CN115040627A - 一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方及其制备方法和应用 - Google Patents

一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方及其制备方法和应用，属于中医药技术领域。本发明提供的温补脾肾方，包括如下浓度份的组分：吴茱萸提取物2～5μg/ml、山茱萸提取物2～5μg/ml、蜀椒提取物4～10μg/ml、生姜提取物4～10μg/ml。利用本发明的温补脾肾方可有效保护TPOAb损伤细胞，降低细胞凋亡率，提高细胞T4分泌水平，改善甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎患者的甲状腺激素水平和TPOAb、TGAb水平，治疗有效率可达91％以上。并且，本发明的中药原料来源广泛，在多地均有种植，制备方法简单，具有广阔的应用前景。

Description

一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，尤其涉及一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方及其制备方法和应用。
背景技术
桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis，HT)又称桥本氏病或慢性淋巴细胞性甲状腺炎，以甲状腺组织中有大量淋巴细胞浸润以及血清中出现高滴度的甲状腺自身抗体为主要特征，是目前最常见的自身免疫性疾病。血清检测有高滴度水平的甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体 (TgAb)是临床诊断HT的主要依据。HT的发病机制至今尚未完全阐明，主要被认为是遗传、环境等因素造成免疫耐受性的破坏而导致。作为自身免疫性疾病，这一破坏主要是由于细胞和抗体介导的一系列免疫过程破坏甲状腺滤泡细胞引起的，而这其中的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC) 被认为是HT的重要细胞损伤机制。TPO是由甲状腺滤泡细胞合成的含有 10％糖化的血色素样蛋白质，是催化甲状腺激素的重要酶，与甲状腺组织免疫性损伤密切相关。TPOAb可直接对抗TPO，并可通过ADCC途径造成甲状腺组织或细胞损伤，从而使甲状腺激素分泌不足造成自身免疫相关的甲减，因此HT患者后期往往伴随甲减出现。
当前HT的发病率逐年快速增加，但缺少有效的治疗药物。目前西医针对此病多采用甲状腺激素替代治疗、糖皮质激素免疫调节治疗、微量元素硒辅助治疗等，但这些治疗方法也是根据症状进行，而不是HT的发病机制进行根本治疗，疗效局限、易复发，尤其是对早期无症状治疗缺少可用的有效药物。因此迫切需要寻找新的治疗方法、药物来预防并治疗HT。近年来有关中医药治疗HT的报道明显增加，在改善症状、降低甲状腺自身抗体方面具有显著疗效，但对HT的中医治疗方药多局限于自拟方和经验方，难以开展进一步的科学研究，因此研制出对TPOAb损伤甲状腺滤泡细胞有直接保护作用的经典方药，为HT早期治疗提供有效方药是本领域技术人员需要解决的重要技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方及其制备方法和应用。本发明的温补脾肾方针对TPOAb损伤细胞，可有效降低细胞凋亡率，提高细胞T4分泌水平，达到治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方，包括如下浓度份的组分：吴茱萸提取物2～5μg/ml、山茱萸提取物2～5μg/ml、蜀椒提取物4～10μg/ml、生姜提取物4～10μg/ml。
本发明还提供了一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方的制备方法，包括水提法和醇提法；
所述水提法包括如下步骤：
(1)取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加水浸泡，煎煮，得到单味药的煎出液；
(2)将所述煎出液分别浓缩，固液分离，取滤液微滤后，得到单味药的提取物；
(3)将所述单味药的提取物按所述浓度份混合，得到温补脾肾方；
所述醇提法包括如下步骤：
(1)取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加乙醇溶液浸泡，过滤，得到单味药的药液；
(2)将所述药液分别蒸发，干燥，得到单味药的提取物；
(3)将所述单味药的提取物按所述的浓度份混合，得到温补脾肾方。
优选的，所述水提法的步骤(1)中所述水的添加量为单味药重量的10～15 倍；所述浸泡的时间为0.5～2h；所述煎煮为以武火煮沸再以文火煎煮的方式进行，所述煎煮的温度为95～105℃，所述煎煮的时间为40～80min。
优选的，所述水提法的步骤(2)中所述浓缩后的煎出液体积为所述水的添加量的1/9～1/6；所述固液分离为先用六层医用纱布过滤，取滤液再离心；所述离心的转速为2000～4000rpm/min，所述离心的时间为20～40min；所述微滤采用0.2～0.3μm的滤膜过滤。
优选的，所述醇提法的步骤(1)中所述乙醇溶液的体积浓度为90～98％，所述乙醇溶液的添加量为单味药重量的10～15倍；所述浸泡的时间为6～8天；所述过滤采用负压过滤，所述负压过滤的压力为-0.06～-0.05MPa。
优选的，所述醇提法的步骤(2)中所述蒸发采用先旋蒸，再水浴蒸发的方式进行；所述旋蒸的温度为50～60℃，所述旋蒸的压力为 -0.095～-0.09MPa；所述旋蒸的转速为90～120转/分；所述旋蒸后的药液体积为所述乙醇溶液添加量的1/30～1/10；所述水浴蒸发的温度为50～60℃，所述水浴蒸发的时间为1～2天。
