CN114681487A - 一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其包括人源间充质干细胞的外泌体和利福平。本发明利用外泌体载药技术，将抗结核药物利福平装载入人源间充质干细胞外泌体中，通过实验发现其具有显著的抑制肿瘤生长增殖、迁移和侵袭的疗效，能够促进肿瘤的细胞凋亡和细胞周期停滞，尤其对骨肉瘤细胞具有明显的抑制生长作用。将其制备为治疗肿瘤药物后对于提高骨肉瘤患者的治疗效果，改善预后和提高生存率具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物。
背景技术
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨恶性肿瘤，是原发性软组织恶性肿瘤中发病率最高的疾病。随着外科手术的进步及新化疗方案的建立，骨肉瘤的诊治取得了重大进步。然而，在过去的几十年中，骨肉瘤的治疗进入瓶颈期，无法有效地优化目前治疗方案或确定新的治疗药物，复发转移性骨肉瘤5年无进展生存率仍低于30％。因此探索新的治疗方案和研发新的抗骨肉瘤药物是目前亟待解决的难题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，该复合物具有显著的抑制肿瘤生长增殖、迁移和侵袭的疗效，能够促进肿瘤的细胞凋亡和细胞周期停滞，尤其对骨肉瘤具有显著的生长抑制作用，为抗肿瘤药物的研发提供了新思路。
为了实现上述目的，本发明的实施例提出了一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其包括：
人源间充质干细胞的外泌体和利福平。
根据本发明实施例的一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，利用外泌体载药技术，将药物利福平装载入人源间充质干细胞外泌体中，通过实验发现其具有显著的抑制肿瘤生长增殖、迁移和侵袭的疗效，能够促进肿瘤的细胞凋亡和细胞周期停滞，尤其对骨肉瘤细胞具有明显的抑制生长作用。将其制备为治疗肿瘤药物后，对于提高骨肉瘤患者的治疗效果，改善预后和提高生存率具有重要的意义。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，所述肿瘤为恶性肿瘤。
可选地，所述肿瘤为骨肉瘤。
可选地，所述人源间充质干细胞为为人源骨髓间充质干细胞。
可选地，所述外泌体复合物的制备包括：将利福平加入到人源间充质干细胞的外泌体中，4℃摇床孵育48h后，超速离心，收集外泌体即可。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例的电镜拍摄对比无载药外泌体(EXO)和装载利福平外泌体(EXO-RIF)的形态；
图2为根据本发明对比例的纳米粒度电位仪检测外泌体的粒径；
图3为根据本发明实施例的蛋白免疫印迹实验检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)、无载药外泌体和装载利福平外泌体的特异蛋白表达水平；
图4为根据本发明实施例的纳米粒度电位仪检测外泌体的粒径随时间的变化情况；
图5为根据本发明实施例的CCK-8实验检测细胞的活性，空白对照组(Control)、无载药外泌体组(EXO)和装载利福平外泌体组(EXO-RIF)；
图6为根据本发明实施例的划痕实验检测细胞的增殖迁移能力；
图7为根据本发明实施例的划痕实验检测细胞的增殖迁移能力的统计分析；
图8为根据本发明实施例的Transwell实验检测细胞的侵袭能力；
图9为根据本发明实施例的Transwell实验检测细胞的侵袭能力的统计分析；
图10为根据本发明实施例的克隆实验检测细胞的集落形成能力；
图11为根据本发明实施例的克隆实验检测细胞的集落形成能力的统计分析；
图12为根据本发明实施例的Annexin V-PI流式细胞术检测细胞的凋亡，空白对照组(Control)、无载药外泌体组(EXO)和装载利福平外泌体组(EXO-RIF)；
图13为根据本发明实施例的Annexin V-PI流式细胞术检测细胞的凋亡的统计分析；
图14为根据本发明实施例的流式细胞术检测细胞的周期变化；
图15为根据本发明实施例的流式细胞术检测细胞的周期变化的统计分析；
图16为根据本发明实施例的裸鼠骨肉瘤组织的形态大小对比，空白对照组(Control)、无载药外泌体组(EXO)和装载利福平外泌体组(EXO-RIF)；
