CN111920849B - 一种中药组合物及包含该中药组合物的中药制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药领域，具体涉及一种中药组合物及包含该中药组合物的中药制剂，所述中药组合物包括如下重量份的原料药：川芎20‑40份、青风藤20‑40份、羌活10‑30份、白芷10‑35份、苏木5‑25份、艾叶10‑30份、当归5‑20份、红花5‑20份、乳香5‑20份、没药5‑20份、细辛5‑20份、川断5‑25份、骨碎补5‑25份、伸筋草5‑25份、透骨草5‑25份、牛膝5‑25份，诸药合用，共奏舒筋活血、活络止痛之功效，对于骨关节疾病疗效显著。本发明还提供了该中药组合物的制备工艺，具有质控标准、定量明确、成品轻便、易包装和运输等优点，在提高药物疗效的同时能显著降低药物的不良反应。

Description

一种中药组合物及包含该中药组合物的中药制剂

技术领域

本发明涉及中药领域，具体涉及一种中药组合物及包含该中药组合物的中药制剂。

背景技术

骨关节疾病包括骨性关节炎、外伤性关节炎、滑膜炎、滑囊炎、颈椎病、腰椎病、肩周炎和骨质增生等，流行病学调查显示，骨关节疾病以高患病率、高致残率影响着数以亿计的老年人，并有逐渐向年轻群体转变的趋势，尤其是面对日益老龄化的社会环境和伴随社会进步日益严重的不良生活习惯、不正确或过度的运动损伤以及随年龄增长关节软骨难以避免的退化和磨损，使骨关节疾病的患者群体不断扩大，给人类的生活质量和国民经济发展带来巨大的经济负担，是最亟待解决的医疗和社会问题之一。各类骨关节疾病的发生发展往往归因于滑膜病变和软骨变性受损，其中，位于关节囊内层的滑膜组织连同其分泌的滑液，在参与诱发和进行性加重软骨细胞损伤中发挥着重要作用(参见文献Ma J,Niu D S,Wan N J,et al.Elevated chemerin levels in synovial fluid and synovialmembrane from patients with knee osteoarthritis.[J].International Journal ofClinical& Experimental Pathology,2015,8(10):13393.)。过度增殖的滑膜细胞启动一系列免疫反应和炎症反应，是导致软骨降解、关节退变和加速病情进展的重要环节，引发患者关节疼痛、肿胀、变形、功能障碍等多种症状，严重者导致关节残疾，影响患者生活质量。其中以骨关节炎(osteoarthritis，OA)最为典型，骨关节炎是一种由多种因素引起的以关节软骨和软骨下骨变性、滑膜炎症、骨赘形成等为主要特征的退行性骨关节病(参见文献Poulet B,Staines K A.New developments in osteoarthritis and cartilage biology[J]. Current Opinion in Pharmacology,2016,28:8-13.)。滑膜炎症在OA发病机制中占据重要地位(参见文献Zacher J.Importance of Inflammation in the Pathogenesis ofOsteoarthritis[J]. Der

2015,44(4):314-314.)。过度增殖的滑膜细胞作为OA中的基本病理变化参与生成和释放炎性细胞因子和基质金属蛋白酶，导致软骨的退变，进一步可侵蚀软骨下骨(参见文献Sr.F B.Osteoarthritis is an inflammatory disease[J].Osteoarthritis& Cartilage,2012,20(Suppl 1):S5.)。

目前临床上普遍使用的保守治疗手段治疗骨关节疾病，包括物理治疗配合常用的药物如镇痛剂、非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、选择性的环加氧酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)抑制剂、类固醇抗炎药、糖皮质激素的内治法和注射法等。然而，保守治疗只能对OA的某些临床症状起到暂时的、有限的缓解，既不能达到满意的治疗效果，也不能对损伤的关节软骨等组织行使修复与保护等功能。而且，口服药物的部分有效成分可能被胃肠道吸收，在尚未吸收进入血循环之前在肠粘膜和肝脏被部分代谢，使进入血循环的原形药量大量减少、药效降低。而且，长期使用这些药物还存在着一些潜在的安全隐患，如增加胃肠道反应、肝脏损伤、心血管疾病等副作用发生的风险。关节置换手术是对保守治疗疗效欠佳的重度骨关节疾病患者的最终选择，是公认有效的治疗方法之一，但不适用于轻、中度患者群，且不易被患者普遍接受，手术相关的一些严重的并发症如感染、深静脉血栓形成和后续使用中的假体松脱也是需要被考虑到的问题。

运用现代中医药理论治疗骨关节疾病因具有药效显著、简便易行、不良反应少等优点而日益受到广泛关注。中医药治疗可以采用局部给药和口服给药两种给药方式，其中，中医外治法能通过局部给药、经皮给药的方式促使药物直达患处，避免了口服制剂产生的胃肠道损伤等不良反应，同时也可避免肝脏首过效应对药物浓度和药效的影响，增强临床疗效。

为此，中国专利文献CN105079721A公开了一种治疗骨关节炎的中药组合物，由以下重量份数的各组分组成：丹皮5-50份、金银花5-50份、枸杞子5-50份、伸筋草5-50 份、手掌参5-50份、宽筋藤5-50份、辣根草5-50份、桑寄生5-50份、鸡血滕5-50份、忍冬藤5-50份、姜黄5-50份、芍药5-50份、水蛭5-50份、甘草5-50份、元胡5-50份、凤仙全草5-50份、透骨草5-50份、生地黄5-50份、小蓟5-50份、牛筋草5-50份、独活5-50份、补骨脂5-50份、川牛膝5-50份、杜仲5-50份、马钱子5-50份、威灵仙5-50 份、青风藤5-50份、党参5-50份、黄芪5-50份、走马箭5-50份，然而，上述中药组合物存在组成复杂、成本较高等缺点，从而限制了其应用。

因此，研究新型的治疗效果好、作用明确、药物利用度高、毒副作用小、组成简单、成本较低的具有预防或治疗骨关节疾病作用的药物及其制备工艺具有重要意义。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种治疗效果好、作用明确、药物利用度高、毒副作用小、组成简单、成本较低的具有预防或治疗骨关节疾病作用的中药组合物及其制备工艺，以及包含该中药组合物的中药制剂。

本发明提供了一种中药组合物，包括如下重量份的原料药：川芎20-40份、青风藤20-40份、羌活10-30份、白芷10-35份、苏木5-25份、艾叶10-30份、当归5-20份、红花5-20份、乳香5-20份、没药5-20份、细辛5-20份、川断5-25份、骨碎补5-25份、伸筋草5-25份、透骨草5-25份、牛膝5-25份。

进一步地，包括如下重量份的原料药：川芎30份、青风藤30份、羌活20份、白芷20份、苏木15份、艾叶20份、当归10份、红花10份、乳香10份、没药10份、细辛10份、川断15份、骨碎补15份、伸筋草15份、透骨草15份、牛膝15份；或者，