优选的，所述醇提法的步骤(2)中所述干燥为真空干燥，所述真空干燥的温度为50～60℃，所述真空干燥的真空度为-0.12～-0.06MPa，所述真空干燥的时间为36～48h。
本发明还提供了一种所述温补脾肾方或所述温补脾肾方中单味药的提取物在制备治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的药物中的应用。
本发明还提供了一种所述制备方法得到的温补脾肾方或所述单味药的提取物在制备治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的药物中的应用。
优选的，所述单味药为吴茱萸或蜀椒。
本发明提供了一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方，从桥本甲状腺炎的ADCC机制出发，建立体外TPOAb损伤甲状腺滤泡细胞模型，运用细胞共培养、MTT法、流式细胞术、免疫荧光标记、酶联免疫吸附实验(ELISA)、蛋白免疫印迹(Western Blot)等技术筛选出对TPOAb 损伤甲状腺滤泡细胞模型具有较高保护作用的单味药4味，组成新的可有效治疗HT的中医方药，将其命名为温补脾肾方，并临床观察研制出的有效方药对HT患者的疗效，为HT的治疗提供新的方药。
本发明提供的温补脾肾方由吴茱萸提取物、山茱萸提取物、蜀椒提取物、生姜提取物按照科学配比配制而成，其中，各单味药提取物以及温补脾肾方对TPOAb损伤细胞均具有保护作用，可显著抑制TPOAb通过ADCC途径造成的甲状腺组织或细胞损伤，降低细胞凋亡率，提高细胞T4分泌水平。利用本发明的温补脾肾方可显著改善甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎患者的甲状腺激素水平和TPOAb、TGAb水平，治疗有效率可达91％以上。并且，本发明的中药原料来源广泛，在多地均有种植，制备方法简单，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的吴茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图2为实施例1制备的山茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图3为实施例1制备的蜀椒提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图4为实施例1制备的生姜提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图5为实施例2制备的吴茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图6为实施例2制备的山茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图7为实施例2制备的蜀椒提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图8为实施例2制备的生姜提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图9为实施例3中不同浓度温补脾肾方对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的量效关系；
图10为实施例4中吴茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的时效关系；
图11为实施例4中山茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的时效关系；
图12为实施例4中蜀椒提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的时效关系；
图13为实施例4中生姜提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的时效关系；
图14为实施例4中温补脾肾方对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护作用的时效关系。
具体实施方式
本发明提供了一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方，包括如下浓度份的组分：吴茱萸提取物2～5μg/ml、山茱萸提取物2～5μg/ml、蜀椒提取物4～10μg/ml、生姜提取物4～10μg/ml。
在本发明中，所述温补脾肾方，优选包括如下浓度份的组分：吴茱萸提取物2～5μg/ml、山茱萸提取物2～5μg/ml、蜀椒提取物4～10μg/ml、生姜提取物4～10μg/ml；进一步优选包括如下重量份的组分：吴茱萸提取物3～4μg/ml、山茱萸提取物3～4μg/ml、蜀椒提取物6～8μg/ml、生姜提取物6～8μg/ml；再进一步优选包括如下重量份的组分：吴茱萸提取物3.125μg/ml、山茱萸提取物3.125μg/ml、蜀椒提取物6.25μg/ml、生姜提取物6.25μg/ml。
本发明还提供了一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方的制备方法，包括水提法和醇提法；
所述水提法包括如下步骤：
(1)取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加水浸泡，煎煮，得到单味药的煎出液；
(2)将所述煎出液分别浓缩，固液分离，取滤液微滤后，得到单味药的提取物；
(3)将所述单味药的提取物按所述浓度份混合，得到温补脾肾方；
所述醇提法包括如下步骤：
