CN111588763B

CN111588763B - 血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法

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Publication number: CN111588763B
Application number: CN202010392766.4A
Authority: CN
Inventors: 唐宏
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Current assignee: Individual
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN111588763A

Abstract

本发明涉及中药领域，即一种血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法，用于治疗脑血栓。由黄芪，地龙，土鳖虫，水蛭，桃仁，川芎，橘红，当归，鸡血藤按规定量制成，具有较好的治疗心脑血管疾病的功效。实验结果显示，血栓通脉胶囊含药血清可显著提高H₂O₂（过氧化氢）处理的HUVEC的细胞活力，降低LDH、MDA、ROS含量，并提高GSH（谷胱甘肽）、NO（一氧化氮）、SOD（超氧化物歧化酶）含量，提示血栓通脉胶囊含药血清具有一定的保护血管内皮细胞免受氧化损伤的能力。血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠体内及体外血栓形成，且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组效果好于低剂量组。

Description

血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法

技术领域

本发明涉及中药领域，即一种血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法，用于治疗脑血栓。

背景技术

在现有技术中，心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高血压、动脉粥样硬化、高脂血症、血液粘稠等因素导致的心脏、大脑及全身组织发生的出血性或缺血性疾病。心脑血管疾病在世界范围内都是死亡的主要原因。根据目前的流行病学资料显示，预计到2020年，尽管导致死亡的疾病顺序将发生重大变化，冠心病和脑出血将仍然是人类的第一和第二大致死因素。尽管学界对这些疾病的认识已经有了长足的进展，但传统药物的治疗作用并没有取得令人满意的结果。然而，最近的研究表明，天然药物和传统中医草药是预防治疗心脑血管疾病的潜在候选药物。

我国心血管疾病的相关防治工作已取得初步成效，但与此同时，也面临着新的挑战。总体来说，我国心血管疾病的患病率及死亡率仍处于上升阶。我国心血管疾病的死亡率位居首位，远高于肿瘤及其它疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上，特别是农村近几年来心血管疾病的死亡率持续高于城市。中西医联合治疗，可显著降低心脑血管疾病患者的猝死、心肌梗死、脑卒中等情况的发生，明显改善患者生存质量。心血管疾病负担日渐加重，已成为我国的一个重大公共卫生问题，防治心血管病，研究开发新的针对心血管疾病的特效中药复方制剂刻不容缓（《中国心血管病报告2018》概要[J].中国循环杂志,2019.03）。治疗心脑血管疾病中药种类繁多，疗效各异。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法。采用现代医学研究手段，对血栓通脉胶囊组方、制备工艺、质量标准以及体内外的功能研究，为进一步的生产及临床应用打下基础。

本发明的技术解决方案是：血栓通脉药物，其特征在于其药用有效成分由以下重量份数的原料药制成：黄芪25－35份，地龙8－12份，土鳖虫8－12份，水蛭8－12份，桃仁15－25份，川芎12－18份，橘红12－18份，当归12－18份，鸡血藤12－18份。优选剂型为胶囊，即血栓通脉胶囊。

优选，血栓通脉胶囊，其特征在于其药用有效成分由以下重量份数的原料药制成：黄芪30g，地龙10g，土鳖虫10g，水蛭10g，桃仁20g，川芎15g，橘红15g，当归15g，鸡血藤15g。浸膏与辅料配比为6:4。

方解：君药：黄芪，补气固表，利尿脱毒。臣药：地龙：清热，平肝，通络。土鳖虫：破血逐瘀。水蛭：抗凝血，降血脂。桃仁：活血祛瘀，润肠通便。川芎：活血行气，祛风止痛。佐药：橘红：理气宽中，燥湿化痰。当归：补血活血，润肠通便。鸡血藤：行血补血，舒筋活络。脑血栓形成属于中医药学脑卒中范畴，患者多为中老年人。病机为本虚标实，元气亏虚，气虚行动无力，痰浊，淤血互结，内阻脉络，气血运行受阻，肢体筋脉失于濡养。痰浊与淤血互相依存，由淤血必有痰浊，有痰浊必有淤血。因此，治疗应以补气活血通络化痰开窍为法。血栓通脉汤，以补阳还五汤为主，方中重用黄芪大补元气，气旺则血行，血行则瘀除。虫类药破血逐瘀、当归活血养血、橘红化痰、鸡血藤通络、全方体现活血化瘀、舒经通络，以达到治疗患者心脑血管疾病，延缓心脑血管血栓形成的作用。

制备方法：栓通脉药物的制备方法，用8倍溶剂量的70%乙醇，先浸泡药材过夜，再加热回流1h，提取2次，将药液过滤，而后旋转蒸发仪蒸发药液，待药液略呈粘稠状，将药液装入蒸发皿中，75℃水浴蒸干，再55℃减压烘干制成浸膏；浸膏粉与辅料淀粉按6:4比例混合，再喷以适量85%乙醇润湿，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒，40℃干燥，再过40目筛，去除粉尘，灌装，包装，即得血栓通脉胶囊。

血栓通脉药物的含量测定方法，其特征在于该方法中包括如下任一种或几种组合：

（1）黄芪甲苷的含量测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），使用蒸发光散射检测器检测，流动相选择乙腈-水（35:65），流动相流速为1.0ml/min，柱温40℃，漂移管温度40℃。精密称定黄芪甲苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.05μg/μl，0.10μg/μl ，0.25μg/μl，0.50μg/μl，0.75μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量（μg）作为横坐标，绘制标准曲线。得到黄芪甲苷线性回归方程y=2219906.5685x-741089.8761，相关系数R2=0.9981，表明其在0.5-7.5μg之间线性关系良好。