川芎40份、青风藤25份、羌活18份、白芷18份、苏木18份、艾叶25份、当归20份、红花20份、乳香12份、没药12份、细辛8份、川断15份、骨碎补12份、伸筋草12份、透骨草12份、牛膝20份；或者，

川芎20份、青风藤28份、羌活25份、白芷35份、苏木25份、艾叶10份、当归 10份、红花15份、乳香8份、没药8份、细辛12份、川断12份、骨碎补10份、伸筋草20份、透骨草20份、牛膝12份。

本发明还提供了一种上述任一所述的中药组合物的制备方法，按照选定的重量份数称取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、乳香、没药、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，混合后按常规提取方法提取或者分别按常规提取方法提取后混合，即得。

进一步地，所述常规提取方法包括浸渍提取、煎煮提取、回流提取、渗漉提取、超声提取和水蒸气蒸馏中的一种或几种；提取溶剂为水或体积百分数为20-95％的醇溶液；提取次数为1-3次；提取溶剂的体积与原料药重量的比值为1-5L：1kg；

在所述常规提取方法提取之后还包括对得到的提取物进行精制纯化处理的步骤；所述精制纯化处理包括水提醇沉、萃取、硅胶色谱柱分离和大孔树脂柱分离中的一种或几种；

在所述常规提取方法提取之前还包括将混合后的原料药进行粉碎或者将各原料药分别进行粉碎的步骤。

进一步地，所述制备方法，包括如下步骤：

(1)按照选定的重量份数称取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，加水，煎煮20-80min，过滤，得滤液和药渣；

(2)取步骤(1)得到的药渣，加水，煎煮5-30min，然后加入按照选定的重量份数称取的乳香和没药，继续煎煮5-20min，得药液；

(3)将步骤(1)制得的滤液与步骤(2)制得的药液合并，得水煎液。

进一步地，步骤(1)中，在煎煮之前还包括将原料药在水中浸泡的步骤，浸泡的时间为15-90min；

步骤(1)和/或步骤(2)中，加入水的体积与所述原料药重量的比值为1-5L：1kg；

步骤(2)中，按照选定的重量份数称取乳香和没药之后先用纱布包裹再进行煎煮；

步骤(3)中，制得水煎液之后还包括对水煎液进行浓缩得浸膏并将浸膏经干燥得冻干粉的步骤。

本发明还提供了一种中药制剂，包括任一所述的中药组合物或者任一所述的制备方法所制得的中药组合物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体；

所述中药制剂为凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂、喷剂、搽剂、酊剂、湿敷剂、糊剂或洗剂；

所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH 值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。

进一步地，还包括任选地一种或多种其他治疗骨关节疾病的药物，所述其他治疗骨关节疾病的药物选自对乙酰氨基酚、布诺芬、洛索洛芬钠、氟比洛芬巴布、双氯芬酸钠、塞来昔布、罗非昔布、美洛昔康、氯诺昔康、萘丁美酮、双醋瑞因、曲安奈德、倍他米松、甲泼尼龙、氢化可的松、曲马多、玻璃酸钠、氨基葡萄糖、硫酸软骨素、依托度酸、舒林酸、阿西美辛羟氯喹、依那西普、环磷酰胺、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环孢霉素A、来氟米特、英夫利昔单抗、阿那白滞素和阿达木单抗中的至少一种。

本发明还提供了任一所述的中药组合物、任一所述的制备方法制得的中药组合物，所述的中药制剂在制备预防或治疗骨关节疾病的药物中的应用；优选地，所述骨关节疾病包括但不限于骨性关节炎、外伤性关节炎、滑囊炎、滑膜炎、颈椎病、腰椎病、肩周炎和骨质增生。

本发明的中药组合物在使用时可配合超声波、离子、半导体以及热敷、熏洗、膏贴、按摩等外治手法增强药物的透皮吸收力。

本发明的中药组合物的给药途径以外用为主，可以但不限于口服和关节腔注射等给药途径。

本发明的中药组合物的水煎液或浸膏可用PBS溶液、生理盐水或者细胞培养液作为稀释液，稀释成目标浓度后可用于细胞实验或动物实验。例如，可用PBS溶液配制成供试储备液于-20℃保存备用。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的中药组合物，本发明发明人提出筋脉痹阻、血络瘀滞、不通则痛是骨关节炎的主要病机之一，同时根据辨证和辨病相结合的原则，结合现代药理学研究的成果，在辨证用药的基础上认为治疗骨关节病尤其是骨关节炎当以“舒筋活血、活络止痛”为要法，通过临床研究与基础研究反复优化复方中药物组成与含量，方中以血中之气药川芎和祛风湿、通经络的青风藤为君药；以舒筋活络的羌活、白芷、苏木，配合活血祛瘀、行气止痛的艾叶、当归、红花、乳香和没药共为臣药；以细辛、川断，配合骨碎补、伸筋草和透骨草为佐药，具有祛风除湿、温经散寒、消肿止痛之效；以牛膝为使药，其具有良好的引经作用，有补肝肾、强筋骨之功；全方组成严谨，配伍精湛，诸药合用，共奏舒筋活血、活络止痛之功效，对于骨性关节炎、外伤性关节炎、滑膜炎、滑囊炎、颈椎病、腰椎病、肩周炎和骨质增生等骨关节疾病，尤其是骨关节炎疗效显著。

2.本发明提供的中药组合物，经过细胞实验证明能够调控滑膜成纤维细胞(FLS)的增殖和凋亡、调节TLR2和TLR4介导的固有免疫反应、降低炎性介质NO、IL-6和 MMP3等的释放量、抑制滑膜细胞向软骨等周围组织的迁移和侵袭，从而达到减轻滑膜炎症反应、保护与修复关节软骨、延缓骨关节疾病进程等作用。

3.本发明提供的中药组合物的制备方法，遵循药性理论、配伍理论、治法理论等中医理论，既保持了传统中药煎煮方法中多味药、多组分配伍方式的交互性与中药复方的整体性；又能根据每味药物性味质地等特征，采用特殊的煎煮方法，如将含有挥发油等有效成分的药物后下和将粉末状质地的药物包煎等，并相应控制各步骤的煎煮时间，能够在极大程度上保持所有药物成分与含量的同时，还可有效防止药物中挥发油等有效药物成分的流失，更有利于特殊质地性味药物有效成分的析出，减轻药物毒性。此外，本发明煎煮等制备过程规范、统一，具有质控标准、定量明确、成品轻便、易包装、携带和运输等优点，冷冻干燥后所得的颗粒状固体也较传统汤剂更便于贮存和使用。

4.本发明提供的中药制剂，后续可以根据实际应用将本发明的中药组合物制备成各种剂型，可以为外用、注射，也可以内服，例如可以但不局限于凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂等各种剂型。其中，局部透皮给药的贴膏剂、软膏剂和凝胶剂更有利于药物的吸收利用，减轻个体差异和毒副作用，保证了药物的治疗效果和安全性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1分离培养的FLS细胞形态学观察图；其中图1-A为100倍倒置显微镜图，图1-B为400倍倒置显微镜图；

