CN106963825B - 一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106963825B
CN106963825B CN201710217716.0A CN201710217716A CN106963825B CN 106963825 B CN106963825 B CN 106963825B CN 201710217716 A CN201710217716 A CN 201710217716A CN 106963825 B CN106963825 B CN 106963825B
Authority
CN
China
Prior art keywords
parts
root
preparation
composition
borneol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710217716.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106963825A (zh
Inventor
黄淑芬
张琼
张茂平
胡琼丹
李小军
赵长英
曾炎
陈定国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine TCM of Southwest Medical University
Original Assignee
Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine TCM of Southwest Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine TCM of Southwest Medical University filed Critical Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine TCM of Southwest Medical University
Priority to CN201710217716.0A priority Critical patent/CN106963825B/zh
Publication of CN106963825A publication Critical patent/CN106963825A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106963825B publication Critical patent/CN106963825B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
    • A61K36/716—Clematis (leather flower)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A61K35/646—Arachnids, e.g. spiders, scorpions, ticks or mites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A61K35/648—Myriapods, e.g. centipedes or millipedes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/26—Aristolochiaceae (Birthwort family), e.g. heartleaf
    • A61K36/268—Asarum (wild ginger)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A61K36/481—Astragalus (milkvetch)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/59—Menispermaceae (Moonseed family), e.g. hyperbaena or coralbead
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/65—Paeoniaceae (Peony family), e.g. Chinese peony
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/66—Papaveraceae (Poppy family), e.g. bloodroot
