CN106728836B - 一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法，该中药组合物主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：黄芪15～50份，麦冬10～30份，板蓝根10～30份，丹参10～30份，及甘草5～10份。该中药组合物以“解毒活血、益气养阴”为主。对于治疗毒瘀互结，气阴两虚证的儿童有显著疗效。其中黄芪、麦冬为君，黄芪补心气之亏虚，麦冬养阴生津，臣以丹参活血化瘀，佐以板蓝根清热解毒，使以甘草调和诸药，补脾益气复脉。该制备方法为：用水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小时，得到提取液，将提取液浓缩至在60℃时相对密度为1.05～1.20的浓缩液，将浓缩液与药用辅料混合即可。该方法简单易行，可操作性强。

Description

一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药技术领域，且特别涉及一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法。
背景技术
小儿病毒性心肌炎是小儿疾病中发病率较高的一种，是由多种病毒感染所致心肌损害引起的心肌局限性或弥漫性炎性病变。各年龄均可发病，尤以3岁以上的小儿多见，发病无季节性，轻重各异，病程长短不一。由于病毒性心肌炎的发病机制尚不完全清楚，因此，目前西医尚无特效治疗方法，临床多采用心肌细胞营养剂、抗病毒药物及免疫抑制剂等对症治疗。
在中医领域，本病属胸痹、心悸、怔忡、温病等范畴，中医认为心气虚则鼓动无力，血脉瘀阻；心阴虚则心脉失养而致病，临床上以“虚、滞、瘀”的表现多见。正气不足、邪毒侵心是导致病毒性心肌炎发生的重要因素。而气阴两虚是本病发生的内在因素。外感邪毒则是诱发或加重本病的外在因素。气阴两虚极易感受温热邪毒，邪毒内侵势必耗伤气阴。然而在中医治疗中，多数组方用药复杂，以“毒瘀互结，气阴两虚”为重点的药物较少，同时此类药物一般为汤剂，不便于儿童服用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，此中药组合物具有解毒活血、益气养阴的作用，特别适用毒瘀互结，气阴两虚证的患者儿童。
本发明的另一目的在于提供一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，该制备方法简单易行，利于工业化生产，制备出来的中药组合物便于小儿服用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：黄芪15～50份，麦冬10～30份，板蓝根10～30份，丹参10～30份，及甘草5～10份。
本发明提出一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其包括：用原料7～9倍重量的水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小时，得到提取液，将提取液浓缩至在60℃时相对密度为1.05～1.20的浓缩液，将浓缩液与药用辅料混合。
本发明实施例提供的一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法的有益效果是：该中药组合物遵循中医学的配伍规律及“君臣佐使”的组方规律。以“解毒活血、益气养阴”为主。对于治疗毒瘀互结，气阴两虚证的患者儿童有显著疗效。其中黄芪、麦冬为君，黄芪补心气之亏虚，麦冬养阴生津，臣以丹参活血化瘀，佐以板蓝根清热解毒，使以甘草调和诸药，补脾益气复脉。其次，该组合物的药味少，药性强，且药效专，治疗小儿病毒性心肌炎具有针对性。
该中药组合物的制备方法，主要以煎煮和浓缩为主，简单易行，可操作性强。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法进行具体说明。
本发明实施例提供的一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：黄芪15～50份，麦冬10～30份，板蓝根10～30份，丹参10～30份，及甘草5～10份。
优选地，按重量份数计，黄芪为30份，麦冬为20份，板蓝根为20份，丹参为20份，及甘草为10份。
该中药组合物以“解毒活血、益气养阴”为主。对于治疗毒瘀互结，气阴两虚证的患者儿童有显著疗效。其中黄芪、麦冬为君，黄芪补心气之亏虚，麦冬养阴生津，臣以丹参活血化瘀，佐以板蓝根清热解毒，使以甘草调和诸药，补脾益气复脉。