图2是本发明实验例1中差异浓度的SHC溶液对细胞存活率影响的结果对比图；

图3是本发明实验例1中差异浓度的SHC溶液对细胞抑制率影响的结果对比图；

图4是本发明实验例2中差异浓度的SHC溶液对FLS细胞凋亡的调控；其中A-B 为SHC高浓度组；C-D为SHC中浓度组；E-F为SHC低浓度组；G-H为空白组；

图5是本发明实验例3中差异浓度的SHC溶液对FLS细胞周期的影响结果对比图；其中A为SHC高浓度组；B为SHC中浓度组；C为SHC低浓度组；D为空白组；

图6是本发明实验例4中差异浓度的SHC溶液中TLR2和TLR4表达率的结果对比图；

图7是本发明实验例5中差异浓度的SHC溶液对NO释放量的影响结果对比图；

图8是本发明实验例5中差异浓度的SHC溶液对IL-6释放量的影响结果对比图；

图9是本发明实验例7中观察SHC溶液对FLS细胞迁移的影响示意图；其中，A-D 依次为SHC组中0h、24h、48h、72h的划痕区、E-H为空白组中0h、24h、48h、72h 的划痕区；

图10是本发明实验例7中不同时间段下SHC溶液对划痕宽度的影响结果对比图；

图11是本发明实验例7中不同时间段下SHC溶液对FLS细胞迁移率的影响结果对比图；

图12是本发明实验例8中SHC溶液对FLS细胞侵袭的影响示意图。其中A为空白组；B为空白组的对照组；C为实验组；D为实验组的对照组。

图13是本发明实验例9中差异浓度的SHC溶液对MMP3释放的影响结果对比图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

所有药材质检合格，符合《中华人民共和国药典》标准。

实施例1中药组合物

组成：川芎30g、青风藤30g、羌活20g、白芷20g、苏木15g、艾叶20g、当归10g、红花10g、乳香10g、没药10g、细辛10g、川断15g、骨碎补15g、伸筋草15g、透骨草 15g、牛膝15g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、乳香、没药、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，加水煎煮3次，第一次加500ml水，先浸泡1h，然后煎煮50min，第二次加水400ml，煎煮30min；第三次加水300ml，煎煮20min。三次得到的煎煮液均通过100目筛过滤，合并滤液，即得。

实施例2中药组合物

组成：川芎40g、青风藤25g、羌活18g、白芷18g、苏木18g、艾叶25g、当归20g、红花20g、乳香12g、没药12g、细辛8g、川断15g、骨碎补12g、伸筋草12g、透骨草 12g、牛膝20g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、乳香、没药、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，加水煎煮1次，加水800ml，先浸泡 80min，然后煎煮30min，通过60目筛过滤，合并滤液，即得。

实施例3中药组合物

组成：川芎30g、青风藤30g、羌活20g、白芷20g、苏木15g、艾叶20g、当归10g、红花10g、乳香10g、没药10g、细辛10g、川断15g、骨碎补15g、伸筋草15g、透骨草 15g、牛膝15g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，加入500ml的蒸馏水，浸泡15min，用中药煎煮锅煎煮80min，分离药液和药渣，再在药渣中继续加入300ml的蒸馏水，煎煮5min后，加入使用纱布包裹的乳香和没药，继续煎煮15min，滤出药液，将两次药液合并，即得。

实施例4中药组合物

配方：川芎20g、青风藤28g、羌活25g、白芷35g、苏木25g、艾叶10g、当归10g、红花15g、乳香8g、没药8g、细辛12g、川断12g、骨碎补10g、伸筋草20g、透骨草 20g、牛膝12g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、乳香、没药、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，加体积百分数为50％的乙醇水溶液超声提取两次，第一次加420ml乙醇水溶液，超声30min，第二次加390ml乙醇水溶液，超声20min。过滤，合并滤液，在温度为55℃下真空浓缩，得到55℃下相对密度为1.15 的浸膏，即得。

实施例5中药组合物

组成：川芎40g、青风藤25g、羌活18g、白芷18g、苏木18g、艾叶25g、当归20g、红花20g、乳香12g、没药12g、细辛8g、川断15g、骨碎补12g、伸筋草12g、透骨草 12g、牛膝20g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，分别粉粹后混合，得药粉；取上述药粉，加入体积百分数为50％的乙醇水溶液1000ml，浸渍提取3h，得浸提液，过滤，即得。

实施例6浸膏

组成：川芎30g、青风藤30g、羌活20g、白芷20g、苏木15g、艾叶20g、当归10g、红花10g、乳香10g、没药10g、细辛10g、川断15g、骨碎补15g、伸筋草15g、透骨草 15g、牛膝15g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝加入500ml的蒸馏水，浸泡60min，用中药煎煮锅煎煮40min，分离药液和药渣，再在药渣中继续加入300ml的蒸馏水，煎煮10min后，加入使用纱布包裹的乳香和没药，继续煎煮20min，滤出药液，将两次药液合并，静置过夜，取上清液浓缩至60℃相对密度为1.20的浸膏。

实施例7喷剂

配方：川芎35g、青风藤30g、羌活10g、白芷20g、苏木15g、艾叶10g、当归20g、红花15g、乳香10g、没药15g、细辛15g、川断25g、骨碎补20g、伸筋草20g、透骨草 5g、牛膝5g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、没药、乳香、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，加入适量的体积百分数为95％的乙醇水溶液300ml浸泡，浸泡90min，然后以300ml体积百分数为65％的乙醇水溶液为溶剂渗漉，渗漉2h，收集渗漉液；取上述渗漉液，过滤，浓缩，加入适量的保湿剂和蒸馏水，过滤，得到喷剂。

实施例8片剂

取实施例1-4任一组成的原料药，按实施例1-4任一制法制得中药组合物，加入常规辅料，经常规工艺制得片剂。

实施例9胶囊剂

取实施例1-4任一组成的原料药，按实施例1-4任一制法制得中药组合物，加入常规辅料，经常规工艺制得胶囊剂。

实施例9冻干粉

组成：川芎30g、青风藤30g、羌活20g、白芷20g、苏木15g、艾叶20g、当归10g、红花10g、乳香10g、没药10g、细辛10g、川断15g、骨碎补15g、伸筋草15g、透骨草 15g、牛膝15g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝加入500ml的蒸馏水，浸泡60min，用中药煎煮锅煎煮40min，分离药液和药渣，再在药渣中继续加入300ml的蒸馏水，煎煮10min后，加入使用两层纱布包裹的乳香和没药，继续煎煮10min，滤出药液，将两次药液合并，静置过夜，取上清液采用旋转蒸发仪浓缩至60℃下相对密度为1.05的浸膏，将浸膏在-70℃下冷冻干燥24h，得到冻干粉。