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/71—Ranunculaceae (Buttercup family), e.g. larkspur, hepatica, hydrastis, columbine or goldenseal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物，它是由包含下述重量配比的原料药制备而成：威灵仙480‑720份、白芍480‑720份、防己480‑720份、黄芪320‑480份、延胡索160‑240份、全蝎42‑78份、蜈蚣2‑4份、细辛56‑104份、冰片21‑39份。本发明还提供了该组合物的制备方法和用途。本发明提供的组合物，配伍合理，具有祛风通络止痛，益气养血活血的效果，改善骨关节退变的效果显著，可以有效的延缓、控制膝关节骨性关节炎，为临床提供了一种新的药物选择。

Description

一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种用于治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
膝关节骨性关节炎(KOA)是一种多发于中老年人的慢性、进行性骨关节病，随着社会人口的老龄化，其发病率呈上升趋势，在世界范围内居于老年病首位。KOA特征性的改变是进行性的软骨退变，病变发展至晚期最终将导致关节功能丧失，严重影响患者的健康及生活质量。
由于KOA始发和主要的病变部位在软骨，人们可以推知的是，软骨细胞的病变会对KOA产生重要影响，延缓关节软骨退变对于预防和治疗骨关节疾病具有重要意义。
目前临床上治疗KOA的药物，疗效仍不够理想，急需新的疗效显著的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物，它是由包含下述重量配比的原料药制备而成：
威灵仙480-720份、白芍480-720份、防己480-720份、黄芪320-480份、延胡索160-240份、全蝎42-78份、蜈蚣2-4份、细辛56-104份、冰片21-39份。
进一步地，它是由下述重量配比的原料制备而成：
威灵仙600份、白芍600份、防己600份、黄芪400份、延胡索200份、全蝎60份、蜈蚣3份、细辛80份、冰片30份。
其中，它是由威灵仙、白芍、防己、黄芪、延胡索、全蝎、蜈蚣、细辛、冰片的原生粉或水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学或保健品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
其中，所述制剂为口服制剂。
其中，所述口服制剂为胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂、片剂、膏剂、散剂。
本发明还提供了上述组合物的制备方法，它包括如下步骤：
a、称取各重量配比的原料；
b、将全蝎、蜈蚣、防己、延胡索加乙醇浸泡，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成流浸膏，备用；同时收集滤渣；
c、取步骤b的滤渣，加入威灵仙、白芍、黄芪、细辛，加水浸泡，煎煮二次，合并煎液，滤过，减压浓缩至相对密度为1.20～1.25(80℃)的清膏，备用；
d、合并步骤b的流浸膏和步骤c的清膏，烘干，加入冰片，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
本发明还提供了上述组合物在制备治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物中的用途。
其中，所述骨关节疾病是指骨关节退变。
其中，所述骨关节疾病是指膝关节骨性关节炎。
本发明提供的组合物，配伍合理，具有祛风通络止痛，益气养血活血的效果，可用于头、胸胁、腰脊、四肢关节疼痛及外伤、术后引起的疼痛、肢体麻木、震颤等；本发明组合物改善骨关节退变的效果显著，可以有效的延缓、控制膝关节骨性关节炎，为临床提供了一种新的药物选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为正常细胞图，圆钝、完整、密集(×50)。
图2为退变细胞图，多角形并有衰老、死亡细胞(×50)。
图3为24h各组中各浓度之间OD值情况图。
图4为48h各组中各浓度之间OD值情况图。
图5为72h各组中各浓度之间OD值情况图。
图6为本发明药物组的II型胶原免疫组化染色图，细胞强阳性着色(免疫组化×200)。
图7为本发明药物组的II型胶原免疫组化染色图，胞质、胞膜呈棕黄色(免疫组化×400)。
图8为氨糖美辛组的II型胶原免疫组化染色图，细胞为阳性着色(免疫组化×200)。
图9为氨糖美辛组的II型胶原免疫组化染色图，胞质、胞膜呈黄色(免疫组化×400)。
图10为生理盐水组的II型胶原免疫组化染色图，细胞为弱阳性着色(免疫组化×200)。
图11为生理盐水组的II型胶原免疫组化染色图，胞质、胞膜呈淡黄色(免疫组化×400)。
图12为本发明药物组的MMP-13免疫组化染色图，细胞为弱阳性(免疫组化×200)。
图13为本发明药物组的MMP-13免疫组化染色图，细胞核呈淡黄色(免疫组化×400)。
