CN113846058B

CN113846058B - 一种骨髓间充质干细胞外泌体及其制备与应用

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Publication number: CN113846058B
Application number: CN202111454984.7A
Authority: CN
Inventors: 张杨; 周春晶
Original assignee: TIANJIN 4TH CENTRE HOSPITAL; Nuoxi Tianjin Biotechnology Co ltd
Current assignee: TIANJIN 4TH CENTRE Hospital
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-12-02
Also published as: CN113846058A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及其在制备缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖药物方面的应用。所述外泌体是以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培养液，并从培养液中收集获得。相比于现有技术，即骨髓间充质干细胞直接分泌的普通外泌体，本发明肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞后分泌的诱导外泌体，诱导外泌体表达抗伤害感受因子更强，使得相应蛋白表达增加，进而更加有效缓解由肿瘤引起的癌性疼痛，同时能够增强对癌细胞增殖的抑制作用。

Description

一种骨髓间充质干细胞外泌体及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及其在制备缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖药物方面的应用。

背景技术

癌性疼痛（Cancer pain）是疼痛部位需要修复或调节的信息传到神经中枢后引起的感觉，别名，癌痛，晚期癌痛，是造成癌晚期患者主要痛苦的原因之一。在疼痛患者中，因各种原因使50%～80%的疼痛没有得到有效控制。

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。

骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSC), 既往称为骨髓基质成纤维细胞，是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪、骨髓造血组织等。

外泌体（Exosome）是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。近年来，其应用已经涉及肿瘤治疗领域、医学基础和免疫领域、化妆品领域等。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种外泌体及外泌体疗法，作为一种新的治疗药剂，为当前难以治疗的癌性疼痛带来一些新的机会，提出了在缓解癌性疼痛和抑制癌细胞增殖方面的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一，是一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，所述外泌体是由肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞产生；

所述肿瘤细胞包括但不限于皮肤肿瘤细胞、软组织肿瘤细胞、转移性骨肿瘤的原发肿瘤细胞等；

进一步地，所述皮肤肿瘤细胞包括但不限于黑素瘤细胞、基底细胞癌细胞、鳞状细胞癌细胞；

进一步地，所述软组织肿瘤细胞包括但不限于纤维肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、淋巴管肉瘤细胞；

进一步地，所述转移性骨肿瘤的原发肿瘤细胞包括但不限于乳癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、直肠癌细胞、胰腺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞。

本发明提供的技术方案之二，是上述外泌体的制备方法，是以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培养液，进一步从培养液中收集外泌体；

进一步地，37℃、5% CO₂条件下，肿瘤细胞以其适宜培养基贴壁培养至密度约为80-90%时，去除细胞收集培养液；

进一步地，可根据肿瘤细胞选择适宜的培养基，如：DMEM培养基、DMEM/F12培养基、1640培养基等；

进一步地，骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度约为70-80%时，移除原有培养液并用PBS清洗细胞；

进一步地，以收集到的肿瘤细胞培养液继续培养上述经过清洗的骨髓间充质干细胞；12-48h后收集培养液，超速离心法收集外泌体沉淀；

进一步地，肿瘤细胞培养液的添加量视培养容器的规格采用本领域常用的添加量即可，如10cm左右培养皿添加10mL左右培养液，25cm左右培养皿添加25mL左右培养液等；

进一步地，超速离心法是将收集到的培养液以2000×g离心10min；离心后吸取上清液，10000×g高速离心30 min；再次吸取上清液，140000×g 超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体，用生理盐水洗涤沉淀并重悬后，140000×g再次离心90 min，适量生理盐水重悬沉淀，直接使用或冻存于-80°C备用；

优选地，37℃、5% CO₂条件下，骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度约为70-80%时，移除其原有培养液并清洗，以收集到的肿瘤细胞培养液于37℃、5% CO₂条件下继续培养48h；48h后收集培养液，离心获得外泌体沉淀，生理盐水将之重悬，得到外泌体溶液。