实施例10软膏剂

组成：川芎40g、青风藤25g、羌活18g、白芷18g、苏木18g、艾叶25g、当归20g、红花20g、乳香12g、没药12g、细辛8g、川断15g、骨碎补12g、伸筋草12g、透骨草 12g、牛膝20g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、没药、乳香、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，经体积分数为60％乙醇水溶液回流提取制备得到提取物，将上述提取物加入常规辅料，混匀，制成软膏剂。

实施例11口服液

组成：川芎40g、青风藤20g、羌活30g、白芷10g、苏木25g、艾叶10g、当归10g、红花5g、乳香5g、没药5g、细辛20g、川断25g、骨碎补5g、伸筋草5g、透骨草5g、牛膝5g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、没药、乳香、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，粉粹，煎煮两次，加水煎煮两次，第一次加1200ml水，浸泡0.5h，煎煮30min，第二次加900ml水，煎煮20min。煎煮液过 120目筛，过滤，滤液定容，分装，灭菌，得到口服液。

实施例12口服液

组成：川芎35g、青风藤40g、羌活10g、白芷20g、苏木10g、艾叶30g、当归10g、红花10g、乳香20g、没药20g、细辛5g、川断5g、骨碎补25g、伸筋草25g、透骨草 25g、牛膝25g。

制法：取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、没药、乳香、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝混合，粉粹，煎煮两次，加水煎煮两次，第一次加1200ml水，浸泡0.5h，煎煮30min，第二次加900ml水，煎煮20min。煎煮液过 120目筛，过滤，滤液定容，分装，灭菌，得到口服液。

实施例13湿敷剂

配方：川芎20g、青风藤28g、羌活25g、白芷35g、苏木25g、艾叶10g、当归10g、红花15g、乳香8g、没药8g、细辛12g、川断12g、骨碎补10g、伸筋草20g、透骨草 20g、牛膝12g。

制法：将川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，分别粉粹后混合或混合后粉粹，得药粉；取上述药粉，加入体积百分数为50％的乙醇水溶液50ml，浸渍提取4h，得浸提液；取上述浸提液，使用0.23μm超滤膜精馏，收集透过液，将无纺布制成载体浸入到透过液中，分片密封包装。

实验例1本发明实施例的中药组合物对细胞活性的影响

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自美国Gibco；II 型胶原蛋白酶购自美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)公司；CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。

倒置显微镜购自日本奥林巴斯(Olympus)公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司。

2、实验方法

(1)配制待测药物溶液

取实施例9制备的冻干粉，用PBS稀释为1g/ml的药物溶液(即每毫升PBS溶液中加入1g冻干粉)作为供试储备液于-20℃保存备用。

取适量DMEM/F12培养基、特级胎牛血清和双抗混合，配制得到含有89％DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗的培养基，得到完全培养基。上述百分数均为体积百分数，双抗中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

取供试储备液加入适量的完全培养基，分别得到浓度为20mg/mL、6.667mg/mL、2.222mg/mL、0.741mg/mL、0.247mg/mL、0.082mg/mL、0.027mg/mL、0.009mg/mL、 0.003mg/mL、0.001mg/mL的药物溶液(下述简称“SHC溶液”)。

其中，浓度为20mg/mL、6.667mg/mL、2.222mg/mL的药物溶液为高浓度的SHC 溶液，浓度为0.741mg/mL、0.247mg/mL、0.082mg/mL的药物溶液为中浓度的SHC 溶液，浓度为0.027mg/mL、0.009mg/mL、0.003mg/mL、0.001mg/mL的药物溶液为低浓度的SHC溶液。

(2)组织来源与成纤维样滑膜(FLS)细胞的分离培养

供FLS细胞分离的滑膜组织采集于骨关节中心确诊为OA的志愿者，诊断符合2018年中华医学会骨科分会修订的OA诊断标准，在膝关节置换手术过程中，将膝关节腔内增生的滑膜组织剔除，废弃组织收集于装有预冷储存液的容器中低温条件下运送至实验室。

在超净台内将取回的新鲜滑膜组织反复冲洗，用眼科剪剔净脂肪后剪成小块，加入 II型胶原蛋白酶消化后筛网过滤，离心，弃上清液，加入含200ml/l胎牛血清的DMEM/F12培养基，移入培养瓶中，于5％CO₂培养箱中37℃下培养，每2天更换一次含100ml/l 胎牛血清的DMEM/F12培养基，传代3-4次进行后续试验，倒置显微镜下进行FLS细胞形态学观察。

(3)CCK-8法检测细胞活性

取对数生长期FLS细胞，以10⁴细胞/ml的密度接种至96孔板中，每孔体积为100μl，分为SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组、对照组和空白组，空白组不加细胞而加入相同体积的完全培养基，SHC高浓度组分别加入浓度为20mg/mL、6.667 mg/mL、2.222mg/mL的SHC溶液，SHC中浓度组分别加入浓度为0.741mg/mL、0.247 mg/mL、0.082mg/mL的SHC溶液，SHC低浓度组分别加入浓度为0.027mg/mL、0.009 mg/mL、0.003mg/mL、0.001mg/mL的SHC溶液，每组设置5个复孔，各孔加入试剂的体积均为100μl，对照组和空白组均加入同体积的完全培养基，于5％CO₂培养箱中 37℃下孵育24h。

取孵育后的细胞，去除培养液，用PBS清洗2遍，每孔加入CCK-8试剂(100μl/ 孔)继续孵育2h，用酶标仪测定450nm处各孔吸光度(OD)。差异浓度的SHC溶液对FLS细胞活性的影响由细胞存活率(survival rate，SR)和抑制率(inhibition rate，IR) 来反映，计算公式为SR(％)＝(As-Ab)/(Ac-Ab)×100％；IR(％)＝(Ac-As)/(Ac-Ab) ×100％。其中，As为实验组，Ac为对照组，Ab为空白组。

(4)实验数据的分析与统计

使用SPSS 22.0统计软件对以均数±标准差

的形式表达的所有检测数据进行统计学分析，P<0.05检验水平结果有统计学意义。

3、实验结果

(1)FLS细胞形态学观察

倒置显微镜下进行滑膜细胞形态学观察，体外分离所得的滑膜细胞约在10h后完成贴壁，3-4代后，A型细胞即滑膜巨噬细胞的数量逐渐减少，由此获得了纯度较高的滑膜细胞的主要效应细胞B型细胞，即FLS细胞。并采用流式细胞术鉴定本发明上述分离方法培养的FLS细胞的纯度>95％，可用于后续实验研究。在100倍倒置显微镜视野下，可见FLS细胞遍布视野，增殖分裂旺盛，呈极向旋涡状分布，有簇状聚集的细胞集落(见图1-A)；400倍倒置显微镜视野下，可观察到FLS细胞贴壁良好，具备成纤维细胞形态特性，细胞体积均较大，具有生长突，呈长梭形、纺锤形，偶见星形、多角形，包浆丰富，折光性好，胞核呈卵圆形，位于细胞中央(见图1-B)。