(1)取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加乙醇溶液浸泡，过滤，得到单味药的药液；
(2)将所述药液分别蒸发，干燥，得到单味药的提取物；
(3)将所述单味药的提取物按所述的浓度份混合，得到温补脾肾方。
本发明的水提法将吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加水浸泡，煎煮，得到单味药的煎出液。
在本发明中，所述水的添加量优选为单味药重量的10～15倍，进一步优选为12倍。
在本发明中，所述水优选为超纯水。
在本发明中，所述浸泡的时间优选为0.5～2h，进一步优选为1h。
在本发明中，所述浸泡时优选用保鲜膜密封。
在本发明中，所述煎煮优选为以武火煮沸再以文火煎煮的方式进行。
在本发明中，所述煎煮的温度优选为95～105℃，进一步优选为100℃。
在本发明中，所述文火煎煮的时间优选为40～80min，进一步优选为 60min。
制备得到煎出液后，本发明将所述煎出液依次浓缩，固液分离，取滤液微滤后，得到单味药的提取物。
在本发明中，所述浓缩后的煎出液体积优选为所述水的添加量的1/9～1/6，进一步优选为1/8。
在本发明中，所述固液分离优选用六层医用纱布过滤。
在本发明中，所述固液分离优选为离心。
在本发明中，所述离心的转速优选为2000～4000rpm/min，进一步优选为3000rpm/min。
在本发明中，所述离心的时间优选为20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，所述微滤优选采用0.2～0.3μm的微孔滤头过滤，进一步优选采用0.22μm的微孔滤头过滤。
在本发明中，所述微滤后的提取物优选置于-20℃保存备用。
本发明的水提法将所述单味药的提取物按浓度份混合，即得温补脾肾方。
本发明的醇提法是将吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加乙醇溶液浸泡，过滤，得到单味药的药液。
在本发明中，所述乙醇溶液的体积浓度优选为90～98％，进一步优选为 95％。
在本发明中，所述乙醇溶液的添加量优选为单味药重量的10～15倍，进一步优选为12倍。
在本发明中，所述浸泡时优选用保鲜膜密封，置于避光干燥阴凉处浸泡。
在本发明中，所述浸泡时优选每日摇晃搅拌1～3次，进一步优选每天摇晃2次。
在本发明中，所述浸泡的时间优选为6～8天，进一步优选为7天。
在本发明中，所述过滤优选采用负压过滤。
在本发明中，所述负压过滤优选用直径为10cm的布氏漏斗垫上两层直径为12.5cm的中速定性滤纸将药液负压过滤至锥形抽滤瓶中。
在本发明中，所述负压过滤的压力优选为-0.06～-0.05MPa，进一步优选为-0.055Mpa。
制备得到药液后，将所得药液依次蒸发，干燥，得到单味药的提取物。
在本发明中，所述蒸发优选采用先旋蒸，再水浴蒸发的方式进行。
在本发明中，所述旋蒸的温度优选为50～60℃，进一步优选为56℃。
在本发明中，所述旋蒸的压力优选为-0.095～-0.09MPa，进一步优选为 -0.09MPa。
在本发明中，所述旋蒸的转速优选为90～120转/分，进一步优选为100 转/分。
在本发明中，所述旋蒸后的药液体积优选为所述乙醇溶液添加量的 1/30～1/10，进一步优选为1/25～1/12，再进一步优选为1/15。
在本发明中，所述水浴蒸发的温度优选为50～60℃，进一步优选为56℃。
在本发明中，所述水浴蒸发的时间优选为1～2天，进一步优选为2天。
在本发明中，所述干燥优选为真空干燥。
在本发明中，所述真空干燥的温度优选为50～60℃，进一步优选为56℃。
在本发明中，所述真空干燥的真空度优选为-0.12～-0.06MPa，进一步优选为-0.09MPa。
在本发明中，所述真空干燥的时间优选为36～48h，进一步优选为40h。
在本发明中，干燥后的提取物优选置于-20℃保存备用。
本发明的醇提法将所述单味药的提取物按浓度份混合，得到温补脾肾方。
本发明还提供了一种所述温补脾肾方或所述温补脾肾方中单味药的提取物在制备治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的药物中的应用。
本发明还提供了一种所述制备方法得到的温补脾肾方或所述单味药的提取物在制备治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的药物中的应用。
在本发明中，所述单味药优选为吴茱萸或蜀椒。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
采用醇提法制备吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜的提取物，具体制备过程如下：
取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别放入洁净烧杯中，按其重量的12 倍加入95％乙醇溶液，用保鲜膜封口，放置避光干燥阴凉处，每日摇晃搅拌两次，浸泡7天后，用直径为10cm的布氏漏斗垫上两层直径为12.5cm的中速定性滤纸将药液以-0.055MPa的压力负压过滤至锥形抽滤瓶中，得到各单味药的药液。将各单味药的药液倒入旋蒸瓶，用旋蒸仪在56℃下，以 -0.095MPa的真空负压，以100转/分的转速进行旋蒸，待药液旋蒸至乙醇溶液添加量的1/15时关闭旋蒸仪；将旋蒸后的药液倒入蒸发皿中，以56℃水浴蒸发2天，将蒸发后的药液放至56℃、真空度为-0.09MPa的真空干燥箱中干燥40h，得到干燥药粉，即各单味药提取物。
构建TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型，采用上述过程制备得到的单味药提取物作用于该模型，以细胞保护率为指标，检测单味药提取物对TPOAb 损伤Nthy-ori3-1细胞模型细胞保护率的量效关系。具体操作如下：
