CN114317402A - 一种山羊乳外泌体的提取及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山羊乳外泌体的提取及鉴定方法。提取方法包括：针对山羊乳进行多步骤离心得到外泌体粗产物；针对所述外泌体粗产物进行梯度碘克沙醇溶液超速离心法得到山羊外泌体；所述多步骤离心包括：依次采用8000～12000×g、80000～120000×g、2000～3000×g和80000～120000×g的离心力进行离心。本发明通过限定特定的山羊乳外泌体提取流程，可以从山羊乳中提取得到完整，高浓度的外泌体，平均粒径在80nm以上，浓度最高可达到1.25×1011颗粒/mL，这在山羊乳外泌体提取的领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山羊乳外泌体的提取及鉴定方法。
背景技术
外泌体(exosomes)产生于细胞中的多泡体，是活细胞分泌的直径约为30～150nm的膜性囊泡，密度为1.13～1.19g/ml，有典型的“杯盘”形态。外泌体几乎存在于所有的组织、细胞间隙、体液中，包括血液、唾液、尿液和乳汁，携带了参与细胞内信号转导的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；外泌体在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面发挥重要作用。目前已有研究表明乳源外泌体具有作为载体用于靶向载药的潜力，此外，乳源外泌体对于人类肠道微生物和健康调控方面的作用也有待于进一步探索。
目前，外泌体的分离提取方法主要有：差速离心、密度梯度离心、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法等。外泌体研究的文献中主流的分离提取方法目前还是超速离心的方法，可以准确地重复获取外泌体，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化。其他方法包括等电沉淀法、试剂盒法、免疫提取法等各存在优缺点，尤其是对于乳品而言，由于乳基质成分与结构(酪蛋白、乳清蛋白三级结构)的复杂性,导致乳源外泌体的分离纯化较其他体液更为困难，得到的外泌体浓度低于1010(颗粒/mL)，无法满足后续分析(如非编码RNA组成等)，因此需要开发简单、快速、高浓度的乳源外泌体分离方法。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种简单、快速、高浓度的山羊乳外泌体的提取及鉴定方法。
为实现上述目的，本发明提供一种高浓度山羊乳外泌体超速离心提取方法，包括以下步骤：
针对山羊乳进行多步骤离心得到外泌体粗产物；
针对所述外泌体粗产物进行梯度碘克沙醇溶液超速离心法得到山羊外泌体；
所述多步骤离心包括：
依次采用8000～12000×g、80000～120000×g、2000～3000×g和80000～120000×g的离心力进行离心。
进一步地，
所述针对山羊乳进行超速离心得到外泌体粗产物包括：
(1)将山羊乳速融后离心10min，得到上清液；这一步骤的目的在于去除细胞碎片；
(2)将步骤(1)的上清液在8000～12000×g的离心力下离心30～60min；这一步骤的目的在于沉降大脂肪颗粒；
(3)将步骤(2)的上清液在80000～120000×g的离心力下离心100～140min；这一步骤的目的在于沉降中小脂肪颗粒；
(4)将步骤(3)的沉淀重悬，使沉淀均匀的分散于溶液中，在2000×g的离心力下离心10min，得到上清液；
(5)将步骤(4)的上清液在2000～3000×g的离心力下离心20～40min；这一步骤的目的在于再次沉降杂质颗粒；
(6)将步骤(5)的上清液在80000～120000×g的离心力下离心100～140min，取沉淀。
进一步地，步骤(1)中，速融的温度为35～42℃；和/或，离心的条件包括：
离心力1500～2000×g、温度3～5℃、离心时间20～40min。
进一步地，步骤(1)～(5)的流程均在3～5℃的条件下进行。
进一步地，所述梯度碘克沙醇溶液超速离心法包括：
配置多种不同浓度的碘克沙醇溶液，依照浓度高至低依次将碘克沙醇溶液离心管中；
加入所述外泌体粗产物于最上层并进行超速离心，取出中间层的液体进行超速离心后取沉淀。
进一步地，所述多种不同浓度的碘克沙醇溶液至少包括4种以上不同浓度的碘克沙醇溶液，且不同浓度的碘克沙醇溶液之间，浓度差距不小于5％。
进一步地，所述中间层为所有层溶液中，中间1/3体积的溶液；例如当分层为12层时，取其中的6～9层进行后续流程。
进一步地，所述梯度碘克沙醇溶液超速离心法中超速离心的条件如下：
离心力为80000～120000×g、离心温度为3～5℃、离心时间为100～140min。
进一步地，所述山羊乳包括：
初产羊或经产羊的初乳、过渡乳或常乳中的一种或多种。
初乳为产下羊羔后24小时内的羊乳，过渡乳为24小时～7天内间的杨茹，常乳为7天后的羊乳。
第二方面，本发明提供一种高浓度山羊乳外泌体鉴定方法，包括：
混合外泌体和醋酸双氧铀，在干燥状态下，在20～30℃的条件下处理3～5min。
作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种羊乳外泌体的提取和鉴定方法，包括：
(1)将山羊乳在35～42℃下速融后，在离心力1500～2000×g、温度3～5℃以及离心时间20～40min的条件下离心，取上清液；
(2)将步骤(1)的上清液在8000～12000×g的离心力下离心30～60min；
(3)将步骤(2)的上清液在80000～120000×g的离心力下离心100～140min；
(4)将步骤(3)的沉淀重悬后离心；
(5)将步骤(4)的上清液在2000～3000×g的离心力下离心20～40min；
(6)将步骤(5)的上清液在80000～120000×g的离心力下离心100～140min，取沉淀即为外泌体粗产物；
(7)配置浓度为40％、20％、10％和5％的碘克沙醇溶液，依照浓度高至低依次将碘克沙醇溶液离心管中；
加入所述外泌体粗产物于最上层并在离心力为80000～120000×g、离心温度为3～5℃的条件下进行超速离心100～140min，取出6～9层的液体进行在离心力为80000～120000×g、离心温度为3～5℃的条件下进行超速离心100～140min后取沉淀即为外泌体。
(8)将步骤(7)得到的沉淀用PBS重悬后于铜网上沉淀1～2min，吸去浮液；后加入醋酸双氧铀于铜网上沉淀1～2min，吸去浮液。
(9)将步骤(8)的样品在20～30℃条件下干燥3～5min即可进行鉴定。
本发明具备如下有益效果：
本发明针对山羊乳外泌体的提取方法中的多项离心步骤进行改进得到一种山羊乳外泌体的提取及鉴定方法，该方法可以从山羊乳中提取得到完整，高浓度的外泌体，平均粒径在80nm以上，浓度最高可达到1.25×1011颗粒/mL。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的山羊乳外泌体电镜图。
图2为本发明实施例2提供的山羊乳外泌体电镜图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.初产山羊初乳外泌体的提取：
(1)选取体况良好，发情周期正常，无繁殖及传染性疾病的初产母山羊，产羔后30min内采集乳样30ml于冻存管中，放置于-80℃冰箱内。
(2)在37℃中速融样本，将样本移动至一个新的离心管内，于2000×g、4℃条件下离心30min。
(3)将步骤(2)的上清液移至新的离心管中，于10000×g，4℃条件下离心45min，取上清液。
(4)将步骤(3)的上清液移至新的离心管中，选择超速转子，于100000×g，4℃条件下离心120min，取沉淀。
(5)将步骤(4)的沉淀加入20mL 4℃预冷的1×PBS重悬，2000×g，4℃条件下离心30min，取上清液。
(6)将步骤(5)的上清液于2000×g，4℃条件下离心30min，取上清液。
(7)重复步骤(6)。
(8)选择超速转子，将步骤(7)的上清液于100000×g，4℃条件下离心120min，取沉淀。
(9)将步骤(7)的沉淀用1mL 4℃预冷的1×PBS重悬，得到的沉淀于4℃条件下暂存。
(10)配制40％、20％、10％和5％碘克沙醇，依照浓度高至低依次将不同浓度的碘克沙醇沿管壁加入到超离管中(各3.6mL)，最后将步骤(9)中的1mL重悬液加在最上层，于100000×g，4℃条件下离心120min，离心完后会分成12层，取出中间6～9层的液体，再次于100000×g，4℃条件下离心120min，取沉淀。
(11)将步骤(10)的沉淀用200μL 4℃预冷的1×PBS重悬，得到外泌体。
(12)将步骤(11)的外泌体样品吸取10μL滴加于铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，随后滴加10μL醋酸双氧铀于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。
(13)将步骤(12)的样品在20～30℃条件下干燥3～5分钟，随后使用电镜检测成像。
2.初产山羊初乳外泌体的鉴定：
初产山羊初乳外泌体形态结构如图1所示，可见外泌体形态完整、球形、大小均一；按照上述方法提取的外泌体粒径和浓度结果如表1所示：
表1初产山羊初乳外泌体平均粒径和浓度
该方法得到的初产山羊初乳外泌体粒径和浓度均符合各种试验的要求(粒径30～200nm、浓度＞1010颗粒/mL)。
实施例2
1.经产山羊初乳外泌体的提取：
(1)选取体况良好，发情周期正常，无繁殖及传染性疾病的经产母山羊，产羔后30min内采集乳样30ml于冻存管中，放置于–80℃冰箱内。
(2)本实施例的其他步骤同实施例1。
2.经产山羊初乳外泌体的鉴定：
经产山羊初乳外泌体形态结构如图2所示，可见外泌体形态完整、球形、大小均一；按照上述方法提取的外泌体粒径和浓度结果如表2所示：
表2经产山羊初乳外泌体平均粒径和浓度
该方法得到的经产山羊初乳外泌体粒径和浓度均符合各种试验的要求(粒径30～200nm、浓度＞1010颗粒/mL)。
试验例1
本试验例针对山羊外泌乳的提取方法进行多项步骤的对比，具体设置实验组和多个对照组，具体如下：
实验组：如实施例1所示的外泌体提取和鉴定方法；
对照组1：将其中的步骤(3)～(8)替换为如下步骤：
(3)将步骤(2)的上清液移至新的离心管中,在12000×g的离心力下离心60min，取上清液；
(4)将步骤(3)的上清液移至新的离心管中,在35000×g的离心力下离心60min，取上清液；
(5)将步骤(4)的上清液移至新的离心管中,在75000×g的离心力下离心180min，取上清液；
(6)将步骤(5)的上清液在100000×g的离心力下离心60min；
(7)将步骤(6)的沉淀用200μL 4℃预冷的1×PBS重悬；
(8)选择超速转子，将步骤(7)的重悬液在100000×g的离心力下离心60min,取沉淀。
对照组2：将其中的步骤(10)替换为如下步骤：
(10)配制40％、20％、10％和5％碘克沙醇，依照浓度高至低依次将不同浓度的碘克沙醇沿管壁加入到超离管中(各1.2mL)，最后将步骤(9)中的1mL重悬液加在最上层，于100000×g，4℃条件下离心120min，离心完后会分成12层，取出中间6～9层的液体，再次于100000×g，4℃条件下离心120min，取沉淀。
对照组3：只进行到第(11)步。
如上各组得到如下效果：
对照组1中的得到的山羊初乳外泌体粒径和浓度分别为63.01nm和8.51×107颗粒/mL；
对照组2中的得到的山羊初乳外泌体粒径和浓度分别为70.52nm和2.48×108颗粒/mL；
对照组3中的得到的山羊初乳外泌体粒径和浓度分别为75.58nm和2.83×108颗粒/mL；
经过如上实验组和对照组的对比，可以说明本发明提供的山羊外泌体的提取和鉴定方法可以从山羊乳中提取得到完整，高浓度的外泌体。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种山羊乳外泌体的提取方法，其特征在于，包括：
针对山羊乳进行多步骤离心得到外泌体粗产物；
针对所述外泌体粗产物进行梯度碘克沙醇溶液超速离心法得到山羊外泌体；
所述多步骤离心包括：
依次采用8000～12000×g、80000～120000×g、2000～3000×g和80000～120000×g的离心力进行离心。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述针对山羊乳进行超速离心得到外泌体粗产物包括：
(1)将山羊乳速融后离心取上清液；
(2)将步骤(1)的上清液在8000～12000×g的离心力下离心30～60min；
(3)将步骤(2)的上清液在80000～120000×g的离心力下离心100～140min；
(4)将步骤(3)的沉淀重悬后离心；
(5)将步骤(4)的上清液在2000～3000×g的离心力下离心20～40min；
(6)将步骤(5)的上清液在80000～120000×g的离心力下离心100～140min，取沉淀。
3.根据权利要2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，速融的温度为35～42℃；和/或，离心的条件包括：
离心力1500～2000×g、温度3～5℃、离心时间20～40min。
4.根据1-3任一项所述的提取方法，其特征在于，所述梯度碘克沙醇溶液超速离心法包括：
配置多种不同浓度的碘克沙醇溶液，依照浓度高至低依次将碘克沙醇溶液离心管中；
加入所述外泌体粗产物于最上层并进行超速离心，取出中间层的液体进行超速离心后取沉淀。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述多种不同浓度的碘克沙醇溶液至少包括4种以上不同浓度的碘克沙醇溶液，且不同浓度的碘克沙醇溶液之间，浓度差距不小于5％。
6.根据权利要求4或5所述的提取方法，其特征在于，所述梯度碘克沙醇溶液超速离心法中超速离心的条件如下：
离心力为80000～120000×g、离心温度为3～5℃、离心时间为100～140min。
7.根据权利要求1-6任一项所述的提取方法，其特征在于，所述山羊乳包括：
初产羊或经产羊的初乳、过渡乳或常乳中的一种或多种。
8.一种外泌体鉴定方法，其特征在于，包括：
混合外泌体和醋酸双氧铀，在干燥状态下，在20～30℃的条件下处理3～5min。
9.根据权利要求8所述的外泌体鉴定方法，其特征在于，所述外泌体为山羊乳外泌体。
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