(2)FLS细胞活性

差异浓度的SHC溶液对FLS细胞活性的调控可见明显差异及规律，具体表现如表 1和图2-3所示，与对照组相比，高浓度的SHC溶液均不同程度的抑制FLS细胞活性 (P<0.05)，呈浓度依赖性，浓度越高，抑制作用越明显；低浓度的SHC溶液部分抑制FLS细胞活性，其抑制作用也随浓度升高而增强；中浓度的SHC溶液则对FLS细胞活性有部分促进作用，其存活率随浓度降低而逐渐升高，抑制率则逐渐降低，选取不抑制细胞生长的合适浓度区间0.082～0.741mg/mL进行后续实验。

表1差异浓度的SHC溶液对FLS细胞活性的调控(n＝5)

*表示与对照组相比，P<0.05。

实验例2本发明实施例的中药组合物对FLS细胞凋亡的调控作用

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma Aldrich公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

流式细胞仪BD LSRII购自美国BD公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司。

2、实验方法

(1)配制待测药物溶液

取实施例9制备的冻干粉，用PBS稀释为1g/ml的药物溶液(即每毫升PBS溶液中加入1g冻干粉)作为供试储备液于-20℃保存备用。

取适量DMEM/F12培养基、特级胎牛血清和双抗混合，配制得到含有 89％DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗的培养基，得到完全培养基。上述百分数均为体积百分数，双抗中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

取供试储备液加入适量的完全培养基，分别得到浓度为800μg/ml、400μg/ml和200μg/ml的SHC溶液。

(2)FCM法检测细胞凋亡

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，以10⁵细胞/ml的密度接种至6孔板中，每孔体积为2ml，分为SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组和空白组，其中SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组分别加入浓度为800μg/ml、 400μg/ml和200μg/ml的SHC溶液，空白组加入完全培养基，加入体积均为2ml，于5％CO₂培养箱中37℃下孵育24h，每组设置5个复孔。

取孵育后的细胞，去除培养液，用PBS清洗三次，加入胰蛋白酶溶液消化5分钟，离心，弃上清液，收集细胞，并加入PBS清洗，用DMEM/F12培养基重悬成100μl的细胞悬液，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书公开的方法，加入5μl Annexin V-FITC和5μlPI室温孵育15分钟后，再加入400μl结合缓冲液(1x Binding Buffer)，混匀，及时用流式细胞仪检测分析。

(3)实验数据的分析与统计

采用FACS Diva6.0软件对仪器获取细胞凋亡数据进行分析。使用SPSS 22.0统计软件对以均数±标准差

的形式表达的所有检测数据进行统计学分析，P<0.05检验水平结果有统计学意义。

3、实验结果

在FSC vs SSC散点图中圈门，获取异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)通道荧光信号，在Annexin V-FITC/PI散点图中，分群Annexin V-FITC^-PI^-为活细胞群， Annexin V⁺PI^-为早期凋亡细胞群，Annexin V⁺PI⁺为晚期凋亡及坏死细胞群，统计各群细胞比例用以分析细胞凋亡情况。

与空白组相比，SHC的各浓度组均不同程度的诱导FLS细胞早期凋亡与晚期凋亡(P<0.05)，总凋亡率也随之提高(P<0.05)，结果见表2、图4所示，根据Annexin V-FITC/PI散点图统计各群细胞比例用以分析细胞凋亡情况，图中分群Annexin V-FITC^-PI^-为活细胞群，为大多数细胞的所在区域，与空白组相比，SHC的高、中、低浓度组均对FLS细胞各期凋亡有明显的诱导作用(P<0.05)，对FLS细胞早期凋亡率及总凋亡率呈浓度依赖性，其中，SHC高浓度组诱导FLS细胞凋亡作用最明显(结果见表2和图4)。

表2差异浓度的SHC溶液对FLS细胞凋亡的调控(％)

*表示与空白组相比，P<0.05。

实验例3本发明实施例的中药组合物对FLS细胞周期的影响

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma Aldrich公司；RNase A 购自美国Thermo公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

流式细胞仪BD LSRII购自美国BD公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司。

2、实验方法

(1)配制待测药物溶液

取实施例9制备的冻干粉，用PBS稀释为1g/ml的药物溶液(即每毫升PBS溶液中加入1g冻干粉)作为供试储备液于-20℃保存备用。

取适量DMEM/F12培养基、特级胎牛血清和双抗混合，配制得到含有 89％DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗的培养基，得到完全培养基。上述百分数均为体积百分数，双抗中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

取供试储备液加入适量的完全培养基，分别得到浓度为800μg/ml、400μg/ml和200μg/ml的SHC溶液。

(2)FCM检测细胞周期

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，以10⁵细胞/ml的密度接种至6孔板中，每孔体积为2ml，分为SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组和空白组，其中SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组分别加入浓度为800μg/ml、 400μg/ml和200μg/ml的SHC溶液，空白组加入完全培养基，加入体积均为2ml，于5％CO₂培养箱中37℃下孵育24h，每组设置5个复孔。

取孵育后的细胞，去除培养液，用PBS清洗三次，加入胰蛋白酶溶液消化5分钟，离心，弃上清液，收集细胞，并加入PBS清洗，用DMEM/F12培养基重悬成100μl的细胞悬液，加入5μlRNase A和5μlPI室温孵育15分钟后，再加入400μl1x结合缓冲液 (1x BindingBuffer)，混匀，及时用流式细胞仪检测分析。

(3)实验数据的分析与统计

以FCS3.0格式收集细胞周期数据导出，采用Modifit LT软件对其进行拟合分析。使用SPSS 22.0统计软件对以均数±标准差

的形式表达的所有检测数据进行统计学分析，P<0.05检验水平结果有统计学意义。

3、实验结果

收集数据导出为FCS3.0格式，采用Modifit LT软件进性拟合分析G0/G1期、G2/M期、S期细胞比例。结果见表3、图5所示，与空白组相比，SHC的各浓度组均不同程度的延长FLS细胞的G0/G1期(P<0.05)，同时缩短G2/M期和S期(P<0.05)，呈明显的浓度依赖性，浓度越高，G0/G1期细胞比例越大，G2/M期和S期细胞比例越小，其中，SHC高浓度组对FLS细胞周期的阻滞作用最明显。

表3差异浓度的SHC溶液对FLS细胞周期的调控(％)

*表示与空白组相比，P<0.05。

实验例4本发明实施例的中药组合物对FLS细胞的TLR2、TLR4表达及相关性的影响

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma Aldrich公司；异硫氰酸荧光素标记抗人CD282(FITC anti-Human CD282，TLR2)、异硫氰酸荧光素标记小鼠lgG二抗(FITC MouseIgG2a)、同型对照抗体(κIsotype Ctrl Antibody)、藻红蛋白荧光标记鼠抗人CD284(PEMouse Anti-HumanCD284，TLR4)均购自美国BioLegend 公司；藻红蛋白荧光标记小鼠lgG一抗(PE Mouse IgG1)、同型对照抗体(κIsotype Ctrl Antibody)、染色缓冲液(StainBuffer，BSA)均购自美国BD公司。