本发明提供的技术方案之三，是包含上述外泌体的药物；

所述的药物包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、粉末剂、软膏剂或喷雾剂等形式；

本发明提供的技术方案之四，是上述外泌体在制备缓解癌性疼痛药物中的应用；

本发明提供的技术方案之五，是上述外泌体在制备抑制癌细胞增殖药物中的应用；

进一步地，上述外泌体与所述癌性疼痛或癌细胞增殖为一一对应关系，即特定肿瘤细胞培养液培养骨髓间充质干细胞后收集的外泌体，能够抑制对应的癌细胞产生的疼痛或对应癌细胞的增殖，如黑色素瘤细胞培养液培养骨髓间充质干细胞后收集的外泌体，能够抑制黑色素瘤患者的疼痛或者黑色素瘤的增殖；

进一步地，所述外泌体为制备癌性疼痛药物或抑制癌细胞增殖药物的唯一活性成分。

有益效果：

骨髓间充质干细胞的迁移、定植、增殖与分化，需要从外界获取信息，其分化方向取决于所在的微环境。以肿瘤细胞培养液特定刺激，促使骨髓间充质干细胞发挥更加具体的功能，由此分泌的外泌体再次应对此刺激便可高效发挥功效。

相比于现有技术，即骨髓间充质干细胞直接分泌的普通外泌体，本发明肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞后分泌的为诱导外泌体，诱导外泌体表达抗伤害感受因子更强，使得相应蛋白表达增加，进而更加有效缓解由肿瘤引起的癌性疼痛，同时能够增强对癌细胞增殖的抑制作用。

附图说明

图1为表征以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体的冷冻透射电镜图；

图2为表征以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体的蛋白质印迹图；

图3为表征以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体的动态光散射粒径分析图；

图4为以黑色素瘤细胞刺激后不同时段产生的诱导外泌体与普通外泌体的BCA蛋白定量图；

图5为以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体对肿瘤细胞的增殖/毒性检测；

图6为黑色素瘤细胞外泌体对黑色素瘤细胞增殖的影响；

图7为以黑色素瘤细胞刺激产生的诱导外泌体与普通外泌体中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达（**标记，表示p值小于0.01，差异极显著）；

图8为黑色素瘤细胞、加入诱导外泌体与普通外泌体的黑色素瘤细胞，三组肿瘤细胞中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达（**标记，表示p值小于0.01，差异极显著）；

图9为诱导外泌体与普通外泌体对黑色素瘤模型小鼠机械痛阈值、热敏值的影响；

图10为诱导外泌体与普通外泌体对软组织肿瘤模型小鼠机械痛阈值、热敏值的影响；

图11为诱导外泌体与普通外泌体对骨癌痛模型小鼠负重量的影响；

图12为不同肿瘤细胞刺激骨髓间充质干细胞来源的外泌体对同一癌痛的缓解效果。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明适用于不同肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，并将其应用于所述肿瘤对应的癌性疼痛中，如皮肤癌疼痛、软组织癌疼痛、转移性骨肿瘤癌疼痛等。以下实施例以黑色素瘤B16细胞等为例，采用其培养液刺激骨髓间充质干细胞制备外泌体，并对由黑色素瘤引起的疼痛、癌细胞增殖等相关效果进行表征，其他种类的黑色素瘤细胞，如A875细胞、HMCB细胞、GAK细胞等，以及其他种类的皮肤肿瘤细胞、软组织肿瘤细胞、转移性骨肿瘤的原发肿瘤细胞等也能产生类似效果。