图17为根据本发明实施例的裸鼠骨肉瘤组织的体积和重量对比。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1外泌体的分离提取及药物利福平装载
(1)骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体的分离提取：选取人源BMSCs为研究对象，利用无外泌体的血清进行细胞培养，选取超速离心法提取外泌体，方法如下：人源BMSCs培育在37℃，5％CO2的细胞培养箱中，收集细胞上清液50mL，300g，4℃离心15min，去除杂质取上清；3000g，4℃离心15min，去除细胞碎片取上清；20000g，4℃离心60min，取上清用0.22μm的筛子过滤；120000g，4℃离心120min，小心取出上清，并倒立在滤纸上吸干，外泌体包含在沉淀中，用适量的PBS重悬，收集在无菌的EP管中，80℃保藏备用；
(2)包裹利福平外泌体的制备：加入10mg/mL的利福平到步骤(1)获得的外泌体中，4℃摇床孵育48h后再次利用步骤(1)所示的超速离心法获取纯化后的包含利福平药物的外泌体(EXO-RIF)，以不含药物组的外泌体(EXO)作为对照。
(3)将上述步骤获得的外泌体进行检测，如图1电镜拍摄所示，载药外泌体和无载药外泌体具备完整的双层膜结果，粒径符合外泌体大小；如图2纳米粒度电位仪检测所示，EXO-RIF组的粒径大于EXO组；将细胞用RIPA裂解后收集总蛋白，经过电泳、转膜、封闭和抗体孵育结合后，蛋白免疫印迹结果提示：如图3，EXO组和EXO-RIF组特异性高表达外泌体标志蛋白(CD63\TSG101\CD9\CD81)，不表达内质网特异性蛋白(Calnexin)。如图4纳米粒度电位仪检测所示，在载药后1周时间内，EXO组和EXO-RIF组粒径均维持在稳定水平。
实施例2外泌体复合物对骨肉瘤143B细胞系在体外的抑制效果
(1)人骨肉瘤细胞系143B接种在含有10％的FBS和1％的青链霉素的高糖完全培养基DMEM中，之后放在含有5％CO2的37℃恒温培养箱中进行培养。设置空白对照组(Control)：培养液中加入与其他组等量的PBS溶液；无载药外泌体组(EXO)：培养液中含有106个/mL外泌体；外泌体复合物组(EXO-RIF)：培养液中含有25μg/mL利福平和106个/mL外泌体。
(2)通过CCK-8实验检测细胞的活性：将细胞离心重悬制成细胞悬液，然后将细胞悬液进行计数，将细胞稀释成50个/μL，取100μL接种于96孔板中，每组细胞设置10个重复，于含有不同药物的培养基中培养24h后，每个孔分别加入10μL的CCK-8试剂，放回培养箱中继续培养2h，之后在450nm处检测吸光度。如图5所示，EXO-RIF组的细胞存活率显著低于Control组和EXO组(***P<0.001)。
(3)细胞划痕实验：将细胞制成细胞悬液，并将细胞接种在6孔板上，每种细胞设置三个重复，接种的细胞量要确保第二天的细胞密度为80％-90％，之后用10μL的枪头沿着6孔板的盖子在细胞上制造划痕，然后用PBS洗三遍，将划下来的细胞和细胞碎片洗干净，于含有不同药物的培养基中培养24h。分别在0h和24h进行取样拍照，如图6和图7所示，EXO-RIF组的划痕恢复面积显著低于Control组和EXO组(***P<0.001)。
(4)Transwell实验：①将细胞用0.25％胰酶消化3min，加入等量培养液后离心1300g3min，然后用PBS洗2-3遍，用不含FBS和双抗的培养基将细胞重悬。②将重悬后的细胞进行计数，并调整细胞密度为5×105/mL，然后取200μL的细胞悬液放到小室中，上室培养基中含有不同浓度的药物，每组细胞含有三个重复，24孔板下室则加500μL含10％FBS的完全培养基，将小室放到24孔板中，放入培养箱中培养24h。③取出小室，将小室中的培养基去掉，用棉签将小室里面的细胞轻轻擦掉，然后将小室放到PBS洗两遍，然后用多聚甲醛固定20min，之后用1％的结晶紫染色过夜，之后用清水轻轻把结晶紫洗干净，通风处晾干。④在显微镜下随机拍取3个视野的照片，计数。如图8和图9所示，EXO-RIF组的迁移细胞数量显著低于Control组和EXO组(***P<0.001)。