流式细胞仪BD LSRII购自美国BD公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司。

2、实验方法

(1)配制待测药物溶液

取实施例9制备的冻干粉，用PBS稀释为1g/ml的药物溶液(即每毫升PBS溶液中加入1g冻干粉)作为供试储备液于-20℃保存备用。

取适量DMEM/F12培养基、特级胎牛血清和双抗混合，配制得到含有 89％DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗的培养基，得到完全培养基。上述百分数均为体积百分数，双抗中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

取供试储备液加入适量的完全培养基和脂多糖LPS，分别配制得到含LPS浓度为 1μg/mL，SHC溶液浓度为800μg/mL的高浓度药物溶液；含LPS浓度为1μg/mL，SHC 溶液浓度为400μg/mL的中浓度药物溶液；含LPS浓度为1μg/mL，SHC溶液浓度为 200μg/mL的低浓度药物溶液。

(2)流式细胞术测定TLRs表达

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，以10⁵细胞/ml的密度接种至6孔板中，每孔体积为2ml，分为SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组、模型组和空白组，其中SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组分别加入上述制备得到的高浓度药物溶液、中浓度药物溶液和低浓度药物溶液，模型组加入LPS浓度为1μg/mL的PBS溶液，空白组加入完全培养基，加入体积均为2ml，于5％CO₂培养箱中 37℃下孵育24h，每组设置5个复孔。

取孵育后的细胞，去除培养液，用PBS清洗三次，加入胰蛋白酶溶液消化5分钟，离心，弃上清液，收集细胞，用染色缓冲液洗涤细胞两次后重悬并调节细胞浓度至1x10⁶细胞/ml，每个细胞样本中加入5μl FITC-TLR2和20μl PE-TLR4荧光标记抗体，同时设置同型对照管，分别混匀后室温避光孵育20分钟，离心后用流式细胞仪及时获取分析。

(3)数据分析与统计学处理

流式细胞仪获取细胞的分析软件为BD FACS Diva Software Version6.1.3，收集数据导出为FCS3.0格式，采用Flowjo软件进行分析。以均数±标准差

表示实验检测数据，采用SPSS 20.0统计软件对其进行统计学处理，检验水平P<0.05代表结果有统计学意义。

3、实验结果

在FSC vs SSC散点图中圈出聚集的目的细胞群，经由数据导出及分析后可见，各组FLS细胞表面均有TLR2和TLR4的表达，具体结果见表4所示，与空白组对比，模型组TLR2和TLR4的表达显著增强(P<0.05)，说明LPS起到对TLRs信号通路的诱导作用；与模型组相比，SHC溶液各浓度组均不同程度的抑制TLR2和TLR4的表达 (P<0.05)，TLR2和TLR4的阳性比例随浓度升高而降低，其中，SHC高浓度组抑制作用最显著。另外，由FCM直方图(图6)可见，各组FITC-TLR2的荧光强度相较PE-TLR4 的荧光强度弱，且二者表达伴行分布。相关性系数r＝0.887，呈显著的正相关性(P<0.05)。

表4 SHC溶液对TLR2和TLR4表达的测定(％)

分组	TLR2-FITC(％)	TLR4-PE(％)
			SHC高浓度组	3.61±0.77*	6.48±0.36*
SHC中浓度组	7.38±1.21*	9.24±0.76*
			SHC低浓度组	8.46±0.64*	12.95±1.72*
模型组	13.32±1.52△	33.74±4.03△
			空白组	2.41±0.20	5.29±0.58

*表示与模型组相比，P<0.05，△表示与空白组相比，P<0.05，相关性r＝0.887，P＝0.000。 .

实验例5本发明实施例的中药组合物对NO、IL-6释放量及相关性的影响

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma Aldrich公司，白介素 6(Interleukin-6，IL-6)Elisa试剂盒购自美国RayBiotech公司，一氧化氮(NO)检测试剂盒购自南京建成有限公司。

流式细胞仪BD LSRII购自美国BD公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司。

2、实验方法

(1)配制待测药物溶液

取实施例9制备的冻干粉，用PBS稀释为1g/ml的药物溶液(即每毫升PBS溶液中加入1g冻干粉)作为供试储备液于-20℃保存备用。

取适量DMEM/F12培养基、特级胎牛血清和双抗混合，配制得到含有89％DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗的培养基，得到完全培养基。上述百分数均为体积百分数，双抗中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

取供试储备液加入适量的完全培养基和脂多糖LPS，分别配制得到含LPS浓度为 1μg/mL，SHC溶液浓度为800μg/mL的高浓度药物溶液；含LPS浓度为1μg/mL，SHC 溶液浓度为400μg/mL的中浓度药物溶液；含LPS浓度为1μg/mL，SHC溶液浓度为 200μg/mL的低浓度药物溶液。

(2)NO、IL-6的测定

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，以10⁵细胞/ml的密度接种至6孔板中，每孔体积为2ml，分为SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组、模型组和空白组，其中SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组分别加入上述制备得到的高浓度药物溶液、中浓度药物溶液和低浓度药物溶液，模型组加入LPS浓度为 1μg/mL的PBS溶液，空白组加入完全培养基，加入体积均为2ml，于5％CO₂培养箱中 37℃下孵育24h，每组设置5个复孔。

取孵育后的各组细胞的上清液，分别按说明书用NO试剂盒(一步法)和IL-6Elisa试剂盒的方法检测NO和IL-6的释放量。

(3)数据分析与统计学处理

以均数±标准差

表示实验检测数据，采用SPSS 20.0统计软件对其进行统计学处理，检验水平P<0.05代表结果有统计学意义。

3、实验结果

经LPS诱导后，模型组TLRs通路下游炎性因子NO、IL-6释放量相较空白组明显升高(P<0.05)；而相较模型组，SHC低、中、高浓度组的NO、IL-6的释放量逐渐减低，且差异有统计学意义(P<0.05)，其中，SHC高浓度组对NO、IL-6释放的抑制作用最明显。结果可见，NO和IL-6的释放存在显著的正相关性(P<0.05)，相关性系数 r＝0.984，结果见表5、图7和图8所示。

表5 SHC溶液对NO和IL-6释放量的调控

	NO(μmol/L)	IL-6(pg/mL)
			SHC高浓度组	12.65±2.632*	2369.333±26.667*
SHC中浓度组	19.721±0.992*	3306.833±65.833*
			SHC低浓度组	23.304±1.005*	3624.333±40*
模型组	32.977±3.94△	4876±101.667△
			空白组	6.784±1.587	1656.833±68.333