本发明实施例所使用的骨髓间充质干细胞为鼠源细胞。

下述实施例中，如无特殊说明，所用方法为常规方法，所用试剂都来源于市售商品。

实施例1一种外泌体及其制备方法

（1）诱导外泌体

37℃、5% CO₂条件下，采用DMEM/F12培养基于25cm培养皿中将黑色素瘤细胞B16贴壁培养至密度约为90%时，将细胞留在培养皿底部吸取收集其培养液约25mL待用；37℃、5%CO₂条件下，骨髓间充质干细胞以DMEM/F12培养基贴壁培养至密度约为80%（25cm培养皿约可获得2.7×10⁷个细胞）时，吸除其原有培养液并采用PBS清洗细胞，以收集到的肿瘤细胞培养液等体积（约25mL）替换原有培养液于37℃、5% CO₂条件下继续培养48h；48h后收集培养液，以超速离心法获得外泌体沉淀，适量生理盐水将之重悬，得到外泌体溶液，为黑色素瘤细胞刺激后骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，记为诱导外泌体。

所述超速离心法是将收集到的培养液以2000×g离心10min；离心后吸取上清液，10000×g高速离心30 min；再次吸取上清液，140000×g 超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体，生理盐水洗涤沉淀并重悬后，140000×g再次离心90 min，100μL生理盐水重悬沉淀，之后使用时据需求进行稀释。

（2）普通外泌体

37℃、5% CO₂条件下，骨髓间充质干细胞以DMEM/F12培养基于25cm培养皿中贴壁培养至密度约为80%（25cm培养皿约可获得2.7×10⁷个细胞）时，吸除其原有培养液并采用PBS清洗细胞，以25ml新鲜DMEM/F12培养液等体积替换原有培养液于37℃、5% CO₂条件下继续培养48h；48h后收集培养液，以上述同样的超速离心法获得外泌体沉淀，100μL生理盐水将之重悬，得到外泌体溶液，记为普通外泌体。

图1、图2、图3分别为以黑色素瘤细胞培养液刺激后骨髓间充质干细胞分泌的外泌体（诱导外泌体）与骨髓间充质干细胞分泌的外泌体（普通外泌体）的冷冻透射电镜、蛋白质印迹、动态光散射粒径分析图。

图1可见两种外泌体的“茶杯状”形态，且相同骨髓间充质干细胞量时，在同一倍镜视野下，诱导外泌体数量明显多于普通外泌体。图2与图3证明两种外泌体符合外泌体标准。

实施例2 外泌体定量检测

本发明实施例提供了以实施例1中两种外泌体制备方法制备的诱导外泌体与普通外泌体的定量实验。

检测方法：设置两组25cm培养皿培养至密度约为80%的骨髓间充质干细胞（每皿约有2.7×10⁷个细胞），每组5皿。移除其原有培养液并清洗，分别以黑色素瘤细胞培养液（制备方法如实施例1）与新鲜的DMEM/F12培养基继续培养，两组分别收集12h、24h、36h、48h、60h时的培养液，分别以超速离心法（同实施例1）获得外泌体沉淀，以100μL的生理盐水将之重悬，得到不同时段的诱导外泌体与普通外泌体。利用BCA蛋白定量方法比较相同骨髓间充质干细胞量下，不同时段获得的诱导外泌体与普通外泌体的蛋白浓度，并通过蛋白浓度对外泌体进行定量。

图4为不同时段诱导外泌体与普通外泌体的BCA蛋白定量图。由图可知，诱导外泌体数量远高于普通外泌体，且外泌体的量于48h时达到峰值。

实施例3 骨髓间充质干细胞外泌体对肿瘤细胞增殖的影响

本发明实施例提供实施例1制备的诱导外泌体与普通外泌体抑制肿瘤细胞增殖的检测。

检测方法：在96孔板中每孔接种约5000个黑色素瘤细胞B16，37℃、5% CO₂条件下DMEM培养基预培养24小时，去除培养基，分别向孔中加入0μL、10μL、50μL、100μL的48h时的诱导外泌体溶液与普通外泌体溶液（以确保加入的两种外泌体含量成梯度），并用新鲜DMEM培养基补足200μL。将培养板在37℃、5% CO₂条件下培养48小时。向板的每个孔中加入10μlCCK-8溶液。将培养板在37℃、5% CO₂条件下孵育1小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度，计算抑制率。