图14为氨糖美辛组的MMP-13免疫组化染色图，细胞为阳性着色(免疫组化×200)。
图15为氨糖美辛组的MMP-13免疫组化染色图，细胞核呈黄色(免疫组化×400)。
图16为生理盐水组的MMP-13免疫组化染色图，细胞为强阳性着色(免疫组化×200)。
图17为生理盐水组的MMP-13免疫组化染色图，细胞核呈棕黄色(免疫组化×400)。
具体实施方式
下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1 本发明组合物的制备
处方：威灵仙600g、白芍600g、防己600g、黄芪400g、延胡索200g、全蝎60g、蜈蚣3g、细辛80g、冰片30g。
制备工艺：
(1)按处方称取各原料药；
(2)将全蝎、蜈蚣、防己、延胡索4味药，用5倍量60％的乙醇浸泡7日，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成流浸膏，备用；
(3)取4味药的滤渣，加入威灵仙、白芍、黄芪、细辛，加7倍量水浸泡0.5小时，煎煮二次，每次1小时。合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.02～1.05(80℃)，静置12小时，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20～1.25(80℃)的清膏，备用；
(4)合并步骤(2)的流浸膏和步骤(3)的清膏，100℃烘干，加入冰片，粉碎成细粉，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即可。
性状：本品为硬胶囊，内容物为灰褐色的粉末；气微辛，味苦。
实施例2 本发明组合物的制备
处方：威灵仙480g、白芍480g、防己480g、黄芪320g、延胡索160g、全蝎78g、蜈蚣4g、细辛104g、冰片39g。
制备工艺：同实施例1的制备工艺。
实施例3 本发明组合物的制备
处方：威灵仙720g、白芍720g、防己720g、黄芪480g、延胡索240g、全蝎42g、蜈蚣2g、细辛56g、冰片21g。
制备工艺：同实施例1的制备工艺。
实施例4 本发明组合物的制备
处方：同实施例1的处方。
制备工艺：按处方称取各原料药，粉碎，过筛，混合均匀，分装，即得。
以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：
试验例中，我们选用H2O2诱导退变成功的C518大鼠膝关节软骨细胞株，而不直接选择KOA患者的膝关节软骨细胞，除了所获取的人退变软骨组织有不同程度的病变、无法很好地保证细胞的单一性等因素外，主要是考虑到临床上KOA患者有一定时间的用药史，软骨中可能已含有不明药物成分，这对实验结果的准确性会产生重大影响。
因此，我们选用细胞活性、纯度都比较高的C518大鼠膝关节软骨细胞株，同时，在制备含药血清时，我们也选用大鼠作为血清采集对象，这样，在给细胞株加入含药大鼠血清干预时，尽可能地减少了细胞对异种血清的排斥性，降低了细胞的死亡率，有利于实验的顺利进行。
具体试验例如下：
试验例1 本发明组合物用于膝关节退变软骨细胞增殖的实验
一、实验材料及仪器
1、实验对象
C518大鼠膝关节软骨细胞株由上海中医药大学脊柱病研究所提供。SD大鼠由昆明医科大学动物实验中心提供。
2、药品及试剂
本发明药物：实施例1制备的药物组合物；阳性药氨糖美辛肠溶片：由泸州医学院附属中医医院药剂科提供。青-链霉素、0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购于Giblo公司。
3、仪器
SHELLAB细胞培养箱、Thermo超净工作台、LEICA倒置显微镜、Thermo离心机、美国Bio-Tek全自动酶标仪。
二、实验方法
1.含药血清制备方法：将15只SD大鼠随机分为本发明药物组、氨糖美辛组和生理盐水组，每组5只，本发明药物组SD大鼠以本发明药物组合物灌胃，氨糖美辛组SD大鼠以氨糖美辛肠溶片溶于同体积蒸馏水灌胃，生理盐水组SD大鼠以生理盐水灌胃。用量和浓度按大鼠与人用药量比进行换算(MeehRubner公式)，连续3d，末次灌胃2h后麻醉状态下腹主动脉采血，4℃静置过夜后离心，取血清56℃灭活30min，过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。
2.正常细胞复苏、培养：将C518大鼠膝关节软骨细胞株冻存管在37℃水浴箱中融化。将复苏的细胞移至15ml离心管中，1 000r/min，离心5min，弃除上清液，再加入含1％青-链霉素和10％FBS的DMEM培养基摇匀装入培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。每3d更换1次培养液，同时观察细胞贴壁、繁殖情况。
3.诱导细胞退变：用含500μl H2O2的培养基DMEM培养正常细胞3～5d，同时通过显微镜观察细胞形态，确认诱导的细胞已经退变成功。