*表示与模型组相比，P<0.05，△表示与空白组相比，P<0.05，相关性r＝0.984，P＝0.000。

实验例6 TLRs与通路下游炎性因子NO、IL-6释放量的相关性

1、数据分析与统计学处理

实验数据来自实验例4和实验例5。以均数±标准差

表示实验检测数据，采用SPSS 20.0统计软件对其进行统计学处理，检验水平P<0.05代表结果有统计学意义。

2、实验结果

通过对表4和5中实验数据的统计分析，计算出TLR2与NO表达的相关系数为0.996，显著性概率为0.000，与IL-6表达的相关系数为0.975，显著性概率为0.000；TLR4 与NO表达的相关系数为0.883，显著性概率为0.000，与IL-6表达的相关系数为0.891，显著性概率为0.000。说明了固有免疫反应系统中以TLR2、TLR4为代表的TLRs与由其介导的炎症信号通路下游以NO、IL-6为代表炎性因子存在显著的正相关性，结果见表6所示。

表6 TLR2、TLR4、NO、IL-1的相关性

	TLR2	TLR4	NO	IL-6
					TLR2	1	0.887*	0.966*	0.975*
TLR4	0.887*	1	0.883*	0.891*
					NO	0.966*	0.883*	1	0.984*
IL-6	0.975*	0.891*	0.984*	1

*表示P<0.05，相关性显著。

实验例7本发明实施例的中药组合物对FLS细胞迁移的影响

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma Aldrich公司，CCK-8 试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。

倒置显微镜购自日本奥林巴斯(Olympus)公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司。

2、实验方法

(1)划痕实验测定SHC溶液对FLS细胞迁移的影响

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，将FLS细胞接种至画好平行线的6孔板内，密度约为80％，饥饿培养(采用无血清DMEM/F12培养基培养) 24h后，用20μl的灭菌枪头沿之前画好的平行线制造划痕，用PBS溶液清洗3次，吸弃脱落细胞，加入浓度为800μg/mL的SHC溶液作为SHC组2ml(取实验例1中的供试储备液加入适量的无血清DMEM/F12培养基配制得到)，另设空白组加入同体积无血清DMEM/F12培养基与之对照，每组分别设3个复孔。分别在倒置显微镜下观察0h、 24h、48h、72h划痕区FLS细胞迁移情况，采用image J软件对每个镜下视野的FLS细胞迁移后的划痕宽度和划痕面积，迁移率以迁移后划痕面积占初始划痕面积的百分比进行计算。

(2)统计学数据处理与分析

上述实验中所得数据均以均数±标准差

形式表示，采用SPSS 20.0统计软件对其进行统计学分析，检验标准P<0.05即为差异有统计学意义。

3、实验结果

具体结果见图9-11以及表7所示，在倒置显微镜下，对照组和SHC组0h相比同组的其他时间段，划痕宽度为最大，划痕带较均匀，带内无细胞分布，边缘细胞排列均较紧密，划痕边界较清晰；随着时间的推移，有FLS细胞迁移入原划痕内，划痕逐渐变窄，粗细不均，边界逐渐模糊，划痕面积逐渐缩小。

由表7可知，对照组48h、72h的迁移率与0h相比有统计意义(P>0.5)，SHC组 72h的迁移率与0h相比有统计学意义(P>0.5)；与对照组相比，SHC组迁移能力较弱， 48h、72h时差异有统计学意义(P>0.5)，说明SHC溶液在一定程度上抑制了FLS细胞的迁移。

表7 SHC溶液对FLS细胞迁移的影响

*表示与同组0h迁移率相比，差异有统计学意义，P<0.05；△表示与对照组同时间点相比，差异有统计学意义，P<0.05。

实验例8本发明实施例的中药组合物对FLS细胞侵袭的影响

1、试剂与仪器

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)、结晶紫溶液均购自美国Sigma Aldrich 公司，CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。

倒置显微镜购自日本奥林巴斯(Olympus)公司；低速离心机LD5-10B购自北京京立离心机有限公司，Transwell细胞培养板购自美国Corning公司。

2、实验方法

(1)Transwell实验测定SHC溶液对FLS细胞侵袭的影响

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，将FLS细胞接种至画好平行线的6孔板内，密度约为80％，饥饿培养(DMEM/F12培养基)24h后，将饥饿后的FLS细胞接种于包好基质胶Matrigel(5mg/mL)的Transwell小室的上室，随机分为 SHC组和空白组，SHC组加入无血清稀释的浓度为800μg/mL的SHC溶液2ml(取实验例1中的供试储备液加入适量的无血清DMEM/F12培养基配制得到)培养，下室加入完全培养基稀释的浓度为800μg/mL的SHC溶液2ml(取实验例1中的供试储备液加入完全培养基配制得到)，空白组为加入同体积不含SHC溶液的Transwell小室，同时针对实验组和空白组，分别设置上下室均不含血清的对照组。将上下室装好，置于37℃恒温5％CO₂培养箱中共同培养24h，吸弃小室中液体，以PBS溶液清洗小室中残留药液，棉签擦掉上室中未穿过聚碳酯膜的细胞，甲醇固定30min后，将小室倒扣风干，0.1％结晶紫染色20min，倒置显微镜下观察和细胞计数。

(2)统计学数据处理与分析

上述实验中所得数据均以均数±标准差

形式表示，采用SPSS 20.0统计软件对其进行统计学分析，检验标准P<0.05即为差异有统计学意义。

3、实验结果

与只含培养基的空白组(图12-A)相比，SHC溶液干预下的实验组(图12-C)FLS 细胞穿过小室膜的细胞个数明显减少，说明FLS细胞的透膜侵袭能力被SHC溶液明显抑制(P>0.5)。而下室不含血清的培养基对FLS细胞的侵袭基本无诱导力，空白组的对照组(图12-B)和实验组的对照组(图12-D)均基本观查不到完整的细胞穿过小室膜。

实验例9本发明实施例的中药组合物对MMP3释放量的影响

1、实验试剂

DMEM/F12培养基、特级胎牛血清、胰蛋白酶溶液(含0.25％胰蛋白酶溶液的DMEM培养基)、杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Gibco；II型胶原蛋白酶、脂多糖(LPS)、碘化丙啶(PI)均购自美国Sigma Aldrich公司；基质金属蛋白酶3(Matrixmetalloproteinase-3，MMP-3)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunoabsorbent assay，Elisa)试剂盒购自美国abcam公司。

2、实验方法

(1)配制待测药物溶液

取实施例9制备的冻干粉，用PBS稀释为1g/ml的药物溶液(即每毫升PBS溶液中加入1g冻干粉)作为供试储备液于-20℃保存备用。

取适量DMEM/F12培养基、特级胎牛血清和双抗混合，配制得到含有 89％DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗的培养基，得到完全培养基。上述百分数均为体积百分数，双抗中青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。

取供试储备液加入适量的完全培养基和脂多糖LPS，分别配制得到含LPS浓度为 1μg/mL，SHC溶液浓度为800μg/mL的高浓度药物溶液；含LPS浓度为1μg/mL，SHC 溶液浓度为400μg/mL的中浓度药物溶液；含LPS浓度为1μg/mL，SHC溶液浓度为 200μg/mL的低浓度药物溶液。

