格限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行添加；例如，在一实施方式中，葡聚糖凝胶4的添加量占U型柱管1体积倍数为0.15～0.3中的任一数值；具体可以为0.15、0.2或0.3。
实施例2
本实施例为一种采用实施例1中葡聚糖凝胶色谱柱分离脐血间充质干细胞外泌体的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将葡聚糖凝胶置于去离子水中加热煮沸5h，再置于U型柱管中；
(b)在U型柱管中添加灭菌去离子水进行搅拌，然后，打开收集口开关进行排液，重复上述操作2次；
(c)将脐血干细胞培养液进行高速离心，收集上清液，其中，高速离心的离心力rcf为12000g；能够有效去除液体中颗粒性物质以及死细胞，减少杂质污染；
(d)将所述上清液缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡后，打开所述收集口开关，采用所述收集管收集排出液，待液面降至距葡聚糖凝胶表面0.2cm时，关掉所述收集口开关，将生理盐水缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡，再打开所述收集口开关，继续收集排出液，其中，上清液的添加体积为所述葡聚糖凝胶体积的0.5倍，排出液按照每管7ml进行收集；
(e)采用全波长紫外分光光度仪对每管排出液进行测定，并进行高倍显微镜观察，根据测定和观察结果确定含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管，并标记收集管的收集时间和顺序，作为后续处理的参照；
(f)按照收集时间将含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的第一管和最后一管进行去除，再将中间的收集管进行合并，即得脐血间充质干细胞外泌体。
实施例3
本实施例为一种采用实施例1中葡聚糖凝胶色谱柱分离脐血间充质干细胞外泌体的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将葡聚糖凝胶置于去离子水中加热煮沸3h，再置于U型柱管中；
(b)在U型柱管中添加灭菌去离子水进行搅拌，然后，打开收集口开关进行排液，重复上述操作4次；
(c)将脐血干细胞培养液进行高速离心，收集上清液，其中，高速离心的离心力rcf为12000g；能够有效去除液体中颗粒性物质以及死细胞，减少杂质污染；
(d)将所述上清液缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡后，打开所述收集口开关，采用所述收集管收集排出液，待液面降至距葡聚糖凝胶表面0.5cm时，关掉所述收集口开关，将生理盐水缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡，再打开所述收集口开关，继续收集排出液，其中，上清液的添加体积为所述葡聚糖凝胶体积的0.3倍，排出液按照每管5ml进行收集；
(e)采用全波长紫外分光光度仪对每管排出液进行测定，并进行高倍显微镜观察，根据测定和观察结果确定含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管，并标记收集管的收集时间和顺序，作为后续处理的参照；
(f)按照收集时间将含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的第一管和最后一管进行去除，再将中间的收集管进行合并，即得脐血间充质干细胞外泌体。
实施例4
本实施例为一种采用实施例1中葡聚糖凝胶色谱柱分离脐血间充质干细胞外泌体的方法，该方法包括如下步骤：
(a)将葡聚糖凝胶置于去离子水中加热煮沸4h，再置于U型柱管中；
(b)在U型柱管中添加灭菌去离子水进行搅拌，然后，打开收集口开关进行排液，重复上述操作3次；
(c)将脐血干细胞培养液进行高速离心，收集上清液，其中，高速离心的离心力rcf为12000g；能够有效去除液体中颗粒性物质以及死细胞，减少杂质污染；
(d)将所述上清液缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡后，打开所述收集口开关，采用所述收集管收集排出液，待液面降至距葡聚糖凝胶表面0.4cm时，关掉所述收集口开关，将生理盐水缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡，再打开所述收集口开关，继续收集排出液，其中，上清液的添加体积为所述葡聚糖凝胶体积的0.4倍，排出液按照每管6ml进行收集；
(e)采用全波长紫外分光光度仪对每管排出液进行测定，并进行高倍显微镜观察，根据测定和观察结果确定含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管，并标记收集管的收集时间和顺序，作为后续处理的参照；
(f)按照收集时间将含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的第一管和最后一管进行去除，再将中间的收集管进行合并，即得脐血间充质干细胞外泌体。
本发明上述分离方法得到脐血间充质干细胞外泌体具有更加有的纯度，且能够实现超过300ml的外泌体的分离，分离效率较高，而且操作简单，易于生产。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (9)
1.一种葡聚糖凝胶色谱柱，其特征在于，包括U型柱管、脱脂棉球和收集管；
所述U型柱管内部设置有葡聚糖凝胶，并且底部设置有收集口，所述收集口上设置有开关；
所述脱脂棉球设置于所述收集口内；
所述收集管位于所述收集口的下方。
2.根据权利要求1所述的葡聚糖凝胶色谱柱，其特征在于，所述葡聚糖凝胶色谱柱还包括固定支架、环套、连杆和固定螺丝；
所述环套设置在所述U型柱管外壁上；
所述连杆一端与所述环套连接，另一端通过所述固定螺丝固定在所述固定支架上。
3.根据权利要求1或2所述的葡聚糖凝胶色谱柱，其特征在于，所述葡聚糖凝胶占所述U型柱管体积的0.15～0.3倍，所述U型柱管的体积为800～1200ml。
4.一种采用权利要求1～3任一所述的葡聚糖凝胶色谱柱分离脐血间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将葡聚糖凝胶进行溶胀，再置于所述U型柱管中；
(b)在所述U型柱管中添加灭菌去离子水进行搅拌，然后，打开所述收集口开关进行排液，重复2～4次；
(c)将脐血干细胞培养液进行高速离心，收集上清液；
(d)将所述上清液缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡后，打开所述收集口开关，采用所述收集管收集排出液，待液面降至距葡聚糖凝胶表面0～0.5cm时，关掉所述收集口开关，将生理盐水缓慢加入至所述U型柱管中，待液面平衡，再打开所述收集口开关，继续收集排出液，其中，排出液按照每管5～7ml进行收集；
(e)采用全波长紫外分光光度仪对每管排出液进行测定，并进行高倍显微镜观察，根据测定和观察结果确定含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管；
(f)按照收集时间将含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的第一管和最后一管进行去除，再将中间的收集管进行合并，即得脐血间充质干细胞外泌体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，高速离心的离心力rcf不低于12000g。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中，上清液的添加体积为所述葡聚糖凝胶体积的0.3～0.5倍。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(e)中还包括标记含有脐血间充质干细胞外泌体的收集管的收集时间和顺序，作为后续处理的参照。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，溶胀包括：
将葡聚糖凝胶置于去离子水中加热煮沸3～5h。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
葡聚糖凝胶使用3～4次后，将葡聚糖凝胶置于去离子水进行高温煮沸4～5h，然后，再继续装柱使用。
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