4.MTT实验：将H2O2诱导退变成功的细胞以每孔1.0×105cell/ml细胞种植于3个96孔培养板中，继续用无血清培养基培养24h，分为3组：本发明药物组[含本发明药物含药血清(2.5％、5％和10％)的培养基]、氨糖美辛组[含氨糖美辛含药血清(2.5％、5％和10％)的培养基]、生理盐水组[含生理盐水含药血清(2.5％、5％和10％)的培养基]，每组中每个浓度培养4孔，每组12孔，1个96孔板培养36个孔，继续培养，分别在24h、48h和72h后，分别每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。终止培养，吸去培养液，每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在全自动酶标仪波长为490nm处测量各孔的吸光值。
三、统计学分析
用SPSS 17.0软件处理数据，MTT结果为计量资料，属正态分布，方差齐，用多组间均数两两比较的方差分析(LSD检验)，双侧α＝0.05为统计学检验水准。
四、实验结果
1.细胞退变结果：见图1-2。其中，正常软骨细胞复苏后置于培养瓶中培养时，可见细胞基本呈圆形漂浮状，分布均匀，无聚集成团现象，细胞膜完整、光滑，具有折光性(图1)。诱导退变后的退变软骨细胞呈散在分布，繁殖缓慢，分布稀疏，出现衰老、死亡细胞，呈圆形、透亮、白泡样。细胞呈长梭形或多角形，细胞质可向外突出，突出随退变程度加重而逐渐伸长，可出现聚集成团样(图2)。
可见，诱导的细胞已经退变成功。
2、MTT增殖结果
见表1、图3～5。
表1 三组药物对C518大鼠膝关节退变软骨细胞增殖的影响(MTT值，
Figure BDA0001262766090000061
)
Figure BDA0001262766090000062
注：在同一时间点的不同浓度中，各组之间都有统计学差异(P＜0.01)。在同一时间点的灵仙通络胶囊、氨糖美辛组中，各浓度之间都有统计学差异(P＜0.01)。在生理盐水组中，各浓度之间都无统计学差异(P＞0.05)
由表1、图3～5可见，生理盐水组的三个浓度间都无统计学差异(P＞0.05)，这证实了生理盐水对细胞并无增殖效应，起到了空白对照组的作用。
在同一时间点上，三个浓度(2.5％、5％、10％浓度)下，氨糖美辛组较生理盐水组MTT都有统计学差异(P＜0.01)，阳性药促进细胞增殖的效果明显；而本发明药物组较氨糖美辛组、生理盐水组都有统计学差异(P＜0.01)，说明本发明药物促进细胞增殖的效果更好，显著高于阳性药氨糖美辛。
另外，在同一时间点上，本发明药物组、氨糖美辛组中，高浓度与低浓度(10％与5％浓度；5％与2.5％浓度)的效果均有统计学差异(P＜0.01)，说明各药物对C518大鼠膝关节退变软骨细胞的增殖有浓度作用。
因此，本发明组合物对C518大鼠膝关节退变软骨细胞有良好的促进增殖作用，从而治疗关节软骨退变，减轻膝关节骨性关节炎KOA，而且效果显著优于阳性药氨糖美辛。
试验例2 本发明组合物对C518大鼠膝关节退变软骨细胞II型胶原和MMP-13表达的影响
一、实验材料及仪器
1、实验对象
同试验例1。
2、药品及试剂
本发明药物：实施例1制备的药物组合物；阳性药氨糖美辛肠溶片：由泸州医学院附属中医医院药剂科提供。青-链霉素、0.25％胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)均购于Giblo公司。Ⅱ型胶原、MMP-13的Ⅰ抗以及Ⅱ抗均购于美国Santa Cruz公司。
3、仪器
SHELLAB细胞培养箱、Thermo超净工作台、LEICA倒置显微镜。
二、实验方法
1.含药血清制备方法：将SD大鼠分为本发明药物组、氨糖美辛组和生理盐水组，本发明药物组SD大鼠以本发明药物组合物灌胃，氨糖美辛组SD大鼠以氨糖美辛肠溶片溶于同体积蒸馏水灌胃，生理盐水组SD大鼠以生理盐水灌胃。用量和浓度按大鼠与人用药量比进行换算(MeehRubner公式)，各组大鼠按1ml/100g体重灌胃，药物浓度为1g/ml。连续3d，末次灌胃2h后麻醉状态下腹主动脉采血，4℃静置过夜后离心，取血清56℃灭活30min，过滤除菌，分装，－20℃冰箱保存备用。
2.正常细胞培养：将C518大鼠膝关节软骨细胞加入含1％青-链霉素和10％FBS的DMEM培养基培养。每3d更换1次培养液，观察细胞瓶中培养液的颜色变化以及细胞贴壁、繁殖情况。当细胞铺满细胞瓶底时，进行传代。
3.诱导细胞退变：将正常细胞先用含1％青-链霉素和10％FBS的DMEM培养液培养6h，然后再用含500μl H2O2的培养基DMEM培养3～5d，同时通过显微镜观察细胞形态，确认诱导的细胞已经退变成功。