诱导外泌体与普通外泌体对肿瘤细胞的增殖检测结果如图5所示，两种外泌体均对黑色素瘤细胞产生增殖抑制作用，但诱导外泌体的抑制作用显著高于普通外泌体。

实施例4 肿瘤细胞外泌体对肿瘤细胞增殖的影响

检测方法：黑色素瘤细胞以DMEM培养基贴壁培养至密度约为80%时，收集培养液，以超速离心法获得外泌体沉淀，生理盐水将之重悬，得到外泌体溶液，记为黑色素瘤细胞外泌体，利用BCA蛋白定量方法测定其蛋白浓度。在96孔板中每孔接种约5000个黑色素瘤细胞，37℃、5% CO₂条件下DMEM培养基预培养24小时，去除培养基，分别向孔中加入0μL、10μL、50μL、100μL的黑色素瘤细胞外泌体溶液，并用新鲜DMEM培养基补足200μL。将培养板在37℃、5% CO₂条件下培养48小时。向板的每个孔中加入10μl CCK-8溶液。将培养板在37℃、5%CO₂条件下孵育1小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度，计算存活率。

肿瘤细胞外泌体对肿瘤细胞增殖的影响结果如图6所示，黑色素瘤细胞外泌体对黑色素瘤细胞产生增殖促进作用。

实施例5 外泌体对抗伤害感受因子mRNA表达的影响

本发明实施例提供了实施例1制备的诱导外泌体与普通外泌体中可调节伤害感受的ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达的检测。

在哺乳动物中，痛觉是通过伤害感受性感觉神经元中的特殊转导离子通道和受体检测到有害刺激而产生的。研究表明，ZBTB20在背根神经节伤害感受神经元中高表达，可调节伤害感受器中瞬时受体电位TRP通道的表达，而TRP通道是赋予伤害感受器不同感觉方式的关键感觉传感器，因此ZBTB20是伤害感受和痛觉的关键调节因子。从表型来看， ZBTB20的破坏降低了TRPV1、 TRPA1 和TRPM8在神经元中的表达，以及它们对钙流量和电流的反应性，在伤害感受器中缺乏ZBTB20 的小鼠在对热、机械刺激的反应中表现出伤害感受和痛觉过敏。

检测方法：抽提等蛋白量的诱导外泌体与普通外泌体的总RNA，去除rRNA纯化，通过Oligo（dT）与片段化富集mRNA，逆转录合成cDNA，进而进行定量聚合酶链式反应，分别检测诱导外泌体与普通外泌体的ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达量。

诱导外泌体与普通外泌体中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达量结果如图7示。与普通外泌体相比，诱导外泌体中抗伤害感受的ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达量更高。

实施例6 外泌体对抗伤害感受因子蛋白表达的影响

本发明实施例提供了实施例1制备的诱导外泌体与普通外泌体对肿瘤细胞中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达量影响的检测。

检测方法：10cm 培养皿，37℃、5% CO₂条件下，DMEM/F12培养基，黑色素瘤细胞B16贴壁培养至密度约为70%时，移除其原有培养液并清洗，蛋白浓度均为200μg/μl的诱导外泌体与普通外泌体分别以体积比为1:9的比例与肿瘤培养基混合，以此含有外泌体的混合培养基于37℃、5% CO₂条件下继续培养48h；48h后裂解细胞，提取蛋白，进行蛋白质印记实验检测肿瘤细胞中ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达。37℃、5% CO₂条件下，同样条件下同样数量的未添加外泌体的肿瘤细胞作为对照组，通过裂解后蛋白提取检测相关蛋白表达。

ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达如图8所示。与对照组相比，诱导外泌体组与普通外泌体组的肿瘤细胞中，ZBTB20、TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白表达量均增加，且诱导外泌体组中相关蛋白表达量高于普通外泌体组。