具体地，小儿病毒性心肌炎是由病毒感染引起的以局限性或弥漫性心肌炎性病变为主的疾病，其亲心性的特点导致了心肌炎的发生，体现了其“损伤脏腑功能”之特性。与中医毒邪“内损、暴烈、顽固、危重”之特性相切合。早期毒伤心络，伤心体损心用，致气阴两虚，气阴两虚为本，邪毒侵袭为标，此期标实为主；中期由毒致瘀，由瘀化毒，加重气阴亏虚，以瘀为主，虚实标本夹杂；至后期病情迁延气阴两虚明显，由虚生瘀，瘀久生毒，毒瘀互结，且反复感受外毒，本虚为主，兼夹毒瘀。因此选用补气与补阴药黄芪、麦冬为君药，黄芪补心气之亏虚，麦冬养阴生津。臣以丹参活血化瘀。再次，辅以清热解毒药板蓝根祛毒邪。最后使以甘草调和诸药，补脾益气复脉。
优选地，黄芪选用炙黄芪，其中炙黄芪有润燥、补中益气的功效。甘草选用炙甘草。
进一步地，在本发明较佳实施例中，按重量份数计，原料还包括：党参10～50份，山药10～50份，及葛根10～50份。
党参补脾肺气，补血，生津。常用于气虚不能生血，血虚无以化气。与黄芪配伍，可增强补气补血的效果。山药，既补气，又养阴，与黄芪、麦冬配伍，增强臣药的作用。葛根，解肌退热，生津止渴。
进一步地，在本发明较佳实施例中，原料还包括太子参为10～30份，西洋参为5～20份，与白术为10～30份中的至少一种。太子参、西洋参与白术皆为补气药，选用三者中的至少一种，可以增强组方补气的作用。其中，太子参能生津润肺，西洋参能清热生津，白术能燥湿利水，增强组合物“清毒、散毒、通毒”的能力。
优选地，按重量份数计，原料包括黄芪50份，麦冬20份，板蓝根15份，丹参20份，甘草10份，党参30份，太子参30份，葛根30份，山药20份，西洋参10份，及白术30份。
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其包括：用原料7～9倍重量的水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小时，得到提取液，将提取液浓缩至在60℃时相对密度为1.05～1.20的浓缩液，即浓缩液的相对密度为1.05～1.20(60℃)，优选地，为了提高提取率，得到更多的药物有效活性成分，浓缩提取液的步骤进行两次，将提取液第一次浓缩至在60℃时相对密度为1.06～1.12的浓缩液，第二次浓缩是在第一次浓缩得到的浓缩液(即在60℃时相对密度为1.06～1.12)中加入第一次浓缩得到的浓缩液1～3倍量的乙醇，静置20～24h，过滤，得到乙醇与滤液。
其中滤液的处理方式有两种，一种是将滤液浓缩至在60℃时相对密度为1.10～1.12的浓缩液，将进行过一次或进行过两次的浓缩液干燥、与药用辅料混合，制成中药组合物的丸剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。另一种是将滤液与药用辅料混合得到中药组合物的口服液。在乙醇中静置后，药用活性成分会继续析出。其中，药用辅料可选用矫味剂、粘合剂、润滑剂与崩解剂中的任意一种或几种。进一步地，调节口服液的pH值至4.0～6.0，得到中药组合物的合剂。该制备方法操作简单，流程清楚，同时可制备出多种剂型，供患者选用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：炙黄芪30份，麦冬20份，板蓝根20份，丹参20份，及炙甘草10份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小时，滤过，收集提取液，将提取液浓缩成相对密度为1.10(60℃)的浓缩液，浓缩液喷雾干燥(进风温度180℃，出风温度100℃)得到干浸膏粉，干浸膏粉中加入适量蔗糖，以乙醇做粘合剂，制粒，干燥，整粒，装袋，即得中药组合物的颗粒剂。
实施例2
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：炙黄芪30份，麦冬15份，板蓝根15份，丹参20份，及炙甘草8份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小时，滤过，收集提取液，将提取液浓缩至相对密度为1.06(60℃)的浓缩液，之后浓缩液中加入等量乙醇搅拌均匀，静置24小时，滤过，回收乙醇至无醇味，在滤液中加入单糖浆、山梨酸钾，摇匀，滤过，灌装，灭菌，即得中药组合物的口服液。
实施例3
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：炙黄芪40份，麦冬15份，板蓝根15份，丹参20份，炙甘草8份，党参20份，太子参20份，葛根24份，及山药30份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小时，滤过，收集提取液，将提取液进行第一次浓缩，得到相对密度为1.07(60℃)的第一浓缩液，接着第一浓缩液中加入3倍量乙醇搅匀，静置24小时，滤过，回收乙醇并进行第二次浓缩，得到相对密度为1.10(60℃)的第二浓缩液，第二浓缩液喷雾干燥(进风温度180℃，出风温度100℃)后得到干浸膏粉，干浸膏粉加入适量微晶纤维素，以乙醇做粘合剂，制粒，干燥，整粒，装入2号胶囊，即得中药组合物的胶囊剂。
实施例4