4.药物干预后的退变软骨细胞免疫组化染色：将清洁盖玻片放置于6孔板内，将H2O2诱导退变成功的软骨细胞以每孔1.0×105cell/ml细胞分别种植于培养板内的盖玻片上，6h后等细胞贴壁后再用含3组浓度为10％含药血清的培养基同时培养细胞72h，然后分别用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗盖玻片，加入4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗3次。85％、95％、100％乙醇依次梯度脱水，PBS冲洗，0.3％H2O2浸泡20min，PBS洗涤细胞3次，封闭液37℃封闭20min，吸去封闭液，根据染色的不同分别滴加Ⅰ抗(Ⅱ型胶原、MMP-13)(1∶100稀释)，4℃冰箱内放置过夜。第二天用PBS冲洗，滴加Ⅱ抗37℃孵育30min，PBS冲洗，滴加抗生蛋白链菌素10min，PBS冲洗，显色液显色，在显微镜下观察，待其显色，PBS冲洗终止反应。滴加苏木素1min，双蒸水冲洗，盐酸乙醇分化，95％、100％乙醇依次梯度脱水，树胶封片后放置在倒置显微镜下观察，并用图像分析系统采片。
5.免疫组化结果统计：每张切片随机在倒置显微镜下取5个高倍视野(×400)观察，记录每张切片的染色程度以及染色范围。其中，染色程度分为弱(+)、中(++)、强(+++)3个等级。染色范围分为染色范围占视野＜1/4(+)、1/4～2/4(++)、2/4～3/4(+++)、＞3/4(++++)。然后将染色程度和染色范围换算成染色指数，染色指数＝染色程度×染色范围，其中，将+、++、+++、++++分别按1、2、3、4分计算。
三、统计学分析
用SPSS 17.0软件统计处理数据，免疫组化染色结果为等级资料，不属正态分布，方差不齐，用非参数检验中的多个独立样本比较的Kruskal-Wallis检验，双侧α＝0.05为显著性检验水准。
四、实验结果
II型胶原免疫组化染色的结果：见表2、图6-11。
表2 II型胶原免疫组化染色的Kruskal-Wallis检验
Figure BDA0001262766090000081
可知，在II型胶原免疫组化染色中，阳性药氨糖美辛组较生理盐水组有显著性差异(P＜0.01)，而本发明药物组较氨糖美辛组、生理盐水组均有显著性差异(P＜0.01)。
说明本发明组合物药物具有良好的上调软骨细胞II型胶原表达水平的效果，并且效果显著优于氨糖美辛(染色指数χ2为17.33，df为2，P＜0.01)。
MMP-13免疫组化染色的结果：见表3、图12-17。
表3 MMP-13免疫组化染色的Kruskal-Wallis检验
Figure BDA0001262766090000082
可知，在MMP-13免疫组化染色中，阳性药氨糖美辛组较生理盐水组有显著性差异(P＜0.01)，而本发明药物组较氨糖美辛组、生理盐水组均有显著性差异(P＜0.01)。
说明本发明组合物药物具有良好的下调软骨细胞MMP-13表达水平的效果，并且效果显著优于氨糖美辛(染色指数χ2为55.04，df为2，P＜0.01)。
Ⅱ型胶原和MMP-13的表达水平是软骨细胞退变的代谢标志物，其中，Ⅱ型胶原是正常关节软骨的主要胶原，它的存在能够维持关节软骨正常的组织形态，Ⅱ型胶原的减少使组织易患KOA。MMP-13(基质金属蛋白酶-13)是由关节软骨细胞产生的，裂解Ⅱ型胶原作用最强的酶，在KOA关节软骨中高表达。
本实验中，在退变的C518大鼠膝关节软骨细胞中，Ⅱ型胶原呈现低表达，而MMP-13呈现高表达。而本发明药物具有调节C518大鼠膝关节退变软骨细胞中Ⅱ型胶原、MMP-13表达水平的作用，从而减轻膝关节骨性关节炎，而且效果显著优于阳性药氨糖美辛。
综上所述，本发明组合物改善骨关节退变的效果显著，可以有效减轻膝关节骨性关节炎，为临床提供了一种新的药物选择。

Claims (7)

1.一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物，其特征在于：它是由威灵仙、白芍、防己、黄芪、延胡索、全蝎、蜈蚣、细辛、冰片的原生粉或水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂;
所述威灵仙、白芍、防己、黄芪、延胡索、全蝎、蜈蚣、细辛、冰片的配比为:
威灵仙 600 份、白芍 600 份、防己 600 份、黄芪 400 份、延胡索 200份、全蝎 60份、蜈蚣 3 份、细辛 80 份、冰片 30 份。
2. 根据权利要求 1 所述的组合物，其特征在于：所述制剂为口服制剂。
3. 根据权利要求 2 所述的组合物，其特征在于：所述口服制剂为胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂、片剂、膏剂、散剂。
4. 权利要求 1-3 任意一项所述的组合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、称取各重量配比的原料；
b、将全蝎、蜈蚣、防己、延胡索加乙醇浸泡，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成流浸膏，备用；同时收集滤渣；
c、取步骤 b 的滤渣，加入威灵仙、白芍、黄芪、细辛， 加水浸泡，煎煮二次， 合并煎液，滤过，减压浓缩至80℃时相对密度为1.20～1.25的清膏，备用；