实施例7 外泌体对缓解癌性疼痛的影响

本发明实施例提供了肿瘤细胞培养液刺激后骨髓间充质干细胞分泌的外泌体在缓解癌性疼痛方面的应用。此实施例提供缓解皮肤癌疼痛、软组织癌疼痛、转移性骨肿瘤癌疼痛的结果。

效果例1外泌体缓解黑色素瘤模型小鼠疼痛的试验

检测方法：C57小鼠随机分为4组，每组6只。正常组、诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组。B16细胞（小鼠黑色素瘤细胞）培养液刺激骨髓间充质细胞分泌的外泌体（诱导外泌体）用于此效果例，诱导外泌体、普通外泌体的制备方法同实施例1。

诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组小鼠左侧足底分别接种约1×10⁷个B16细胞，于接种后每隔一天利用冯·弗雷实验测试其机械痛阈值，利用电热板仪测试其热敏值，其机械痛阈值及热敏值稳定后，于13d、14d、15d时诱导外泌体给药组腹腔注射蛋白浓度为200μg/μl的诱导外泌体100μl；普通外泌体给药组腹腔注射蛋白浓度为200μg/μl的普通外泌体100μl；正常组与模型对照组小鼠腹腔注射100μl生理盐水，每次注射1h后利用冯·弗雷实验测试其机械痛阈值，利用电热板仪测试其热敏值（实验结果为6只小鼠平均值）。

在腹腔注射诱导外泌体、普通外泌体后，测试其机械痛阈值及热敏值，两组小鼠机械痛阈值均增大，而诱导外泌体给药组小鼠增大高于普通外泌体给药组小鼠（如图9所示）；两组小鼠热敏值降低，而诱导外泌体给药组小鼠降低高于普通外泌体给药组小鼠（如图9所示）。

效果例2外泌体缓解软组织肿瘤模型小鼠疼痛的试验

检测方法：C57小鼠随机分为4组，每组6只。正常组、诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组。Meth-A细胞（小鼠肉瘤细胞）刺激骨髓间充质细胞分泌的外泌体（诱导外泌体）用于此效果例，诱导外泌体和普通外泌体的制备方法同实施例1。

诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组小鼠左侧足底接种约7×10⁵个Meth-A细胞，接种后每隔一天利用冯·弗雷实验测试其机械痛阈值，利用电热板仪测试其热敏值，其机械痛阈值及热敏值稳定后，于15d、16d、17d时诱导外泌体给药组腹腔注射蛋白浓度为200μg/μl的诱导外泌体100μl；普通外泌体给药组腹腔注射蛋白浓度为200μg/μl的普通外泌体100μl；正常组与模型对照组小鼠腹腔注射100μl生理盐水，每次注射1h后利用冯·弗雷实验测试其机械痛阈值，利用电热板仪测试其热敏值（实验结果为6只小鼠平均值）。

与正常组小鼠相比，诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组小鼠在接种肺癌细胞后，其机械痛阈值降低及热敏值增大。在腹腔注射诱导外泌体、普通外泌体后，测试其机械痛阈值及热敏值，两组小鼠机械痛阈值均增大，而诱导外泌体给药组小鼠增大高于普通外泌体给药组小鼠（如图10所示）；两组小鼠热敏值降低，而诱导外泌体给药组小鼠降低高于普通外泌体给药组小鼠（如图10所示）。

效果例3外泌体缓解骨癌痛模型小鼠疼痛的试验

检测方法：C57小鼠随机分为4组，每组6只。正常组、诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组。LLC细胞（小鼠肺癌细胞）刺激骨髓间充质细胞分泌的外泌体（诱导外泌体）用于此效果例，诱导外泌体和普通外泌体的制备方法同实施例1。