(5)平板克隆形成实验：将处于对数生长期，生长状态良好的细胞，用0.25％胰酶消化3min，加入等量培养液后离心1300g 3min，将细胞重悬在完全培养基中。用细胞计数器对细胞进行计数，将300个细胞接种到含有2mL完全培养基的六孔板中，前后左右晃动让细胞分布均匀。将6孔板置于培养箱中过夜，次日给药。于含有不同药物的培养基中培养14天，培养期间观察细胞生长状况，当6孔板中出现肉眼可见的细胞团块时，可终止培养，弃上清，用PBS洗涤2次，用甲醇固定15分钟，弃固定液，加结晶紫染料染色10分钟，用流水缓慢洗去染料，放烘箱干燥，拍照。将6孔板置于显微镜下计数大于10个细胞的克隆数，最后计算克隆形成率。如图10图11所示，EXO-RIF组的细胞集落形成量显著低于Control组和EXO组(***P<0.001)。
(6)细胞凋亡流式检测：细胞药物处理后，用0.25％胰酶消化3min，加入等量培养液后离心1300g 3min，加入PBS清洗2遍后，用直径为70μm筛网进行过滤。吸取BindingBuffer加入到细胞中，反复吹打重悬细胞。加入Annexin V-FITC和PI染料各5μL，放在涡旋仪上轻轻涡旋混匀后置室温避光孵育15分钟。待孵育时间结束后，每管加入400μL的Binding Buffer，涡旋混匀后上机检测细胞调亡情况。如图12和图13所示，EXO-RIF组的细胞凋亡率显著高于Control组和EXO组(***P<0.001)。可见，利用外泌体复合物治疗能够显著促进骨肉瘤细胞的凋亡。
(7)细胞周期流式检测：将细胞离心重悬，调整细胞浓度为5×104/mL，每孔加入4mL，于含有不同药物的培养基中培养24后，用0.25％胰酶消化3min，加入等量培养液后离心1300g 3min，用300μL PBS重悬细胞沉淀，预冷的无水乙醇逐滴滴入，吹匀至呈微白色，冻于-20℃固定过夜。将细胞离心1500rpm，3min，用PBS洗3遍。加入200μL PI综合液(PBS含50μg/mL溴化乙锭，100μg/mL核糖核酸酶A，0.2％聚乙二醇辛基苯基醚)重悬细胞，37℃水浴30min，流式细胞仪检测。如图14和图15所示，EXO-RIF组的细胞大量停滞于G2/M期，比例显著高于Control组和EXO组(***P<0.001)。可见，利用外泌体复合物治疗能够显著促进骨肉瘤细胞的周期停滞。
实施例3外泌体复合物对载瘤裸鼠的肿瘤生长抑制效果
在本实施例中选取18只4-6周龄雄性BALB/C裸鼠，每只裸鼠通过胫骨平台往胫骨骨髓腔内注射20μL含有107个143B骨肉瘤细胞的混悬液，肿瘤注射7天后随机分成3组，每组6只。空白对照组(Control)：每日静脉注射与其他组等量的生理盐水溶液；无载药外泌体组(EXO)：每日静脉注射含有108个/mL外泌体生理盐水溶液；外泌体复合物组(EXO-RIF)：依照裸鼠重量，按照10mg/kg利福平的剂量，每日静脉注射含有10mg/mL利福平和108个/mL外泌体生理盐水溶液。连续注射21天后取材，称重观察。
如图16和图17所示，EXO-RIF组的肿瘤组织大小显著小于Control组和EXO组，体积测量结果提示EXO-RIF组的肿瘤体积显著低于Control组和EXO组(***P<0.001)；称量结果提示EXO-RIF组的肿瘤重量显著低于Control组和EXO组(**P<0.01)。可见，利用外泌体复合物治疗能够显著抑制肿瘤在裸鼠体内的生长。
综上，根据本发明的实施例，本发明的外泌体复合物具有显著的抑制肿瘤生长增殖、迁移和侵袭的疗效，能够促进肿瘤的细胞凋亡和细胞周期停滞，尤其对骨肉瘤细胞具有明显的抑制生长作用。将其制备为治疗肿瘤药物后对于提高骨肉瘤患者的治疗效果，改善预后和提高生存率具有重要的意义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其特征在于，包括：
人源间充质干细胞的外泌体和利福平。
2.如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤。
3.如权利要求1或2所述的具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其特征在于，所述肿瘤为骨肉瘤。
4.如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其特征在于，所述人源间充质干细胞为人源骨髓间充质干细胞。
5.如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的外泌体复合物，其特征在于，所述外泌体复合物的制备包括：将利福平加入到人源间充质干细胞的外泌体中，4℃摇床孵育48h后，超速离心，收集外泌体即可。
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