以人甲状腺正常滤泡上皮细胞Nthy-ori3-1(购自广州吉妮欧生物科技有限公司)为研究对象，取对数生长期Nthy-ori3-1细胞以1×104cells/孔的浓度接种至96孔板，200μl/孔，24h后吸去细胞上清后，PBS 200μl/孔洗两遍，分别设置空白组、模型组、模型加药组。空白组加入不含血清RPMI 1640 培养液100μl/孔，模型组加入10ng/ml TPOAb+不含血清RPMI 1640培养液 100μl/孔，模型加药组分别加入10ng/ml TPOAb+不同浓度单味药提取物工作液+不含血清RPMI 1640培养液100μl/孔。
其中，不同浓度单味药提取物工作液按照如下方法配置：称取上述制备的各单味药干燥药粉0.03g，分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配成0.3g/mL的药物储备液。利用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将药物储备液稀释成4mg/mL的药物母液，0.22m微孔滤器过滤，然后用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将药物母液稀释成以下不同浓度单味药提取物工作液。工作液药物浓度分别为1.5625μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、 25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml。
加样后放置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱孵育2小时，加入 HL-60细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)100μl/孔作为效应细胞，其效靶比按照12：1的比例进行，1000rpm/min离心3min 使效应细胞与靶细胞充分接触，继续培养24h后，再次用PBS 200μl/孔洗两遍，洗掉孔中的HL-60细胞，然后加入配置好的MTT工作液100μl/孔。细胞培养箱中孵育4h后加入DMSO 150μl/孔，置于脱色摇床上30min使DMSO 颜色均匀，酶标仪双波长(570nm，630nm)下测吸光值(即OD值)，先计算细胞损伤率(％)＝[(空白组OD值-模型组OD值)/空白组OD值]×100％，待计算出模型组细胞损伤率>40％时视为细胞模型建立成功；再计算模型加药组细胞保护率(％)＝[(模型加药组OD值-模型组OD值)/模型组OD 值]×100％。
统计各单味药提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型细胞保护率的量效关系，结果如表1所示，并绘制量效关系图，如图1～4所示。
表1各单味药提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护率的量效关系
Figure BDA0003746057680000091
从表1可以看出，采用醇提法，吴茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1 细胞模型的最佳保护率为33.36％，对应药物作用浓度为12.5μg/ml；山茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率为35.22％，对应药物作用浓度为12.5μg/ml；蜀椒提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率为28.46％，对应药物作用浓度为25μg/ml；生姜提取物对TPOAb 损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率为27.36％，对应药物作用浓度为 25μg/ml。因此，采用醇提法，吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜提取物对TPOAb 损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用浓度分别为12.5μg/ml、12.5μg/ml、 25μg/ml、25μg/ml。
实施例2
采用水提法制备吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜的提取物，具体制备过程如下：
取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别放入洁净烧杯中，按其重量的12 倍加入超纯水，用保鲜膜封口，浸泡1h；浸泡结束后用电炉先以武火煮沸再改文火煎煮60min，控制煎煮温度为100℃。每种药物的煎出液浓缩至超纯水的添加量的1/8，关闭电炉，得到煎出液。用六层医用纱布将煎出液过滤至离心管中，再将过滤后的煎煮液以3000rpm/min离心30min，以去除药物残渣；取离心后的上层药液用孔径0.22μm微孔滤头过滤，即得各单味药的提取物。
取干净锡箔纸折成2cm×2cm×2cm大小的锡纸盒，十万分之天平称量锡纸盒的重量(单位g)，用移液枪吸取1ml过滤后的药液至锡纸盒中，放至56℃、真空度为-0.09MPa的真空干燥箱中干燥，待药液干燥后于十万分之天平上称量含药锡纸重量(单位g)，计算药液浓度为(含药锡纸重量-锡纸重量)/1ml＝g/ml。测得上述制备的吴茱萸提取物浓度为0.01678g/ml，山茱萸提取物浓度为0.01256g/ml，蜀椒提取物浓度为0.00825g/ml，生姜提取物浓度为0.01018g/ml。