在右胫骨上半部分的皮肤上做一个 1 厘米长的喙尾切口，使用 30 号针，在骨骺生长板远端的膝关节下方 2 毫米处刺入骨头，并将针插入胫骨骨髓腔，取出30号针，更换29号针，诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组均用注射器缓慢注入10 μlPBS的LLC细胞(约1 × 10⁵个细胞)，正常组用注射器缓慢注入10 μl PBS。骨上的注射孔使用羧酸水泥封闭，皮肤伤口使用丝线封闭。接种后每隔一天利用平衡测痛仪测量负重量，负重量稳定后，于15d、16d、17d时诱导外泌体给药组腹腔注射蛋白浓度为200μg/μl的诱导外泌体100μl；普通外泌体给药组腹腔注射蛋白浓度为200μg/μl的普通外泌体100μl；正常组与模型对照组小鼠腹腔注射100μl生理盐水，每次注射1h后利用平衡测痛仪测量负重量（实验结果为6只小鼠平均值）。

与正常组小鼠相比，诱导外泌体给药组、普通外泌体给药组与模型对照组小鼠在接种肺癌细胞后，其负重值降低。在腹腔注射诱导外泌体、普通外泌体后，测试其负重值，两组小鼠负重值均增大，而诱导外泌体给药组小鼠增大高于普通外泌体给药组小鼠（如图11所示）。

实施例8 不同肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞来源的外泌体对同一癌痛的缓解效果

检测方法：按照实施例1中诱导外泌体的制备方法，分别以B16细胞培养液、Meth-A细胞培养液、LLC细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞，并收集其外泌体，记为诱导外泌体1组、诱导外泌体2组、诱导外泌体3组。按照实施例7中，效果例1、效果例2、效果例3建立三种小鼠疼痛模型。正常组、模型对照组、普通外泌体组与效果例1-3保持一致，诱导外泌体组均在对应天数分别给予3种诱导外泌体，1h后测量机械痛、热敏值或负重量。

不同肿瘤细胞培养液刺激骨髓间充质干细胞来源的外泌体对同一癌痛的缓解效果如图12所示，诱导外泌体缓解疼痛效果均强于普通外泌体，且对应肿瘤来源的诱导外泌体缓解效果最佳。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，其特征在于，所述外泌体是由肿瘤细胞培养液于37℃、5% CO₂条件下刺激骨髓间充质干细胞产生；

所述肿瘤细胞为黑素瘤细胞、纤维肉瘤细胞或肺癌细胞；

所述肿瘤细胞培养液为：肿瘤细胞贴壁培养至密度为80-90%时，去除肿瘤细胞后收集的培养液。

2.权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，以培养过肿瘤细胞的培养液培养骨髓间充质干细胞后收集培养液，从培养液中收集外泌体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一： 37℃、5% CO₂条件下，肿瘤细胞贴壁培养至密度为80-90%时，去除细胞收集培养液；

步骤二：骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度为70-80%时，移除原有培养液并清洗；

步骤三：以收集到的肿瘤细胞培养液继续培养上述经过清洗的骨髓间充质干细胞；12-48h后收集培养液，超速离心法收集外泌体沉淀。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，37℃、5% CO₂条件下，骨髓间充质干细胞贴壁培养至密度为70-80%时，移除其原有培养液并清洗，以收集到的肿瘤细胞培养液于37℃、5% CO₂条件下继续培养48h；48h后收集培养液，离心获得外泌体。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述超速离心法是将收集到的培养液以2000×g离心10min；离心后吸取上清液，10000×g高速离心30 min；再次吸取上清液，140000×g 超速离心90 min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体，用生理盐水洗涤沉淀并重悬后，140000×g再次离心90 min，适量生理盐水重悬沉淀。

6.包含权利要求1所述外泌体的药物。

7.权利要求1所述外泌体在制备缓解癌性疼痛药物中的应用。

8.权利要求1所述外泌体在制备抑制黑素瘤细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述外泌体是由黑素瘤细胞培养液于37℃、5% CO₂条件下刺激骨髓间充质干细胞产生。

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述外泌体为制备癌性疼痛药物或抑制黑素瘤细胞增殖药物的唯一活性成分。