d、合并步骤 b 的流浸膏和步骤 c 的清膏， 烘干，加入冰片， 加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
5. 权利要求 1-3 任意一项所述的组合物在制备治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物中的用途。
6. 根据权利要求 5 所述的用途，其特征在于：所述骨关节疾病是指骨关节退变。
7. 根据权利要求 5 所述的用途，其特征在于：所述骨关节疾病是指膝关节骨性关节炎。
CN201710217716.0A 2017-04-05 2017-04-05 一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法 Active CN106963825B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710217716.0A CN106963825B (zh) 2017-04-05 2017-04-05 一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710217716.0A CN106963825B (zh) 2017-04-05 2017-04-05 一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106963825A CN106963825A (zh) 2017-07-21
CN106963825B true CN106963825B (zh) 2020-07-17

Family

ID=59336839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710217716.0A Active CN106963825B (zh) 2017-04-05 2017-04-05 一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106963825B (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
CN106963825A (zh) 2017-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109453212B (zh) 一种具有抗癌作用的毛诃子提取物及其有效部位制备方法
CN104873624B (zh) 一种用于痛风性关节炎的药物组合物
CN103222988A (zh) 一种美洲大蠊提取物及其制备方法和应用
CN115120689A (zh) 欣力康复方制剂在制备药物中的应用
CN109718273A (zh) 紫苏叶提取物在预防或治疗骨性关节炎中的应用
CN106963825B (zh) 一种治疗和/或辅助治疗骨关节疾病的药物组合物及其制备方法
CN101380359B (zh) 健骨胶囊及其制备方法
CN103845722A (zh) 一种防治辐射损伤或化学药物治疗损伤的低聚肽组合物及其制备方法
CN113713063B (zh) 一种抗肿瘤中药组合物及其制备方法和应用
CN110946948A (zh) 化风丹在制备抗乳腺癌药物中的应用
CN105233150A (zh) 一种中药组合物及其应用
CN102048890A (zh) 一种具有催乳作用的中药组合物及其制备方法
CN108653322A (zh) 一种具有预防肿瘤转移的功能性保健品的组合物
CN100482266C (zh) 一种由肿节风和白花蛇舌草制成的药物组合物
CN101168008B (zh) 一种具有抑制肿瘤作用的药物组合物及其制备方法和用途
CN113197948A (zh) 荆防制剂在制备预防或治疗甲状腺疾病药物中的用途
CN108452008A (zh) 一种包含叶下珠、云芝、丹参和紫草的中药组合物在制备抑制肝癌术后复发的药物中的应用
CN107260780B (zh) 一种治疗风湿性关节炎的中药组合物
CN110433226A (zh) 一种用于治疗痛风性关节炎或高尿酸血症的中药组合物和制剂及其制备方法和应用
CN103845524B (zh) 一种治疗肿瘤放疗、化疗后肾精不足证的中药组合物及制备方法和用途
TW201819623A (zh) 用於降低膽紅素位準之組成物及方法
CN105708845B (zh) 一种苯丙素类化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用
CN116270787B (zh) 一种中西复方药物在制备治疗白血病药物中的应用
CN115708840B (zh) 神香草提取物在制备抗肺癌药物中的应用
CN1421238A (zh) 一种具有抗肿瘤、抗自由基损伤和调节免疫的天然生物反应调节剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant