CN101966324A

CN101966324A - 治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN101966324A
Application number: CN2010102875230A
Authority: CN
Inventors: 方鉴; 秦睿; 韩亚南
Original assignee: Dage International Medicine S & T (beijing) Co Ltd
Current assignee: Dage International Medicine S & T (beijing) Co Ltd
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2010-09-20
Publication date: 2011-02-09

Abstract

本发明涉及治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂及其制备方法，具体由原料药鳖甲、丹参、当归、黄芪、白术、金水宝、紫河车、胡黄连、莪术制成，本发明处方通过水煎煮和醇回流提取取活性成分，加入制药上可接受的常规赋形剂，以常规的制剂工艺制成所需的口服制剂。本发明中药复方制剂具有活血化瘀、软坚散结、益气养阴、清热降酶之功效，对慢性乙型肝炎肝纤维化具有较好的调理治疗作用。

Description

治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂及其制备方法，属于中药复方制剂领域。

背景技术

慢性乙型肝炎肝纤维化是指由于乙型肝炎病毒长期慢性刺激肝脏，使肝窦内肝星状细胞活化，胶原等细胞外基质成分代谢失衡，生成大于降解，促使肝脏ECM沉积与组织结构重构。肝纤维化是各种慢性肝病演变为肝硬化的共同病理过程，是慢性肝病治疗的可逆阶段，同时也是影响慢性肝病预后的重要环节，如果能阻止慢性乙型肝炎肝纤维化的进展，截断慢性乙型肝炎一肝纤维化一肝硬化一肝癌的发展过程，慢乙肝患者的预后将大为改观。

中医将慢性乙型肝炎肝纤维化主要分为5型：湿热中阻型、肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、瘀血阻络型、脾肾阳虚型。研究发现肝郁脾虚型处于肝纤维化形成的初期阶段，湿热中阻型肝纤维化形成活跃，肝肾阴虚和脾肾阳虚型处于中期阶段，瘀血阻络型最高。

目前，尚无理想的抗肝炎肝纤维化的西药，中医药依据丰富的临床经验，以整体观念、辨证论治为原则，通过活血化瘀、疏肝健脾、养阴清热、扶正祛邪、综合治法等治疗慢性乙型肝炎肝纤维化，有较好的疗效。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种安全、有效的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂。

本发明研究人员根据慢性乙型肝炎肝纤维化病理病变特点，选用了活血化瘀、软坚散结、益气养阴、清热降酶为主的治疗方法，根据这个原则，本发明中药复方所选用的药物配伍为鳖甲、丹参、当归、黄芪、白术、金水宝、紫河车、胡黄连、莪术。其中，各原料药之间的重量配比为鳖甲80-160份、丹参50-110份、当归30-70份、黄芪50-110份、白术30-90份、金水宝10-50份、紫河车30-70份、胡黄连50-110份、莪术10-40份；优选为鳖甲100-140份、丹参60-100份、当归40-60份、黄芪60-100份、白术50-70份、金水宝20-40份、紫河车40-60份、胡黄连70-90份、莪术15-30份；更优选为鳖甲120份、丹参80份、当归50份、黄芪80份、白术60份、金水宝30份、紫河车50份、胡黄连80份、莪术25份。

本发明中，所用的鳖甲优选为经炮制后的制鳖甲，紫河车优选为制紫河车。

本发明中，以鳖甲为君药，性甘、咸、寒，入肝、肾经，可滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结，用于肝肾阴虚诸证及症瘕积聚，从而达到标本兼治的疗效。本品含动物胶、骨胶原、角蛋白、17种氨基酸、碳酸钙、磷酸钙、碘、维生素D及锌、铜、锰等微量元素。

本发明中丹参、当归、黄芪三味共为臣药。

丹参是为理血之首药，其性苦、微寒，归心、心包、肝经。具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神的功效。《本草纲目》谓其“能破宿血，补新血”，即言其功善活血祛瘀、性微寒而缓，能祛瘀生新而不伤正的特点。丹参与鳖甲、莪术为伍消除慢性乙型肝炎肝纤维化各种血瘀证的同时，活血养血、清热凉血，可保护肝细胞不受损伤，促进肝细胞再生，抗肝纤维化。丹参主含脂溶性成分丹参酮I、丹参酮II A、丹参酮III等及水溶性成分丹参素、丹参酸甲、乙、丙和原儿茶酸、原儿茶醛等。

当归被誉为补血之圣药、活血行气之要药，其性甘、辛而温，归肝、心、脾经，具补血调经、活血止痛、润肠通便之功。本品主含中性油、酸性油成分、有机酸、糖类、维生素、氨基酸等。

黄芪性甘、微温，归脾、肺经，可健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌，改善各种气虚证，如脾气虚、肺气虚，以及气血两虚证。研究表明黄芪能促进机体代谢、抗疲劳、促进血清和肝脏蛋白质的更新，增强和调节机体免疫功能，促进干扰素系统，提高机体的抗病力，从根源上解除或缓解慢性乙型肝炎肝纤维化的各种症状。本品主要含苷类、多糖、黄酮、氨基酸、微量元素等。

本发明中白术、金水宝、紫河车、胡黄连为佐药。

白术为“脾脏补气健脾第一要药”，能促进细胞免疫功能、提升白细胞作用，保肝利胆，佐助黄芪缓解慢性乙型肝炎肝纤维化的气虚证。本品主含苍术酮、苍术内酯等挥发油，并含有果糖、菊糖、白术多糖、多种氨基酸及维生素A类成分等。

金水宝补益肺肾，秘精益气，治疗肝硬化之肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝酸软等症。经中国医学科学院药物研究所等单位研究证明，其化学成份与青海产天然虫草成分相似，含有腺嘌呤核苷、脲嘧啶核苷、甘露醇、麦角甾醇及天门冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸等19种氨基酸和锌、钾、锰、磷、硒等元素以及维生素B1、B2、维生素E等多种成分。

紫河车补肾益精、养血益气，为滋补强壮之要药，本品含有多种抗体、干扰素、激素、酶系统，参与机体内激素的代谢，增强机体抵抗力。

胡黄连性苦、寒，归肝、胃、大肠经，具退虚热、除疳热、清湿热之功，其提取物有明显的利胆作用，能明显增加胆汁盐、胆酸和脱氧胆酸的排泌，抗肝损伤而保肝。主要含有环烯醚萜苷及少量生物碱、酚酸及其糖苷等化学成分。

莪术归肝、脾经，苦泄辛散温通，具破血行气、消积止痛的功效，既入血分，又入气分，用量虽小，但可起到引经报使之能，故为使药。

本发明治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的药物，所制成的单元制剂形式为口服给药制剂，优选为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、酊剂或口服液中的任意一种，更优选为胶囊剂。

本发明中，制剂过程中，除原料药活性成分外，还含有制药上可接受的赋形剂。其中赋形剂为制成各种剂型所需要的赋形剂，填充剂如乳糖、糊精、微晶纤维、淀粉等；崩解剂如交联聚维酮，交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠等，粘合剂如淀粉浆、淀粉浆钠、羟丙甲纤维素、聚维酮等，表面活性剂如十二烷基磺酸钠，润滑剂如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇等，还可以有助悬剂、助溶剂、矫味剂、防腐剂等，具体选用什么赋形剂搭配，根据制剂而定，制成普通的制剂时，选用何种赋形剂是本领域技术人员根据现有技术就能知道的。

本发明的再一目的在于提供一种制备本发明所述治疗慢性乙型肝炎肝纤维化药物的制备方法，包括如下步骤：取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加4-8倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油2-4h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量6-15倍量的水煎煮提取2-4次，每次1-3h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩，与粉碎的细粉混匀，即得活性提取物，加入所需的辅料适量，再加入上述当归、白术、莪术三味的挥发油，按照常规的制剂工艺制成所需的剂型。

本发明中，制备原料药活性成分的方法还可以为：取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加4-8倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油2-4h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量6-12倍量30％-60％的乙醇回流提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩，与粉碎的细粉混匀，即得活性提取物，加入所需的辅料适量，再加入上述当归、白术、莪术三味的挥发油，按照常规的制剂工艺制成所需的剂型。

具体实施方式

以下从制备实施例来进一步说明本发明的制备方法，以下所列举的实施例，并不是为了限制本发明的具体实施方式，本领域的普通技术人员，可以很容易根据本发明的所允许的范围，做出合理的改变替换。

实施例1

处方原料药组成

鳖甲120g、丹参80g、当归50g、黄芪80g、白术60g、金水宝30g、紫河车50g、胡黄连80g、莪术25g。

称取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加6倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油3h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量10倍量40％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩成稠浸膏状态，干燥，与粉碎的细粉混匀，加入淀粉，混合均匀，用乙醇作为润湿剂制成软材，过筛制粒，置烘箱干燥得干燥颗粒，将挥发油喷入干颗粒中，并闷30min，然后灌装入0.4g规格的硬胶囊中，装500粒，密封，包装即得胶囊剂。

实施例2

处方原料药组成

鳖甲130g、丹参90g、当归50g、黄芪90g、白术70g、金水宝40g、紫河车60g、胡黄连90g、莪术30g。

称取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加6倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油3h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量10倍量40％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩成稠浸膏状态，干燥，与粉碎的细粉混匀，加入蔗糖粉、淀粉，混合均匀，用乙醇作为润湿剂制成软材，过筛制粒，置烘箱干燥，干燥颗粒喷入挥发油，并闷30min，加入硬脂酸镁，混匀，整粒，压成500片，分装，即得片剂。

实施例3

处方原料药组成

鳖甲110g、丹参70g、当归50g、黄芪70g、白术60g、金水宝30g、紫河车50g、胡黄连80g、莪术20g。

称取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加6倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油3h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量10倍量40％的乙醇回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩成稠浸膏状态，干燥，与粉碎的细粉混匀，加入淀粉，混合均匀，用乙醇作为润湿剂制成软材，过筛制粒，置烘箱干燥得干燥颗粒，将挥发油喷入干颗粒中，并闷30min，低温干燥、整粒，分装成150袋，每袋约5g，密封，包装即得颗粒剂。

以下从药理实施例来进一步说明本发明的有益效果，在下列实施例中，所用的制剂为实施例1处方制备得到的胶囊剂，在药品名称上我们称取为软肝胶囊。

1.软肝胶囊对大鼠ALT、AST的影响

实验采用ELISA试剂盒检测，该药对大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清天冬氨酸转氨酶(AST)的影响。ALT主要分布在肝细胞浆，反映了对肝细胞膜的影响；AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞线粒体(在肝细胞内专门负责提供细胞动力的“机器”)中。血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶是肝功能检测项目中最常使用的两项指标。

实验动物：Wistar大鼠，体重180～200g，质量合格，购于军事医学科学院动物中心。合格证号：SCXK-(军)2007-004。

动物模型的制备：建立Wistar大鼠，体重180～200g，除空白对照组外，其它各组动物皮下注射10％(体积分数)CCl₄(5mL/kg)，每周两次，连续3个月。

动物随机分为6组，每组20只大鼠。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。

(1).空白对照组：不给CCl4，灌胃等体积的蒸馏水；

(2).CCl4模型组：给CCl4，灌胃等体积的蒸馏水；

(3).CCl4+联苯双酯组：给CCl4，联苯双酯(20mg/kg·d)，作阳性对照；

(4).CCl₄+软肝胶囊低剂量组：给CCl₄，灌胃软肝胶囊0.54g/kg·d；

(5).CCl₄+软肝胶囊中剂量组：给CCl₄，灌胃软肝胶囊2.16g/kg·d；

(6).CCl₄+软肝胶囊高剂量组：给CCl₄，灌胃软肝胶囊4.32g/kg·d；

实验方法：于末次给药后24h股动脉取血，取血清测ALT、AST。

数据处理各组测定的实验数据以

表示，组间差异用t检验进行显著性分析。

表1复方软肝胶囊给药3个月大鼠血清ALT和AST指标结果

与模型组相比*P＜0.01，**P＜0.05

四氯化碳慢性肝损伤模型是研究抗肝炎药物保肝作用的一个常用的动物模型，是CCl₄进入人体后，经肝脏细胞色素P₄₅₀代谢为三氯甲基自由基攻击肝脏生物大分子，引起肝细胞损伤，导致血清ALT、AST升高。实验表明，复方软肝胶囊在给药3个月后，低、中、高剂量组(0.54，2.16，4.32g/kg)均能降低大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、血清天冬氨酸转氨酶(AST)的活力.

2.软肝胶囊对家兔清热作用的观察

实验动物：健康家兔，体重2.34±0.2kg(雌雄兼用.雌性者应无孕)一批.质量合格，购于北京科宇动物养殖中心。合格证号：SCXK-(京)2007-0003。在室温18～22℃环境下进行实验。

模型的制备：先禁食、编号(不禁水).待其安静后，将肛温表甩至35℃以下，涂少量液体石蜡于末端，轻轻插入家兔肛门约1cm，3min后.取出读数(测时避免动物挣扎)。选出体温在38.6～39.6℃家兔。取体温合格家兔35只，分别于耳静脉处注射副伤寒甲、乙三联菌疫苗1.1ml/kg致热，复制成家兔高热病理模型，注射后1h，以致热体温升高0.7℃以上者。

动物分组：按各家兔体温升高多少随机均分5组给药，每组7只，分别给以软肝胶囊低剂量组：0.28g/kg·d(6ml/kg)、软肝胶囊中剂量组：1.12g/kg·d(6ml/kg)；软肝胶囊高剂量组：2.24g/kg·d(6ml/kg)。复方柴胡泡剂阳性对照组：0.3g/kg(6ml/kg)，空白对照组：水(6ml/kg).各组家兔给药后，每隔2h测体温1次，连续测温6次.以观察软肝胶囊清热作用。

表1复方软肝胶囊对家兔清热作用的观察结果

与空白组相比*P＜0.01，**P＜0.05

结果显示，软肝胶囊大剂量组在给药后4h，8h体温明显下降，清热作用显著.与空白对照组比较P＜0.01.即使在给药后12h.其降温作用仍有明显差异(P＜0.05)。软肝胶囊小剂量组作用较弱，其降温幅度比大剂量组小(P＜0.05)，与空白对照组相比，仅在4h作用明显.有明显差异(P＜0.05)。复方柴胡泡剂解热作用最强.在4～8h其降温作用较空白对照组有显著性差异(P＜0.01).到12h仍有较明显的作用(P＜0.05)大剂量组软肝胶囊与复方柴胡泡剂比较，除降温强度较弱以外，在降温幅度及速度上类似。

3.软肝胶囊抗纤维化作用

实验动物：SPF级雄性SD大鼠40只(180～200g)，雌雄各半，质量合格，购于军事医学科学院动物中心。合格证号：SCXK-(军)2007-004。

肝纤维化动物模型的制备：以35mg/100ml的苯巴比妥溶液代替水，喂养10天；以鼠体重(0.15ul/g体重)增减确定给予四氯化碳的量，每周一次，每次最大量不超过250ul。

随机分为6组，每组16只。分别为正常对照组，四氯化碳模型组，软肝胶囊阻断组(0.25g/kg)，软肝胶囊阻断组(0.5g/kg)，软肝胶囊治疗组(0.5g/kg)，肝安干糖浆组(14.4g/kg)。

(1).正常对照组：不给CCl₄，每日灌胃软肝胶囊0.5g/kg。

(2).四氯化碳模型组：给CCl₄。

(3).软肝胶囊0.25g/kg阻断组：给CCl₄，每日灌胃软肝胶囊0.5g/kg。

(4).软肝胶囊0.5g/kg阻断组：给CCl₄，每日灌胃软肝胶囊0.5g/kg。

(5).软肝胶囊0.5g/kg治疗组：给CCl₄三个月，形成纤维化后，每日灌胃软肝胶囊0.5g/kg。

(6).肝安干糖浆14.4g/kg组：给CCl₄，每日灌胃肝安干糖浆14.4g/kg。

实验方法：

(1).HE染色

(2).将标本置于10％的福尔马林中固定24h，石蜡包埋，切片，进行苦味酸天狼星红一偏振光法：将0.5g天狼星红溶于100ml苦味酸溶液中，脱蜡，染色，常规脱水树胶封片，应用Zeiss偏振光法显微镜观察。

(3).可溶性胶原的提取与测定：将部分肝切除组织经丙酮脱脂后，用0.5M乙酸浸泡打碎成匀浆，4℃过夜，6000g4℃离心1h，取上清，测A₂₆₀及A₂₈₀值，以1.45 A₂₈₀-0.74 A₂₆₀换算成每毫克肝组织的蛋白量，采用ELISA方法，计算出胶原含量。

肝纤维化病例分级判定标准：按0-6分级

0级：肝组织正常，无胶原纤维增生；Ⅰ级：胶原纤维从汇管或中央静脉周围轻度向外延伸；Ⅱ级：胶原纤维延伸明显，但尚未连接包绕整个肝小叶；Ⅲ级：胶原纤维延伸连接包绕整个肝小叶；Ⅳ级：胶原纤维包绕分割肝小叶，正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，以大方形假小叶为主；V级：肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，大方形与小圆形假小叶各占50％；Ⅵ级：肝内不满小圆形假小叶，期间有粗大增生的胶原纤维。

实验结果：

(1).软肝胶囊对大鼠实验性肝纤维化的疗效

表1软肝胶囊对大鼠实验性肝纤维化作用

结果显示，与模型组相比均具有抗纤维化作用(P＜0.05)，而各剂量组与肝安干糖浆组比较也具有差异(P＜0.05)。

(2).苦味酸天狼星红一偏振光法结果

正常肝组织切片经苦味酸狼星红染色，在偏振光显微镜下可见，汇管区及狄氏间隙周围由浅红色I型胶原纤维和III型胶原纤维参半构成。模型组则粗大红色重叠的I型胶原成束排列，分割、包绕肝小叶。I型胶原明显多于III型胶原；肝安组55％同模型组，45％为粗大红色I型胶原纤维束，重叠少，延伸明显。软肝胶囊阻断组则为较细的红色I型胶原纤维束，多延伸，少重叠及连接；治疗组由大红色重叠的I型胶原纤维束包绕、分割肝小叶，少重叠分割，多延伸连接的纤维束。

(3).苦味酸天狼星红染色图像分析结果

表2复方软肝胶囊原纤维的影响

(4).软肝胶囊对肝组胶原含量的影响

表3软肝胶囊对肝组胶原含量的影响

如表3所示，模型组与其它各组相比，I、III型胶原量均显著增高(P＜0.05)，而肝安组不如软肝胶囊各组；软肝胶囊阻断组优于治疗组，具有显著性差异(P＜0.05)。

以上研究结果显示，软肝胶囊具有抗肝纤维化作用。阻断组给药6个月后发现肝纤维化程度明显减轻，且作用明显强于肝安组(P＜0.05)。治疗组较模型组纤维化程度明显减轻。苦味酸天狼星红一偏振光法结果同样表明，I型胶原含量增高不明显，使I/III胶原值处于相对正常。总之，软肝胶囊具有抗肝纤维化作用，具有阻断肝纤维化形成，溶解或吸收已形成的肝纤维化作用。

4.软肝胶囊对贮脂细胞增殖及合成胶原蛋白的影响

肝纤维化是以Disse腔中大量胶原蛋白沉积为特点的，目前认为贮脂细胞(FSCs)是Disse腔中胶原蛋白的主要来源。

实验动物：二级Wistar大鼠，雄性，体重180～200g，质量合格，购于军事医学科学院动物中心，合格证号：SCXK-(京)2007-0003。

实验药材为软肝胶囊，每粒重0.5g。

随机分为6组，分别为正常对照组，四氯化碳模型组，软肝胶囊阻断组(0.25g/kg)，软肝胶囊阻断组(0.5g/kg)，软肝胶囊治疗组(0.5g/kg)，肝安干糖浆组(14.4g/kg)。

(1).正常对照组：不给CCl₄，每日灌胃软肝胶囊0.5g/kg。

(2).四氯化碳模型组：给CCl₄。

实验方法：

阻断组治疗6个月，治疗组给药3个月后，部分动物在0.3％戊巴比妥钠麻醉下，剖腹，门静脉插管，按Friedman等分离FSC的方法，分离，纯化FSC，将获得纯度95％以上的FSCs，悬浮于199完全培养基中，以1×10⁶cells/ml，接种在35mm培养板中，每孔1.5ml，置36.5℃，湿度96％，5％CO₂的培养箱中进行原代培养，按时换液。FSCs特点是在光镜下胞浆下有大量脂滴，紫外光328nm照射下，细菌呈绿色自发光，Desmin染色阳性。

(1).贮脂细胞增殖的测定

利用³H-胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR，原子能研究院产品)渗入量，测定FSCs增殖程度。 FSCs原代培养48小时后，脉冲加入³H-TdR(1.0μci/ml)培养18小时，终止渗入，将FSCs转移到醋酸纤维膜上，用β-液烁测cpm，以cpm/well表示DNA复制。

(2).脯氨酸及羟脯氨酸的测定

利用³H-脯氨酸(³H-Pro，原子能研究院产品)³H羟脯氨酸(³H-Pro)分别渗入胶原和非胶原蛋白的合成过程，观察胶原与非胶原合成情况，将FSCs原代培养48小时后，脉冲加入 ³H-HPro(10.0μci/ml)培养18小时，终止渗入。收集培养液和细胞。用10％TCA沉淀蛋白质。采用Rojkind以等方法分离³H-Pro及³H-HPro，经β-液闪测cpm；用Cesoar方法测每孔细胞中DNA量，以cpm/μgDNA和cpm/well表示³H-HPro不同水平的渗入量。

实验结果：

(1).软肝胶囊对FSCs贮脂细胞增殖的影响

模型组与各组比较，FSCs增殖明显增高(P＜0.01)；而各组间比较，软肝胶囊0.25g/kg和0.5g/kg阻断组对FSCs有抑制作用(P＜0.01)；而软肝胶囊治疗组亦降低(P＜0.05)。

(2).软肝胶囊对合成胶原的影响

表1软肝胶囊对FSCs合成胶原的影响

如表1所示，模型组与其它各组相比，FSCs合成胶原的能力显著增强(P＜0.05)；各组相互比较，软肝胶囊0.25g/kg和0.5g/kg阻断组FSCs合成胶原能力均降低(P＜0.01)，而软肝胶囊治疗组及肝安组均高于阻断组(P＜0.05)。

本实验研究结果表明，各组对FSCs增殖有不同程度的影响，并以软肝胶囊阻断组最强，而治疗组及肝安组较弱。证实了软肝胶囊有明确的抗肝纤维化作用。

5.软肝胶囊对胶原代谢的影响实验

实验药材为软肝胶囊，每粒重0.5g。

动物模型的制备：以35/mg100ml的苯巴比妥钠溶液代替常水，喂养10天；以大鼠(0.15ul/g)体重增减确定给予四氯化碳的量，每周一次，每次最大量不超过250ul

随机分为6组，每组10只。分别为正常对照组，四氯化碳模型组，软肝胶囊阻断组(0.25g/kg)，软肝胶囊阻断组(0.5g/kg)，软肝胶囊治疗组(0.5g/kg)，肝安干糖浆组(14.4g/kg)。

(1).正常对照组：不给CCl₄，每日灌胃软肝胶囊0.5g/kg。

(2).四氯化碳模型组：给CCl₄。

(5).软肝胶囊0.5g/kg治疗组：给CCl₄三个月，形成纤维化后，每日灌胃软肝胶囊0.5gkg。

检测指标：治疗前后均分别采血，剖腹进行肝脏切除，分离血清，-20℃保存，进行检测血清中的I型和III型胶原水平，胶原酶活力及计算I/III型胶原值；肝组织中I型和III型胶原含量，胶原酶活力及计算I/III型胶原值。

实验方法：

(1).血清胶原测定：采用ELISA方法。I、III型多克隆抗体(中国预防医学科学院劳动卫生与职业研究所提供)。

(2).肝组织胶原测定：将肝组织37℃烤干，称取等量肝组织，0.5m醋酸抽，提，6000g，4℃离心一小时，取上清，测A₂₆₀及A₂₈₀值，以1.45A₂₆₀-0.74A₂₆₀，得出蛋白量，据ELISA法测出I、III型胶原量，即可得出没毫克肝组织蛋白中胶原的含量。

(3).胶原酶活力测定：采用胡柴玲等方法。

①.纯化胶原酶(Sigma)：用SepharexG-200(Sigma)层析，在278nm消光系数为1.76，分子量为80-90KD。

②.制备胶原酶底物：用NaB³H4(Boston)标记鼠尾胶，制成³H-鼠尾胶，用0.05MTris-0.05MCaCL₂缓冲液稀释底物至0.2％。

③.胶原酶测定：取肝悬液(1mg湿肝/ml)及血清各100μl，加0.1％胰蛋白酶10μl，37℃孵育100min，加5mM马来亚基酰胺100μl，加³H-鼠尾胶1ml，37℃孵育20小时，用0.5％BSA及2％TcA沉淀鼠尾胶，4℃放置30min，上清液移入5ml闪烁瓶中，进行β-液闪烁计数。