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：黄芪50份，麦冬20份，板蓝根15份，丹参20份，甘草10份，党参30份，太子参30份，葛根30份，山药20份，西洋参10份，及白术30份。
该中药组合物的制备方法为：先将上述西洋参、太子参、丹参、山药混合，粉碎成120目的粉末，备用；用水煎煮黄芪、麦冬、板蓝根、甘草、党参、葛根与白术3次，每次加黄芪、麦冬、板蓝根、甘草、党参、葛根与白术总重量9倍的水煎煮1.0小时，滤过，收集提取液，将提取液浓缩成相对密度为1.20(60℃)的浓缩液，加入上述备用粉末及适量炼蜜，混合均匀，制丸条，分粒，搓圆，即得中药组合物的丸剂。
实施例5
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：黄芪30份，麦冬20份，板蓝根20份，丹参20份，甘草8份，党参30份，葛根30份，及山药20份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小时，滤过，收集提取液，将提取液进行第一次浓缩，得到相对密度为1.07(60℃)的第一浓缩液，第一浓缩液中加入3倍量乙醇搅匀，静置20小时，滤过，滤液回收乙醇并进行第二次浓缩，得到相对密度为1.12(60℃)的第二浓缩液，将第二浓缩液喷雾干燥(进风温度180℃，出风温度100℃)后加入适量微晶纤维素，以乙醇做粘合剂，制粒，干燥，整粒，加入15份硬脂酸镁，混匀，压片，即得中药组合物的片剂。
实施例6
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：炙黄芪30份，麦冬20份，板蓝根20份，丹参20份，及炙甘草10份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小时，滤过，收集提取液，将提取液浓缩成相对密度为1.05(60℃)的浓缩液，静置，滤过，加入5份阿司帕坦，10份山梨酸钾，搅匀，用浓度为10％氢氧化钠溶液调节pH值为4.0，滤过，灌装，灭菌，即得中药组合物的合剂。
实施例7
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：炙黄芪15份，麦冬10份，板蓝根10份，丹参10份，炙甘草5份，党参10份，葛根10份，山药10份，及西洋参5份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料2次，每次加原料7倍重量的水，第一次1.5h，第二次1h，滤过，收集提取液，将提取液进行第一次浓缩，得到相对密度为1.07(60℃)的第一浓缩液，接着第一浓缩液中加入2倍量乙醇搅匀，静置22小时，滤过，回收乙醇并进行第二次浓缩，得到相对密度为1.11(60℃)的第二浓缩液，将第二浓缩液喷雾干燥(进风温度180℃，出风温度100℃)，加入适量微晶纤维素，以乙醇做粘合剂，制粒，干燥，整粒，加入15g硬脂酸镁，混匀，压片，即得中药组合物的片剂。
实施例8
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：炙黄芪50份，麦冬30份，板蓝根30份，丹参30份，炙甘草10份，党参50份，葛根50份，山药50份，西洋参20份，及白术30份。
该中药组合物的制备方法为：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小时，滤过，收集提取液，将提取液浓缩成相对密度为1.05(60℃)的浓缩液，静置，滤过，加入5份阿司帕坦，10份山梨酸钾，搅匀，用浓度为10％氢氧化钠溶液调节pH值为6.0，滤过，灌装，灭菌，即得中药组合物的合剂。
实施例9
一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，主要由原料制成，按重量份数计，原料包括：黄芪20份，麦冬18份，板蓝根12份，丹参18份，甘草7份，党参15份，太子参10份，葛根15份，山药15份，及白术10份。
该中药组合物的制备方法为：用原料8倍重量的水煎煮上述原料3次，第一次1小时，第二次40min，第三次20min，合并滤液，得到中药组合物的汤剂。
对比例1
玉丹荣心丸，由玉竹、炙甘草、五味子、丹参、降香、山楂、蓼大青叶、苦参组成，由上海玉丹药业厂生产，1.5g/丸，36丸/盒。国药准字：Z10970095。
试验例一 中药组合物对EAM模型大鼠治疗作用的观察
1材料与方法
1.1实验动物
雄性健康SPF级Lewis大鼠60只，6～7周龄，体重180～210g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。
1.2实验材料
1.2.1实验用药
中药组合物，根据实施例6制成，由山东中医药大学附属医院制剂室生产，100ml/瓶，1ml含生药1g；
玉丹荣心丸，由上海玉丹药业厂生产，1.5g/丸，36丸/盒。国药准字：Z10970095。
1.3实验方法
1.3.1抗原制备
无菌条件下，用浓度为0.01mmol/L的PBS缓冲液将猪心肌肌球蛋白先稀释为l0mg/ml浓度的溶液。后用无菌的两支玻璃注射器分别抽取等体积的上述稀释溶液及完全弗氏佐剂(含有结核分枝杆菌10mg/ml)。再取一段经灭菌的塑料管连接两支玻璃注射器，使注射器中的两种溶液充分混合成油包水乳浊液。混合成功的标准：取1杯冰水，将1滴经混合后的猪心肌肌球蛋白乳浊液滴入，如呈球形并完全不分散即为混合成功。
1.3.2造模及分组
60只SPF级雄性Lewis大鼠按随机数字表分为2组：正常对照组10只，模型组50只。将50只模型组大鼠造模，方法如下：用猪心肌肌球蛋白和弗氏完全佐剂的混合液0.2ml/只(合计猪心肌肌球蛋白2mg/只)，于实验第1天、第8天双后肢足垫区皮下注射，造模成功后将50只大鼠随机分成5组：EAM模型组，中药组合物大、中、小剂量组，玉丹荣心丸组，每组10只。给正常对照组大鼠于实验第1天、第8天双后肢足垫区皮下注射PBS缓冲液0.2ml/只；中药组合物大、中、小剂量组及玉丹荣心丸组大鼠，于造模后半小时开始给药。
1.3.3药物制备及给药
将中药组合物临用前进行稀释，大剂量每毫升相当于生药0.975g，中剂量每毫升相当于生药0.63g，小剂量每毫升相当于生药0.325g。玉丹荣心丸临用时配成每毫升0.25g混悬溶液，4℃冰箱保存。中药组合物大剂量组、中剂量组、小剂量组每日分别给予中药组合物大剂量、中剂量、小剂量1ml/100g；玉丹荣心丸组每日给玉丹荣心丸混悬溶液1ml/100g；正常对照组和EAM模型组每日均给予蒸馏水1ml/100g，均采用灌胃法给药，日一次，连续给药21天。
1.3.4一般情况观察
观察大鼠食欲、精神、活动情况，体重变化情况。
1.3.5标本采集及保存
免疫后21天，各组大鼠锁骨下静脉取血1～2ml，3000r/min离心后收集血清，置于-80℃冰箱保存备用；腹腔注射戊巴比妥钠20mg/kg，麻醉后处死，立刻无菌取心脏，冰盐水冲洗后放入10％中性福尔马林固定，常温保存，用于HE染色和免疫组化检测。
1.3.6 ELISA法检测血清cTnT和BNP的表达
本研究应用上海基尔顿生物科技有限公司检测试剂盒，严格按照产品说明书进行操作。计算：用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
1.3.7组织标本制备
将心肌组织沿长轴剖开，每隔1cm取材，大小约1cm×1cm×0.3cm，置于10％中性福尔马林固定4～6h，水洗20～30min，常规按以下步骤脱水、透明、浸蜡：70％乙醇(35℃)90min、80％乙醇(35℃)90min、90％乙醇(35℃)90min、95％乙醇(35℃)90min、100％乙醇Ⅰ(35℃)60min、100％乙醇Ⅱ(35℃)60min、二甲苯Ⅰ透明20min、二甲苯Ⅱ透明35min、二甲苯Ⅲ透明35min、浸蜡(60℃)30min、浸蜡(60℃)75min、浸蜡(60℃)75min。常规石蜡包埋，4μm连续切片。用于后续的HE染色和免疫组化检测。
1.3.8苏木精-伊红(HE)染色
1.3.8.1镜检观察：在每张切片中随机选取5个高倍镜(×100倍)视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死的区域面积占整个视野面积的百分比。无病变的记为0分，病变面积小于25％的记为1分，病变面积在25％～50％间记为2分，病变面积在50％～75％间记为3分，病变面积大于75％的记为4分。
1.3.9统计学方法
实验结果用SPSS17.0统计软件，大鼠体重采用重复测量资料的方差分析，其他数据采用单因素方差分析进行统计分析，各组实验数据以均数±标准差
Figure BDA0001194753050000131
表示，均以P＜0.05为具有统计学意义。
2实验结果
2.1一般状态观察
各组大鼠观察期间无死亡现象。正常对照组大鼠均健康生长至免疫第21天。造模大鼠于免疫第7天开始出现进食及活动减少、互相撕咬、毛色晦暗、呼吸急促。至免疫第21天，EAM模型组大鼠上述表现尤为明显。
2.2体重变化
各组大鼠免疫前体重没有显著差别(P＞0.05)，EAM模型组大鼠体重自免疫第7天开始逐渐减轻，至免疫第21天达最低。中药组合物中大剂量组、玉丹荣心丸组大鼠体重于免疫第7天略有下降，后逐渐升高，增高显著优于中药组合物小剂量组大鼠(P＜0.01)。
2.3各组大鼠心肌组织病理变化
HE染色结果显示正常对照组心肌细胞结构清晰，无变性坏死，细胞核结构清楚，间质内未见炎细胞浸润和纤维组织增生；EAM模型组：心肌细胞大部分被破坏，变性坏死明显，部分心肌细胞溶解消失，大量急慢性炎细胞弥漫浸润，边缘可见少量残存的心肌细胞，间质成纤维细胞增生，显示心肌炎大鼠模型造模成功。药物干预后，中药组合物小剂量组心肌间存在中等量中性粒细胞等炎细胞浸润，心肌结构破坏明显，可见少量成纤维母细胞增生；中药组合物中剂量组和玉丹荣心丸组均显示心肌结构基本存在，仅见少量变性坏死，心肌间可见少量中性粒细胞浸润，未见明显成纤维细胞增生；中药组合物大剂量组心肌结构基本正常，心肌细胞无明显变性坏死，心肌间有少量不等的灶性炎性细胞聚集区。
病理积分比较结果显示EAM模型组心肌病理积分高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。中药组合物中、大剂量组与玉丹荣心丸组心肌病理积分均低于EAM模型组和中药组合物小剂量组(P＜0.05)，三组之间无显著差异(P＞0.05)，中药组合物小剂量组与EAM模型组病理积分无统计学差异(P＞0.05)，见表1。
表1各组病理积分比较表
Figure BDA0001194753050000141
Figure BDA0001194753050000142
注：与正常对照组比较，★P＜0.05；与EAM模型组比较，△△P＞0.05，△P＜0.01；与小剂量组比较，◇P＜0.05；与中剂量组比较▲P＞0.05；与大剂量组比较☆P＞0.05。
2.4各组大鼠血清cTnT、BNP表达
ELISA检测结果显示，EAM模型组大鼠血清cTnT、BNP水平显著高于正常对照组(P＜0.01)；中药组合物中大剂量组、玉丹荣心丸组水平均显著低于EAM模型组(P＜0.01)、中药组合物小剂量组(P＜0.01)，三组间无显著差异。EAM模型组、中药组合物小剂量组无差异(P＞0.05)，见表2、3。
表2各组大鼠血清cTnT表达
Figure BDA0001194753050000151
Figure BDA0001194753050000152
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲▲P＞0.05，▲P＜0.01；与小剂量组比较☆P＜0.01；与中剂量组比较★P＞0.05；与大剂量组比较○P＞0.05。
表3各组大鼠血清BNP表达
Figure BDA0001194753050000153
Figure BDA0001194753050000154
Figure BDA0001194753050000161
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲▲P＞0.05，▲P＜0.01；与小剂量组比较☆P＜0.01；与中剂量组比较★P＞0.05；与大剂量组比较○P＞0.05。
综合上述结果可见，中药组合物大、中剂量干预后，能显著改善EAM模型大鼠的体重下降、减轻心肌细胞的坏死和炎性浸润、降低反映心肌损伤的cTnT和心衰定量标志物BNP的水平，且两个剂量组之间无显著性差异，提示该药物中剂量有较好地对抗EAM模型大鼠心肌损伤的效果。
试验例二 中药组合物对EAM模型大鼠Th细胞相关细胞因子的影响
1材料与方法
1.1实验样本
本实验的检测样本为试验例一制备的血清。
1.2主要试剂
ELISA试剂盒均由上海基尔顿生物科技有限公司提供，γ-IFN(批号：RA20594)，IL-2(批号：RA20132)，IL-4(批号：RA20088)，IL-6(批号：RA20069)。
1.2实验方法
1.2.1 ELISA法检测血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-6水平。
本研究应用上海基尔顿生物科技有限公司检测试剂盒，严格按照产品说明书进行操作。
2实验结果
2.1各组大鼠血清γ-IFN和IL-2的表达
EAM模型组血清γ-IFN、IL-2的表达显著高于正常对照组(P＜0.01)；中药组合物中大剂量组、玉丹荣心丸组血清γ-IFN、IL-2水平均显著低于EAM模型组(P＜0.01)，三组间未见显著差异，中药组合物小剂量组血清γ-IFN、IL-2表达与EAM模型组比较无差异(P＞0.05)，见表4、5。
表4各组大鼠血清γ-IFN表达
Figure BDA0001194753050000171
Figure BDA0001194753050000172
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲▲P＞0.05，▲P＜0.01；与小剂量组比较☆P＜0.01；与中剂量组比较★P＞0.05；与大剂量组比较○P＞0.05。
表5各组大鼠血清IL-2表达
Figure BDA0001194753050000173
Figure BDA0001194753050000181
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲▲P＞0.05，▲P＜0.01；与小剂量组比较☆P＜0.01；与中剂量组比较★P＞0.05；与大剂量组比较○P＞0.05。
2.2各组大鼠血清IL-4和IL-6的表达
EAM模型组血清IL-4、IL-6水平显著低于正常对照组(P＜0.01)。中药组合物中大剂量组、玉丹荣心丸组分别与EAM模型组相比较，IL-4、IL-6水平均有不同程度的升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。其中中药组合物大剂量组和玉丹荣心丸组升高幅度明显，二者之间无显著性差异(P＞0.05)；二者分别与中剂量组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。中药组合物小剂量组与EAM模型组比较无明显差异(P＞0.05)，见表6、7。
表6各组大鼠血清IL-4表达
Figure BDA0001194753050000182
Figure BDA0001194753050000183
Figure BDA0001194753050000191
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲▲P＞0.05，▲P＜0.01；与小剂量组比较☆P＜0.01；与中剂量组比较★P＜0.01；与大剂量组比较○P＞0.05。
表7各组大鼠血清IL-6表达
Figure BDA0001194753050000192
Figure BDA0001194753050000193
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲▲P＞0.05，▲P＜0.01；与小剂量组比较☆P＜0.01；与中剂量组比较★P＜0.01；与大剂量组比较○P＞0.05
综上可见，中药组合物大中剂量组能降低Th1细胞分泌的γ-IFN和IL-2，提高Th2细胞分泌的IL-4和IL-6水平，调节EAM模型大鼠出现的Th1/Th2失衡。对于Th1细胞的影响与玉丹荣心丸比较等效，且中药组合物大、中剂量组之间无显著差异。
试验例三 中药组合物对EAM模型大鼠IL-2/STAT5通路的影响
1材料与方法
1.1实验样本
本实验的检测样本为试验例一制备的石蜡切片。
1.2主要试剂
第一抗体免疫组化试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供，IL-2(批号：BS-4586R)，IL-2R(批号：BS-2545R)，STAT5(批号：BS-1142R)；第二抗体SP-9001试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，批号：SP-9001；DAB显色试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，批号：ZLI-9032。
1.2实验方法
1.2.1免疫组化法检测大鼠心肌组织IL-2、IL-2R和STAT5表达
本研究应用北京博奥森生物技术有限公司检测试剂盒，按照产品说明书进行操作。
1.2.1.2图象分析：
参考R.A.S.的IHS法，在每张切片中随机选取5个高倍镜(400×)视野，计算阳性细胞数百分比(A％)，阳性细胞数百分比在1％～10％的为1分，11％～50％为2分，51％～80％为3分，81％～100％为4分，再看阳性细胞显色强度(B)，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，HIS为A％与B的乘积，0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性。用美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus管理系统进行分析、读取数据、最后存盘。
2实验结果
2.1大鼠心肌组织IL-2、IL-2R的表达
免疫组化显示EAM模型组大鼠、中药组合物中剂量组、玉丹荣心丸组大鼠心肌组织IL-2、IL-2R表达增强，显著区别于正常对照组大鼠(P＜0.01)，中药组合物中剂量、玉丹荣心丸可抑制IL-2、IL-2R表达，与EAM模型组比较有显著差异(P＜0.05)，但两组间无明显差异(P＞0.05)，见表8、9。
表8大鼠心肌组织IL-2表达
Figure BDA0001194753050000211
Figure BDA0001194753050000212
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较☆P＞0.05。
表9大鼠心肌组织IL-2R表达
Figure BDA0001194753050000213
Figure BDA0001194753050000214
Figure BDA0001194753050000221
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较☆P＞0.05。
2.2大鼠心肌组织STAT5的表达
免疫组化显示EAM模型组大鼠心肌组织STAT5蛋白表达显著高于正常对照组大鼠(△P＜0.01)，提示自身免疫性心肌炎大鼠有JAKs/STAT5通路的激活，中药组合物中剂量及玉丹荣心丸组大鼠心肌组织STAT5蛋白表达明显低于EAM模型组(▲P＜0.01)，且两者无明显差异(★P＞0.05)，见表10。