(2)Elisa法测定MMP3含量

如实验例1分离培养FLS细胞并取对数生长期FLS细胞，以10⁵细胞/ml的密度接种至6孔板中，每孔体积为2ml，分为SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组、模型组和空白组，其中SHC高浓度组、SHC中浓度组、SHC低浓度组分别加入上述制备得到的高浓度药物溶液、中浓度药物溶液和低浓度药物溶液，模型组加入LPS浓度为 1μg/mL的PBS溶液，空白组加入DMEM/F12培养基，加入体积均为2ml，于5％CO₂培养箱中37℃下孵育24h，每组设置5个复孔。

取孵育后的各组细胞的上清液，离心沉淀细胞碎片，收集各组EP管中的上清液，按Elisa试剂盒说明书记载的步骤检测各样本中MMP3的含量。

(3)统计学数据处理与分析

上述实验中所得数据均以均数±标准差

形式表示，采用SPSS 20.0统计软件对其进行统计学分析，检验标准P<0.05即为差异有统计学意义。

3、实验结果

结果见表8和图13所示，由LPS诱导的模型组的MMP3释放量相较空白组显著升高(P<0.05)，FLS细胞活化成功；与对照组相较，SHC溶液各浓度组均对MMP3的释放有不同程度的抑制作用(P<0.05)，随SHC溶液浓度升高，抑制作用逐渐增强，其中，SHC 高浓度组对MMP3释放的抑制作用最强。

表8 SHC溶液对MMP3释放的影响

*表示与空白组相比，差异有统计学意义，P<0.05；△表示与模型组相比，差异有统计学意义，P<0.05。

综上所述，本发明中药组合物能够调控FLS细胞的增殖和凋亡平衡，调节TLR2和TLR4介导的固有免疫反应，降低炎症因子NO、IL-6和MMP3的释放量，抑制滑膜细胞向软骨等周围组织的的迁移和侵袭从而达到减轻滑膜炎症反应，保护与修复关节软骨等的作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种治疗骨关节疾病的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料药组成：川芎20-40份、青风藤20-40份、羌活10-30份、白芷10-35份、苏木5-25份、艾叶10-30份、当归5-20份、红花5-20份、乳香5-20份、没药5-20份、细辛5-20份、川断5-25份、骨碎补5-25份、伸筋草5-25份、透骨草5-25份、牛膝5-25份。

2.根据权利要求1所述的治疗骨关节疾病的中药组合物，其特征在于，由如下重量份的原料药组成：川芎30份、青风藤30份、羌活20份、白芷20份、苏木15份、艾叶20份、当归10份、红花10份、乳香10份、没药10份、细辛10份、川断15份、骨碎补15份、伸筋草15份、透骨草15份、牛膝15份；或者，

川芎40份、青风藤25份、羌活18份、白芷18份、苏木18份、艾叶25份、当归20份、红花20份、乳香12份、没药12份、细辛8份、川断15份、骨碎补12份、伸筋草12份、透骨草12份、牛膝20份；或者，

川芎20份、青风藤28份、羌活25份、白芷35份、苏木25份、艾叶10份、当归10份、红花15份、乳香8份、没药8份、细辛12份、川断12份、骨碎补10份、伸筋草20份、透骨草20份、牛膝12份。

3.一种权利要求1或2所述的治疗骨关节疾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，按照选定的重量份数称取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、乳香、没药、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，混合后按常规提取方法提取或者分别按常规提取方法提取后混合，即得。

4.根据权利要求3所述的治疗骨关节疾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，所述常规提取方法包括浸渍提取、煎煮提取、回流提取、渗漉提取、超声提取和水蒸气蒸馏中的一种或几种；提取溶剂为水或体积百分数为20-95％的醇溶液；提取次数为1-3次；每次提取的时间为5-180min；提取溶剂的体积与原料药重量的比值为1-5L：1kg；

在所述常规提取方法提取之后还包括对得到的提取物进行精制纯化处理的步骤；所述精制纯化处理包括水提醇沉、萃取、硅胶色谱柱分离和大孔树脂柱分离中的一种或几种；

在所述常规提取方法提取之前还包括将混合后的原料药进行粉碎或者将各原料药分别进行粉碎的步骤。

5.根据权利要求3或4所述的治疗骨关节疾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)按照选定的重量份数称取川芎、青风藤、羌活、白芷、苏木、艾叶、当归、红花、细辛、川断、骨碎补、伸筋草、透骨草和牛膝，加水，煎煮20-80min，过滤，得滤液和药渣；

(2)取步骤(1)得到的药渣，加水，煎煮5-30min，然后加入按照选定的重量份数称取的乳香和没药，继续煎煮5-20min，得药液；

(3)将步骤(1)制得的滤液与步骤(2)制得的药液合并，得水煎液。

6.根据权利要求5所述的治疗骨关节疾病的中药组合物的制备方法，其特征在于，

步骤(1)中，在煎煮之前还包括将原料药在水中浸泡的步骤，浸泡的时间为15-90min；

步骤(2)中，按照选定的重量份数称取没药和乳香之后先用纱布包裹再进行煎煮；

步骤(3)中，制得水煎液之后还包括对水煎液进行浓缩得浸膏并将浸膏经干燥得冻干粉的步骤。

7.一种治疗骨关节疾病的中药制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的中药组合物或者权利要求3-6中任一所述的制备方法所制得的中药组合物，以及任选地一种或多种药学上可接受的载体；

所述中药制剂为凝胶剂、乳霜剂、片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、煎膏剂、栓剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、注射剂、喷剂、搽剂、酊剂、湿敷剂、糊剂或洗剂；

所述药学上可接受的载体选自药学上可接受的溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的治疗骨关节疾病的中药制剂，其特征在于，还包括任选地一种或多种其他治疗骨关节疾病的药物，所述其他治疗骨关节疾病的药物选自对乙酰氨基酚、布诺芬、洛索洛芬钠、氟比洛芬巴布、双氯芬酸钠、塞来昔布、罗非昔布、美洛昔康、氯诺昔康、萘丁美酮、双醋瑞因、曲安奈德、倍他米松、甲泼尼龙、氢化可的松、曲马多、玻璃酸钠、氨基葡萄糖、硫酸软骨素、依托度酸、舒林酸、阿西美辛羟氯喹、依那西普、环磷酰胺、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环孢霉素A、来氟米特、英夫利昔单抗、阿那白滞素和阿达木单抗中的至少一种。

9.权利要求1或2所述的中药组合物、权利要求3-6中任一所述的制备方法制得的中药组合物或者权利要求7或8所述的中药制剂在制备预防或治疗骨关节疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨关节疾病为骨性关节炎、外伤性关节炎、滑膜炎、滑囊炎、颈椎病、腰椎病、肩周炎和骨质增生中的至少一种。

Images