实验结果：

(1).软肝胶囊对血清I、III型胶原量的影响

表1软肝胶囊对血清Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响

注：与模型组相比，□□P＜0.01、□P＜0.05，用药前后相比，△△P＜0.01、△P＜0.05

由表1可见，与模型组相比，软肝胶囊阻断组胶原减少；肝安组及模型组胶原高于治疗前(P＜0.01)；治疗组反而减少(P＜0.05)，对III型胶原量无明显改变。

(2).软肝胶囊对肝组织I、III型胶原量的影响

表2软肝胶囊对肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响

表2显示，肝安组与模型组，用药后较用药前I型胶原量显著增高(P＜0.01)；而治疗组减少。与模型组相比，治疗组及阻断组均有减少(P＜0.05)。与模型组相比，III型胶原量略有增高但无差异。

(3).软肝胶囊对血清及肝组织中I/III型胶原值的影响

表3软肝胶囊对血清及肝组织中Ⅰ/Ⅲ型胶原值的影响

表3显示，肝安组和模型组，治疗后明显高于治疗前(P＜0.05)；治疗组与模型组相比能够降低胶原I/III值(P＜0.05)。

(4).软肝胶囊对肝组织胶原酶活力的影响

表4软肝胶囊对肝组织胶原酶活力的影响

如上表4所示，软肝胶囊阻断组，治疗后胶原酶活力均增高(P＜0.01)；治疗组也增高但不如阻断组明显(P＜0.05)，而模型组与肝安组均有不同程度的降低(P＜0.05)。实验研究表明，血清和肝组织胶原水平有较好的一致性，总之，软肝胶囊对肝纤维化的胶原代谢有显著的影响作用。

Claims

1.一种治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是由下列重量配比的原料药制成：

鳖甲80-160份丹参50-110份当归30-70份黄芪50-110份

白术30-90份金水宝10-50份紫河车30-70份胡黄连50-110份

莪术10-40份

2.根据权利要求1所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是由下列重量配比的原料药制成：

鳖甲100-140份丹参60-100份当归40-60份黄芪60-100份

白术50-70份金水宝20-40份紫河车40-60份胡黄连70-90份

莪术15-30份

3.根据权利要求1所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是由下列重量配比的原料药制成：

鳖甲120份丹参80份当归50份黄芪80份

白术60份金水宝30份紫河车50份胡黄连80份

莪术25份

4.根据权利要求1-3中任意一权利要求所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是所述的鳖甲为经炮制后的制鳖甲，紫河车为制紫河车。

5.根据权利要求1-3中任意一权利要求所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是所述的制剂的单元给药形式为口服制剂。

6.根据权利要求5所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是所述的口服制剂为口服片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、酊剂或口服液中的任意一种。

7.根据权利要求6所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂，其特征是所述的口服制剂为胶囊剂。

8.一种制备权利要求1-3中任意一权利要求所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂活性成分的方法，其特征是包括如下步骤：取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加4-8倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油2-4h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量6-15倍量的水煎煮提取2-4次，每次1-3h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩，与粉碎的细粉混匀，即得活性提取物，加入所需的辅料适量，再加入上述当归、白术、莪术三味的挥发油，即得活性提取物。

9.一种制备权利要求1-3中任意一权利要求所述的治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的中药复方制剂活性成分的方法，其特征是包括如下步骤：取处方量的鳖甲、金水宝、紫河车，粉碎成细粉，待用；取处方量的当归、白术、莪术加4-8倍量的水浸泡30min，然后用挥发油提取器提取挥发油2-4h，挥发油另器储存，药渣过滤，滤液待用；取处方量的丹参、黄芪、胡黄连加入提取挥发油后的药渣，以原料药重量6-12倍量30％-60％的乙醇回流提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并所有滤液，滤液减压浓缩，与粉碎的细粉混匀，即得活性提取物，加入所需的辅料适量，再加入上述当归、白术、莪术三味的挥发油，即得活性提取物。