CN112048471A - 一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下制备步骤：S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中12小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养24小时；S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后。本发明提供的提取外泌体的方法，大大地提高了外泌体的产量，在提高产量的同时，通过两次重悬处理后，得到的骨髓间充质干细胞外泌体纯度和产量都很高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法。
背景技术
肝癌是一种常见的恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类，原发性肝癌起源于肝脏上皮或间叶组织；继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。无论是新生病例的产生还是死亡人数，发展中国家罹患肝癌的人数都要远远多于发达国家，且在全球范围内男性的发病人数和死亡人数均多于女性。
同时研究证实，乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是导致肝癌发生的主要病原体，HBV感染引起的肝癌占所有肝癌病例的80％左右。虽然医学技术在不断进步，然而我国肝癌的早期诊断率仅为20％左右，肝癌患者治疗后5年生存率不足10％。
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的30-150nm的小囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体内陷形成的多囊泡体，并经多囊泡体与细胞膜融合分泌到细胞外基质中[22]。大量研究表明，外泌体是细胞间通讯的重要调节因子，在机体免疫应答、抗原呈递、细胞迁移、分化以及肿瘤侵袭等方面均具有重要调控作用。外泌体来源丰富，易于改造，携带的物质容易被细胞摄取，可以避免细胞移植出现的免疫排斥反应，而且易于进行多次注射，它逐渐成为一种非常有前景的治疗手段。
目前，外泌体提取方法主要有超高速离心法，所获得的外泌体纯度高，但是提取效率过低，而且分离时间长，对设备要求较高；免疫磁珠法，能够特异性的捕获具有蛋白标签的外泌体，由于需要大量抗体、磁珠等，导致成本高昂且提取效率仅仅高于超高速离心法；试剂盒沉淀法，如Thermofisher公司以及SBI公司的相关的血清外泌体提取试剂，该方法外泌体的提取效率相比另外两种方法最高，但外泌体的纯度相对低，在捕获外泌体的同时，体液中高丰度的蛋白也会随之沉淀。由于外泌体研究要求提取方法快速和简单，试剂盒法分离外泌体的需求在市场上逐渐增长，外泌体的质量直接影响到后续外泌体核酸、蛋白的捕获与检测，特别是纯度、杂质和回收率都会对外泌体核酸、蛋白研究造成影响。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下制备步骤：
S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中12小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养24小时；
S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；
S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述溶液置于1-9°C条件下反应35-85min；
S4：将S3中的溶液离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，中得预重悬液；
S5：将S4中的预重悬液，加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述预重悬液置于0-5°C条件下反应30-65min；
S6：然后将S5中的预重悬液再一次去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，得重悬液，即为纯化后的外泌体。
优选的，所述离心的条件如下：5500g，离心10分钟。
优选的，所述重悬试剂为磷酸缓冲液。
优选的，所述乙二醇聚氧乙烯醚的浓度为18w/v％，葡聚糖的浓度为24mg/mL。
优选的，所述葡聚糖中加入有氯化钠。
优选的,所述S1中的培养环境为温度为36-37°C、氧体积浓度0.5％，CO体积浓度5％的混合气体。
优选的，所述S1中使用无血清的条件培养基为加入丙酮酸钠110mg/L和谷氨酰胺10-30mM的低糖DMEM培养基。
优选的，所述S1中加入的促产量试剂为VCAM1试剂。
本发明的有益效果为：本发明提供的提取外泌体的方法，去除外泌体溶液中大颗粒杂质，而且加入了促产量试剂VCAM1试剂，大大地提高了外泌体的产量，在提高产量的同时，通过两次重悬处理后，得到的骨髓间充质干细胞外泌体纯度和产量都很高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中12小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养24小时；
S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；
S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述溶液置于1°C条件下反应35min；
S4：将S3中的溶液离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，中得预重悬液；
S5：将S4中的预重悬液，加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述预重悬液置于0°C条件下反应30min；
S6：然后将S5中的预重悬液再一次去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，得重悬液，即为纯化后的外泌体。
实施例2：
S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中15小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养30小时；
S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；
S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述溶液置于5°C条件下反应55min；
S4：将S3中的溶液离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，中得预重悬液；
S5：将S4中的预重悬液，加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述预重悬液置于3°C条件下反应45min；
S6：然后将S5中的预重悬液再一次去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，得重悬液，即为纯化后的外泌体。
实施例3：
S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中18小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养36小时；
S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；
S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述溶液置于9°C条件下反应85min；
S4：将S3中的溶液离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，中得预重悬液；
S5：将S4中的预重悬液，加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述预重悬液置于5°C条件下反应65min；
S6：然后将S5中的预重悬液再一次去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，得重悬液，即为纯化后的外泌体。
试验例：选取骨髓间充质干细胞分成四份进行试验，QIAGEN公司的exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit、实施例1、实施例2和实施例3的方法，并结合QIAGEN公司的miRNeasyMicroKit对血浆外泌体的核酸进行提取，并通过Agilent2100生物分析仪检测上述三种方法得到的外泌体核酸的含量与分布，下表为试验后统计结果：
检测外泌体特异性蛋白CD63：
取外泌体样本，使用westernblot方法检测其特异蛋白CD63。首先用RIPA裂解液(150mMNaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0 .1％十二烷基磺酸钠，50mMTris-HCl(pH7.4)，50mM磷酸甘油酸，20mMNaF，20mMEGTA，1mM二硫苏糖醇，1mMNa3VO4，1mM苯甲基磺酰氟)提取总蛋白，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭后，分别加入稀释的一抗1∶1000(抗CD63单克隆抗体)(AbcamCo.)，4°C，4小时，辣根过氧化酶标记的二抗(羊抗鼠IgG多克隆抗体)1∶5000(AbcamCo.)室温孵育1小时，漂洗后ECL检测，曝光、显影。结果显示，收集得到的外泌体可以检出特异蛋白CD63，说明本实施例采用的聚乙二醇分步离心法可以分离纯化得到大鼠胎盘间充质干细胞的外泌体。
外泌体的产量：用BCA试剂盒对外泌体蛋白进行定量，并用酶标仪检测外泌体总蛋白浓度。将定量后的总蛋白加入loadingbuffer并煮沸变性，加入10μg蛋白进行免疫印迹实验。
| 实施例 | D63 | 得到外泌体的产量 | 得到外泌体的纯度 |
| QIAGEN试剂盒法 | 85000 | 30mg | 85％ |
| 实施例1 | 123000 | 30mg | 95％ |
| 实施例2 | 150000 | 30mg | 99％ |
| 实施例3 | 111000 | 15mg | 93％ |
可以得知：本发明大大地提高了外泌体的产量，在提高产量的同时，通过两次重悬处理后，得到的骨髓间充质干细胞外泌体纯度和产量都很高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
S1：使用无血清的条件培养基，将培养骨髓间充质干细胞放入到培养基中12-18小时，然后在培养基中加入5ug促产量试剂，然后继续培养24-36小时；
S2:离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，除去残留的细胞及细胞碎片后，制得含有外泌体的上清液；
S3：将S2中的待提取外泌体的溶液，在加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述溶液置于1-9°C条件下反应35-85min；
S4：将S3中的溶液离心去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，中得预重悬液；
S5：将S4中的预重悬液，加入乙二醇聚氧乙烯醚和葡聚糖后，将所述预重悬液置于0-5°C条件下反应30-65min；
S6：然后将S5中的预重悬液再一次去除细胞，收集上清液粗品后，再离心后，过滤，取沉淀，收集沉淀重悬于重悬试剂中，得重悬液，即为纯化后的外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述离心的条件如下：5500g，离心10分钟。
3.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述重悬试剂为磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述乙二醇聚氧乙烯醚的浓度为18w/v％，葡聚糖的浓度为24mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖中加入有氯化钠。
6.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中的培养环境为温度为36-37°C、氧体积浓度0.5％，CO体积浓度5％的混合气体。
7.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中使用无血清的条件培养基为加入丙酮酸钠110mg/L和谷氨酰胺10-30mM的低糖DMEM培养基。
8.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述S1中加入的促产量试剂为VCAM1试剂。
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