构建TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型，采用上述过程制备得到的单味药提取物作用于该模型，以细胞保护率为指标，检测单味药提取物对TPOAb 损伤Nthy-ori3-1细胞模型细胞保护率的量效关系。具体操作与实施例1相同。
其中，不同浓度单味药提取物工作液按照如下方法配置：
将上述制备的单味药提取物用不含胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成 4mg/ml的药物母液，2ml无菌离心管分装，-20℃储存。加药时用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将药物母液稀释成以下不同浓度单味药提取物工作液。工作液药物浓度分别为1.5625μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、 25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml。
结果如表2所示，并绘制量效关系图，如图5～8所示。
表2单味药提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护率的量效关系
Figure BDA0003746057680000111
从表2可以看出，采用水提法，吴茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1 细胞模型的最佳保护率为36.48％、对应药物作用浓度为12.5μg/ml，山茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率为28.84％、对应药物作用浓度为12.5μg/ml，蜀椒提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率为24.42％、对应药物作用浓度为25μg/ml，生姜提取物对TPOAb 损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率为25.48％、对应药物作用浓度为 25μg/ml。因此，采用水提法，吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜提取物对TPOAb 损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用浓度分别为12.5μg/ml、12.5μg/ml、 25μg/ml、25μg/ml。
实施例3
由实施例1和实施例2可知，醇提法与水提法制备得到的各单味药提取物的最佳作用浓度相同。以实施例1制备得到的各单味药提取物，以表1中 4味药物的最佳作用浓度为基准，按不同浓度倍数混合配制温补脾肾方，作用于TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型，以细胞保护率为指标，检测温补脾肾方对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型细胞保护率的量效关系。具体操作与实施例1相同，结果如表3所示，并绘制量效关系图，如图9所示。
表3温补脾肾方对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型保护率的量效关系
Figure BDA0003746057680000121
从表3可以看出，温补脾肾方的最佳作用浓度为单味药最佳浓度的0.25 倍，即温补脾肾方中各单味药最佳作用浓度分别为3.125μg/ml、3.125μg/ml、 6.25μg/ml、6.25μg/ml，质量比为1：1：2：2。
实施例4
根据表1中4味药物的最佳作用浓度，称取实施例1制备的各单味药干燥药粉0.03g，分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配成0.3g/mL的药物储备液。利用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将药物储备液稀释成 4mg/mL的药物母液，0.22m微孔滤器过滤，然后用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将吴茱萸药物母液稀释成12.5μg/ml，将山茱萸药物母液稀释成 12.5μg/ml，将蜀椒药物母液稀释成25μg/ml，将生姜药物母液稀释成25μg/ml，作为单味药提取物作用于TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型。再将上述稀释得到的4味单味药提取物等体积混合，配制成温补脾肾方(方中吴茱萸提取物浓度为3.125μg/ml，山茱萸提取物浓度为3.125μg/ml，蜀椒提取物浓度为6.25μg/ml，生姜提取物浓度为6.25μg/ml)，作用于TPOAb损伤Nthy-ori3-1 细胞模型。以细胞保护率为指标，检测各单味药提取物和温补脾肾方对 TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型细胞保护率的时效关系。结果如表4所示，并绘制时效关系图，如图10～14所示。
表4单味药提取物和温补脾肾方对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型细胞保护率的时效关系
Figure BDA0003746057680000131
从表4可以看出，吴茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用时间点为24h，最佳保护率为32.98％；山茱萸提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用时间点为24h，最佳保护率为35.08％；蜀椒提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用时间点为36h，最佳保护率为29.12％；生姜提取物对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用时间点为36h，最佳保护率为27.59％；温补脾肾方对TPOAb损伤 Nthy-ori3-1细胞模型的最佳作用时间点为24h，最佳保护率为36.92％。综合来看，本发明提供的温补脾肾方对TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型的最佳保护率和作用时间优于单味药提取物。
实施例5
根据表1中4味药物的最佳作用浓度，称取实施例1制备的各单味药干燥药粉0.03g，分别溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配成0.3g/mL的药物储备液。利用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将药物储备液稀释成 4mg/mL的药物母液，0.22m微孔滤器过滤，然后用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基将吴茱萸药物母液稀释成12.5μg/ml，将山茱萸药物母液稀释成以12.5μg/ml，将蜀椒药物母液稀释成25μg/ml，将生姜药物母液稀释成25μg/ml，作为单味药提取物作用于TPOAb损伤Nthy-ori3-1细胞模型。再将上述稀释得到的4味单味药提取物等体积混合，配制成温补脾肾方(方中吴茱萸提取物浓度为3.125μg/ml，山茱萸提取物浓度为3.125μg/ml，蜀椒提取物浓度为6.25μg/ml，生姜提取物浓度为6.25μg/ml)，作用于TPOAb损伤 Nthy-ori3-1细胞模型。检测各单味药提取物和温补脾肾方作用后的模型细胞凋亡率和细胞T4分泌情况。
细胞凋亡率检测具体操作如下：
取对数生长期Nthy-ori3-1细胞1-5×106个，进行CFSE染色后接种至24 孔板，5×104cells/孔，于细胞培养箱中培养24h进行模型的建立，分别设置空白组、模型组及模型加药组。空白组加入不含血清RPMI 1640培养液500μl/ 孔，模型组加入10ng/ml TPOAb+不含血清RPMI 1640培养液500μl/孔，模型加药组分别加入10ng/ml TPOAb+各单味药提取物/温补脾肾方工作液+不含血清RPMI 1640培养液500μl/孔。
加样后放置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱孵育2小时后，空白组加入不含血清RPMI 1640培养基500μl/孔，模型组和模型加药组加入 HL-60细胞悬液500μl/孔，使最终效靶比为12：1，离心机1000rpm离心3min 使效应细胞与靶细胞充分接触，转至细胞培养箱中继续培养。作用24h后收集各孔悬浮细胞至各对应15ml离心管，PBS洗涤各孔两次后，加入不含 EDTA的胰酶消化液消化靶细胞并收集至各对应离心管，预冷PBS离心清洗两次，500μl PBS重悬，各管加10μl PI室温避光染色10min，30min内上机检测。FlowJo软件进行结果分析，计算CFSE+细胞中PI+细胞的比率，结果如表5所示。
表5各单味药提取物和温补脾肾方作用后的模型细胞凋亡率
Figure BDA0003746057680000141
Figure BDA0003746057680000151
从表5可以看出，各模型加药组中的PI+细胞比率明显少于模型组。这表明各模型加药组中细胞存活率高于模型组，药物作用后细胞损伤凋亡率降低，药物对细胞模型的保护作用可能与抑制细胞凋亡相关。其中，温补脾肾方对细胞模型的保护作用以及抑制细胞凋亡的效果显著优于单味药。
T4分泌情况检测具体操作如下：
取对数生长期Nthy-ori3-1细胞1-5×106个，进行CFSE染色后接种至24 孔板，5×104cells/孔，于细胞培养箱中培养24h进行模型的建立，分别设置空白组、模型组及模型加药组。空白组加入不含血清RPMI 1640培养液500μl/ 孔，模型组加入10ng/ml TPOAb+不含血清RPMI 1640培养液500μl/孔，模型加药组分别加入10ng/ml TPOAb+各单味药提取物/温补脾肾方工作液+不含血清RPMI 1640培养液500μl/孔。
加样后放置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱孵育2小时后，空白组加入不含血清RPMI 1640培养基500μl/孔，模型组和模型加药组加入 HL-60细胞悬液500μl/孔，使最终效靶比为12：1，离心机1000rpm离心3min 使效应细胞与靶细胞充分接触，转至细胞培养箱中继续培养。作用24h后收集细胞上清至无菌15ml离心管，2000rpm离心20min后取上清分装至无菌 1.5ml EP管。检测所用试剂的配制均按ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作要求进行，实验前将试剂盒在室温下平衡半个小时，实验所需洗涤液、生物素抗原工作液、亲和素-HRP工作液均按照要求进行稀释配制。取出酶标包被板，空白孔不加样品，零孔加入标准品稀释液50μl/孔，标准品孔加入配制好的各浓度标准品50ul/孔，样品孔加入各样品50μl/孔，每组设3个复孔，封板膜封板置细胞培养箱孵育30min后，洗涤液300ul/孔洗板 5次，洗板后除空白孔外各加入亲和素-HRP工作液50μl/孔，同样孵育30min 后同前一步洗涤5次，完成后依次加入显色剂A、B各50μl/孔，轻轻震动混匀后，37℃避光显色10min。最后加入终止液50μl/孔，10min内酶标仪450 波长下检测各孔吸光度(OD值)。测量结果使用ELISAcalc软件中logistic 曲线(四参数)进行分析计算，结果如表6所示。
表6各单味药提取物和温补脾肾方作用后的细胞T4分泌情况
组别 T4含量(ng/ml)
空白组 1.88±0.12
模型组 0.78±0.16
吴茱萸提取物组 1.49±0.08
山茱萸提取物组 1.56±0.33
蜀椒提取物组 1.26±0.18
生姜提取物组 1.18±0.32
温补脾肾方 1.69±0.25
从表6可以看出，温补脾肾方及4味单味药作用后细胞模型分泌T4含量均有升高，其中，温补脾肾方对TPOAb损伤甲状腺滤泡细胞模型T4分泌含量的影响显著高于单味药提取物。
临床案例
选择实施例1制备的单味药提取物，按照实施例3表3最佳作用浓度(吴茱萸提取物3.125μg/ml、山茱萸提取物3.125μg/ml、蜀椒提取物6.25μg/ml、生姜提取物6.25μg/ml)配制温补脾肾方进行临床试验，配制过程与实施例4 相同。具体临床试验过程如下：
1.临床资料
观察病例：2020年12月-2021年12月河南中医学药大学第三附属医院收治的甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎患者72例。
诊断标准：依据中华医学会内分泌学分会编制的《中国甲状腺疾病诊治指南》中提出的桥本甲状腺炎的诊断标准：凡是弥漫性甲状腺肿大，质地较韧，特别是伴峡部锥体叶肿大，不论甲状腺功能是否改变，血清TPOAb和 TgAb阳性，诊断即可成立，包括经甲状腺细针穿刺吸取细胞学检查(FNAC) 诊断者。
病例纳入标准：符合桥本甲状腺炎西医诊断标准；年龄在18-70岁；病程6个月～1年；甲状腺功能检查显示甲功减退；近期无严重感染及严重并发症者。
病例排除标准：不符合纳入标准者；伴有甲状腺恶性肿瘤者；合并严重感染及有严重心、脑、肝、肾功能损害者；有精神和心理方面异常者；患者不能合作或不能坚持治疗者。
采用随机数字表法将患者分为对照组和治疗组各36例，其中治疗组男6 例，女30例，平均年龄47.63±8.36岁，对照组男5例，女31例，年龄43.96±12.28 岁。两组在性别、年龄等一般资料方面比较差异无统计学意义﹙P>0.05﹚，具有可比性。
1.1治疗方案
对照组：口服左旋甲状腺素钠片(L-T4，默克雪兰诺公司生产)治疗。每日清晨服用1次。
治疗组：在对照组基础上，采用本发明的温补脾肾方进行治疗，每日2 次，每次150mL。4周为1个疗程，共观察3个疗程，所有病例均于治疗前后填写临床观察表，疗程结束3个月后进行随访。两组在治疗期间均不服用其他药物。
1.2观察指标
1.2.1疗效性观察
(1)中医证候积分评定：所有患者治疗前后进行中医证候积分评定。
(2)甲状腺激素水平测定：所有患者治疗前、治疗后各检测一次FT4、 FT3、TSH；
(3)甲状腺自身抗体水平测定：所有患者治疗前、治疗后各检测一次 TPOAb、TGAb。
1.2.2安全性观测
(1)一般体格检查：生命体征检查(血压、心率、呼吸、体温)等。
(2)三大常规(血常规、尿常规、大便常规)、肝功、肾功、心电图等治疗前后各做1次。
(3)不良反应：观察本药有无不良反应及毒副作用。
1.3疗效评价
根据国家中医药管理局《中医病证诊断疗效标准》和《中药新药临床研究指导原则(试行)》中有关标准评价疗效。
①治愈：中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少>95％，甲状腺体积正常，结节消失，甲状腺功能恢复正常，TPOAb、TGAb转阴。
②显效：中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少>70％，甲状腺体积缩小，质地变软，结节变软明显变小，甲状腺功能明显改善，TPOAb、 TGAb滴度下降大于或等于50％。
③有效：中医临床症状、体征均有好转,证候积分减少>30％。甲状腺体积缩小，质地变软，结节变软，甲状腺功能改善，TPOAb、TGAb滴度下降大于或等于20％，但小50％。
④无效：中医临床症状、体征均无明显改善，甚或病情加重,证候积分减少不足30％。
注：中医证候积分计算公式(尼莫地平法)：[(治疗前积分-治疗后积分) ÷治疗前积分]×100％。
1.4统计分析
统计分析釆用SPSS22.0统计软件进行分析。计数资料性别釆用X2检验，有序分类的计量资料疗效釆用秩和检验。正态性计量资料釆用t检验，不符合正态分布的计量资料采用非参数检验。P<0.05为具有显著性差异，P<0.01 为具有极显著性差异，P>0.05为无差异。
2.试验结果
2.1治疗前中医证候积分比较
表8对照组与治疗组患者治疗前中医证候积分比较
Figure BDA0003746057680000181
(注：对照组与治疗组患者的证候积分经t检验，P>0.05)
从表8可以看出，对照组与治疗组患者中医证候积分在治疗前无明显差异，具有可比性。
2.2治疗前甲状腺激素水平及抗体水平比较
表9对照组与治疗组患者治疗前甲状腺激素水平及抗体水平比较
Figure BDA0003746057680000182
Figure BDA0003746057680000183
Figure BDA0003746057680000191
(注：对照组与治疗组患者治疗前的FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb 分别经t检验，P值均>0.05)
从表9可以看出，对照组与治疗组患者治疗前的甲状腺功能水平及抗体水平无明显差异，具有可比性。
2.3治疗后中医证候积分的疗效观察
表10对照组与治疗组患者治疗前后中医证候积分变化情况
Figure BDA0003746057680000192
组别 治疗前 治疗后
对照组 18.66±2.92 13.84±2.82<sup>▲</sup>
治疗组 17.13±3.52 5.96±2.24<sup>▲★</sup>
(注：▲对照组和治疗组治疗后与治疗前比较，均P<0.05，有统计学意义；★治疗后，治疗组与对照组组间比较P<0.05，有统计学意义)
从表10可以看出，对照组与治疗组的中医证候积分在治疗后均有下降，而治疗组的积分下降程度大，且治疗后治疗组与对照组组间比较有统计学差异，说明治疗组在改善中医证候评分方面优于对照组。
2.4治疗后甲状腺激素水平及抗体水平的疗效观察
表11治疗后甲状腺甲状腺激素水平及抗体水平的疗效观察
Figure BDA0003746057680000193
Figure BDA0003746057680000194
Figure BDA0003746057680000201
(注：△治疗后自身比较均为P>0.05，无统计学意义；▲治疗后自身比较均为P<0.05，有统计学意义；★治疗后组间比较P<0.05，有统计学意义)
从表11可以看出，治疗后对照组与治疗组的TSH水平均有较为明显下降，但治疗组下降趋势更明显，与对照组治疗后比较有统计学差异；对照组 TPOAb治疗后与与治疗前比较无统计学差异、TGAb治疗后与与治疗前比较有统计学差异，治疗组治疗后TPOAb和TGAb抗体水平与治疗前相比均有统计学差异，且治疗组治疗后与对照组治疗后比较也有统计学差异，说明由吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜4味中药组成的温补脾肾方联合L-T4治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的疗效优于单纯L-T4治疗。
2.5治疗后临床疗效评定
表12临床疗效评定
Figure BDA0003746057680000202
(注：治疗后临床疗效评定经秩和检验，P<0.05，有显著差异)
由表12可得出，在临床疗效方面，对照组及治疗组经过治疗后均有疗效，但是治疗组的有效率高于对照组，即由吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜4 味中药组成的温补脾肾方联合L-T4治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的疗效优于单纯L-T4治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的温补脾肾方，其特征在于，包括如下浓度份的组分：吴茱萸提取物2～5μg/ml、山茱萸提取物2～5μg/ml、蜀椒提取物4～10μg/ml、生姜提取物4～10μg/ml。
2.一种权利要求1所述的温补脾肾方的制备方法，其特征在于，包括水提法和醇提法；
所述水提法包括如下步骤：
(1)取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加水浸泡，煎煮，得到单味药的煎出液；
(2)将所述煎出液分别浓缩，固液分离，取滤液微滤后，得到单味药的提取物；
(3)将所述单味药的提取物按所述浓度份混合，得到温补脾肾方；
所述醇提法包括如下步骤：
(1)取吴茱萸、山茱萸、蜀椒、生姜分别加乙醇溶液浸泡，过滤，得到单味药的药液；
(2)将所述药液分别蒸发，干燥，得到单味药的提取物；
(3)将所述单味药的提取物按所述的浓度份混合，得到温补脾肾方。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水提法的步骤(1)中所述水的添加量为单味药重量的10～15倍；所述浸泡的时间为0.5～2h；所述煎煮为以武火煮沸再以文火煎煮的方式进行，所述煎煮的温度为95～105℃，所述煎煮的时间为40～80min。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述水提法的步骤(2)中所述浓缩后的煎出液体积为所述水的添加量的1/9～1/6；所述固液分离为先用六层医用纱布过滤，取滤液再离心；所述离心的转速为2000～4000rpm/min，所述离心的时间为20～40min；所述微滤采用0.2～0.3μm的滤膜过滤。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述醇提法的步骤(1)中所述乙醇溶液的体积浓度为90～98％，所述乙醇溶液的添加量为单味药重量的10～15倍；所述浸泡的时间为6～8天；所述过滤采用负压过滤，所述负压过滤的压力为-0.06～-0.05MPa。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述醇提法的步骤(2)中所述蒸发采用先旋蒸，再水浴蒸发的方式进行；所述旋蒸的温度为50～60℃，所述旋蒸的压力为-0.095～-0.09MPa；所述旋蒸的转速为90～120转/分；所述旋蒸后的药液体积为所述乙醇溶液添加量的1/30～1/10；所述水浴蒸发的温度为50～60℃，所述水浴蒸发的时间为1～2天。
7.如权利要求2～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述醇提法的步骤(2)中所述干燥为真空干燥，所述真空干燥的温度为50～60℃，所述真空干燥的真空度为-0.12～-0.06MPa，所述真空干燥的时间为36～48h。
8.一种权利要求1所述的温补脾肾方或所述温补脾肾方中单味药的提取物在制备治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的药物中的应用。
9.一种权利要求2～7任一项所述的制备方法得到的温补脾肾方或所述单味药的提取物在制备治疗甲状腺功能减退型桥本甲状腺炎的药物中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述单味药为吴茱萸或蜀椒。
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