表10大鼠心肌组织STAT5表达
Figure BDA0001194753050000222
Figure BDA0001194753050000223
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲P＜0.01；与中剂量组比较☆P＞0.05。
综上可知，EAM模型大鼠存在IL-2/STAT5通路的激活，实验证实中药组合物中剂量及玉丹荣心丸可以抑制IL-2/STAT5通路的激活，且两者等效。
试验例四 中药组合物对EAM模型大鼠心肌纤维化的影响
1材料与方法
1.1实验动物及饲养条件
雄性健康SPF级Lewis大鼠40只，6～7周龄，体重180～210g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养环境和条件同试验例一1.2。
1.2主要试剂和仪器
试剂：猪心肌肌球蛋白(美国Sigma公司)，货号：M0531；完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)，货号：F588；Masson试剂盒(北京索宝来科技有限公司)，货号：G1340；MMP-9一抗免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，货号：BS-4593R；TIMP-1一抗免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，货号：BS-4600R；第二抗体SP-9001试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，货号：SP-9001；DAB显色试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)，货号：ZLI-9032。
1.3实验方法
1.3.1造模及分组
抗原制备方法同试验例一，将40只SPF级雄性Lewis大鼠按随机数字表分为2组：正常对照组10只，模型组30只，将模型组大鼠按试验例一造模方法造模，成功后随机分成3组，即EAM模型组、中药组合物中剂量组和玉丹荣心丸组，每组10只。正常对照组处理同试验例一。
1.3.2药物制备及给药
药物制备同试验例一，中药组合物中剂量组每日给予中药组合物1ml/100g；玉丹荣心丸组每日给玉丹荣心丸混悬溶液1ml/100g；正常对照组和EAM模型组每日均给予蒸馏水1ml/100g，均采用灌胃法给药，日一次，连续给药56天。
1.3.3一般情况观察观察大鼠食欲、精神、活动情况情况。
1.3.4标本制备
免疫第56天，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠20mg/kg，麻醉后处死，立刻无菌取心脏，将心肌组织沿长轴剖开，每隔1cm取材，大小约1cm×1cm×0.3cm，置于10％中性福尔马林固定4～6h，水洗20～30min，常规按以下步骤脱水、透明、浸蜡：70％乙醇(35℃)90min、80％乙醇(35℃)90min、90％乙醇(35℃)90min、95％乙醇(35℃)90min、100％乙醇Ⅰ(35℃)60min、100％乙醇Ⅱ(35℃)60min、二甲苯Ⅰ透明20min、二甲苯Ⅱ透明35min、二甲苯Ⅲ透明35min、浸蜡(60℃)30min、浸蜡(60℃)75min、浸蜡(60℃)75min。常规石蜡包埋，4μm连续切片。用于后续的HE染色、Masson染色和免疫组化检测。
1.3.5HE染色步骤同试验例一。
1.3.6大鼠心肌组织Masson染色本研究采用北京索宝来科技有限公司试剂盒，按照说明书操作。
1.3.7免疫组化法测免疫心肌组织MMP-9/TIMP–1表达实验步骤同试验例三。
2实验结果
2.1一般状态观察
正常对照组大鼠均健康生长至免疫第56天，EAM模型组大鼠于免疫第28天死亡1只，中药组合物中剂量组和玉丹荣心丸组大鼠至免疫第56天无死亡。造模大鼠于免疫第7天开始出现进食及活动减少、互相撕咬、毛色晦暗、呼吸急促。至免疫第21天，EAM模型组大鼠上述表现尤为明显。
2.2各组大鼠心肌组织变化
HE染色可见正常对照组心肌组织结构正常，未见坏死、淋巴细胞浸润和纤维化改变；EAM模型组：部分心肌细胞变性坏死，间质显著水肿，多量炎细胞浸润，并有纤维细胞增生和纤维化形成；中药组合物中剂量组和玉丹荣心丸组变化相似，心肌细胞变性坏死轻度，均在心肌细胞间有小灶性炎性细胞浸润，纤维化不明显。
中药组合物中剂量组与玉丹荣心丸组心肌病理积分均低于EAM模型组(P＜0.05)，两组之间无明显差异(P＞0.05)，见表11。
表11各组病理积分比较表
Figure BDA0001194753050000251
Figure BDA0001194753050000252
注：与正常对照组比较，★P＜0.05；与EAM模型组比较，△P＜0.05；与中剂量组比较▲P＞0.05。
Masson染色显示EAM模型组大鼠发生弥漫性的心肌纤维化，中药组合物中剂量组心肌有少量灶性纤维化，玉丹荣心丸组比中药组合物中剂量组心肌成纤维细胞明显增多。
2.3大鼠心肌组织MMP–9、TIMP–1的表达
免疫组化显示EAM模型组大鼠心肌组织MMP–9表达较正常对照组大鼠显著降低，TIMP–1的表达较正常对照组大鼠明显升高，提示自身免疫性心肌炎心肌纤维化的发生是通过影响了MMP–9/TIMP–1的平衡而发生的。中药组合物中剂量及玉丹荣心丸可以上调MMP–9的表达，下调TIMP–1的表达，从而调节MMP–9/TIMP–1的比例，促使失衡趋于平衡，抑制了心肌纤维化，且中药组合物中剂量的作用明显优于玉丹荣心丸(P＜0.01)，见表12、13。
表12大鼠心肌组织MMP–9的表达
Figure BDA0001194753050000261
Figure BDA0001194753050000262
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较☆P＜0.01。
表13大鼠心肌组织TIMP–1的表达
Figure BDA0001194753050000263
Figure BDA0001194753050000264
Figure BDA0001194753050000271
注：与正常对照组比较，△P＜0.01；与EAM模型组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较☆P＜0.01。
上述实验结果可见中药组合物对于免疫56天的EAM模型大鼠有抗心肌纤维化作用，能上调心肌组织MMP–9的表达，下调其TIMP–1的表达，且效果优于玉丹荣心丸。
综上所述，本发明实施例提供的中药组合物以“解毒活血、益气养阴”为主。对于治疗毒瘀互结，气阴两虚证的患者儿童有显著疗效。从现代药理来讲，综合上述试验例，该中药组合物能显著改善免疫21天实验性自身免疫性心肌炎模型大鼠的体重下降、减轻心肌细胞的坏死和炎性浸润、降低反映心肌损伤的心肌肌钙蛋白T和心衰定量标志物脑钠素的水平，降低血清γ-干扰素、白介素-2水平，升高白介素-4、白介素-6水平，下调心肌组织白介素-2、白介素-2受体、信号转导及转录因子5的表达；对于免疫56天的实验性自身免疫性心肌炎模型大鼠有抗纤维化作用，上调心肌组织基质金属蛋白酶9的表达，下调其抑制因子1的表达。因此该中药组合物治疗小儿病毒性心肌炎具有针对性。该中药组合物的制备方法简单易行，可操作性强。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，其特征在于，按重量份数计，所述中药组合物由以下原料制成：黄芪15～50份，麦冬10～30份，板蓝根10～30份，丹参10～30份，及甘草5～10份；其中，所述黄芪为炙黄芪，所述甘草为炙甘草。
2.根据权利要求1所述的治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物，其特征在于，按重量份数计，所述黄芪为30份，所述麦冬为20份，所述板蓝根为20份，所述丹参为20份，及所述甘草为10份。
3.一种如权利要求1～2任意一项所述的治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于，其包括：用所述原料7～9倍重量的水煎煮所述原料1～3次，每次1～1.5小时，得到提取液，将所述提取液浓缩至在60℃时相对密度为1.05～1.20的浓缩液，将所述浓缩液与药用辅料混合。
4.根据权利要求3所述的治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于，浓缩所述提取液的步骤进行两次，将所述提取液第一次浓缩至在60℃时相对密度为1.06～1.12的所述浓缩液，第二次浓缩是在第一次浓缩得到的所述浓缩液中加入第一次浓缩得到的所述浓缩液1～3倍量的乙醇，静置20～24h，过滤，得到所述乙醇与滤液，将所述滤液浓缩至在60℃时相对密度为1.10～1.12的所述浓缩液，将第二次浓缩得到的所述浓缩液干燥、与所述药用辅料混合，制成所述中药组合物的丸剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。
5.根据权利要求3所述的治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于，得到所述浓缩液后，还包括加入所述浓缩液1～3倍量的乙醇，静置20～24h，滤过，得到所述乙醇与滤液，将所述滤液与所述药用辅料混合得到所述中药组合物的口服液。
6.根据权利要求5所述的治疗小儿病毒性心肌炎的中药组合物的制备方法，其特征在于，调节所述口服液的pH值至4.0-6.0，得到所述中药组合物的合剂。
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