（2）阿魏酸的含量测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择乙腈-水（17:83），检测波长为316nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃。精密称定阿魏酸标准品，加甲醇配制成浓度为0.10μg/μl、0.20μg/μl、0.51μg/μl、0.71μg/μl、1.00μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到阿魏酸线性回归方程y=298925x-47829，相关系数R²=0.9983，表明其在1.0-10.0μg之间线性关系良好。

（3）橙皮苷含量测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择甲醇-水（40:60），检测波长为284nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃。精密称定橙皮苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.02μg/μl、1.53μg/μl、2.01μg/μl、3.01μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到橙皮苷线性回归方程y=298067x-169274，相关系数R²=0.9992，表明其在5.0-30.1μg之间线性关系良好。

（4）苦杏仁苷含量测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择甲醇-水（20:80），检测波长为210nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃。精密称定苦杏仁苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.01μg/μl、1.52μg/μl、2.00μg/μl、3.02μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到苦杏仁苷线性回归方程y=565333x-613222，相关系数R²=0.9972，表明其在5.0-30.2μg之间线性关系良好。

功效：补气活血，通络化痰，破血逐瘀。

药物剂型不限于胶囊，按上述各药用原料与制药上常用的药用载体，如赋形剂或辅料可以混合制成片剂、颗粒剂、散剂、丸剂或其它常规制剂。

本发明的优点是：1、血栓通脉胶囊是自主研发的天然药物制剂，具有较好的治疗心脑血管疾病的功效，具有广阔的市场前景。2、本实验首先以乙醇浓度、溶剂量、提取时间和提取次数为影响因素考察项目，设计L₉（3⁴）正交试验表，经实验验证，确定最佳提取工艺，即乙醇浓度70%，溶剂倍量8倍，提取次数2次，提取时间1h。考虑到服用及携带方便，将药物改良为胶囊剂。综合考量辅料种类、浸膏与辅料配比、堆密度等因素，最终确定选择淀粉为辅料，浸膏与辅料配比为6:4，以85%乙醇作为润湿剂，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒，40℃干燥，再过40目筛，去除粉尘，得到颗粒，灌装胶囊即得（见实验例1）。3、本研究以《中国药典》2015版作为依据，选取黄芪甲苷、阿魏酸、橙皮苷、苦杏仁苷4种有效成分，建立了稳定、高效、方便、快捷的质量标准。4、实验结果显示，血栓通脉胶囊含药血清可显著提高H₂O₂（过氧化氢）处理的HUVEC的细胞活力，降低LDH、MDA、ROS含量，并提高GSH（谷胱甘肽）、NO（一氧化氮）、SOD（超氧化物歧化酶）含量，提示血栓通脉胶囊含药血清具有一定的保护血管内皮细胞免受氧化损伤的能力（见实验例2）。5、实验结果显示，与对照组相比，血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠体内及体外血栓形成，且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组效果好于低剂量组。同时血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠血小板聚集，且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组抑制率甚至可达到77.56%。与对照组相比，血栓通脉胶囊可显著延长昆明小鼠的出血时间及凝血时间，随给药剂量的提高，出血时间显著延长，高剂量组效果最好，而低剂量组的凝血时间要长于高剂量组。与模型组相比，血栓通脉胶囊可显著下调SD大鼠血清中TXB2、ET-1含量，而提高6-Keto-PGF1α含量。以上结果均提示血栓通脉胶囊可能增强SD大鼠及昆明小鼠的抗栓能力（见实验例3）。6、通过对血栓通脉胶囊黄芪组分进行薄层鉴别和高效液相检测，再按照《中国药典》2015版四部制剂通则中胶囊剂项下的要求，进行相应项目检查，建立质量标准。结果显示：供试品、对照药材/对照标准品，在薄层色谱上显现的斑点位置相同，而阴性对照样品在相同的位置无对应斑点；供试品中各有效成分含量较高；胶囊剂项下的水分检测、崩解时限、装量差异等项目均符合药典规定。按照《中国药典》2015版四部通则9001胶囊剂项下检测标准，进行影响因素试验、加速试验检测，结果表明血栓通脉胶囊稳定性良好。6、经血栓通脉胶囊治疗脑血栓累计50例临床观察：治愈率48％，显效率88％，有效率98％，无效率2％。疗效显著。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

附图说明

图1 黄芪甲苷标准曲线。

图2 制剂中黄芪紫外灯（365nm）下TLC鉴别图谱。

图3 阿魏酸标准曲线。

图4 橙皮苷标准曲线。

图5 苦杏仁苷标准曲线。

图6 大鼠腹主动脉分离。

图7 HUVEC在不同浓度H₂O₂处理下细胞活力比较。

图8 不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC细胞活力的影响。

图9不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC LDH释放量的影响。

图10不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中GSH含量的影响。

图11不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中NO含量的影响。

图12不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中SOD含量的影响。

图13不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中MDA含量的影响。

图14血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中PARP、p-IRE1、IRE1、p-eif2α、eif2α、cleaved caspase-3和GAPDH表达水平的影响。

图15不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中PARP、p-IRE1、IRE1、p-eif2α、eif2α、 cleaved caspase-3和GAPDH表达水平的影响。

图16 是FeCl₃诱导SD大鼠颈总动脉血栓形成。

图17 是血栓通脉胶囊对FeCl₃诱导SD大鼠颈总动脉血栓重量的影响。

图18 血栓通脉胶囊对SD大鼠体外血栓形成血栓重量的影响。

图19血栓通脉胶囊对SD大鼠血小板聚集的影响。

图20 血栓通脉胶囊对昆明小鼠出血时间的影响。

图21 血栓通脉胶囊对昆明小鼠凝血时间的影响。

图22 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中TX2含量的影响。

图23 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中6-Keto-PGF1α含量的影响。

图24 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中ET-1含量的影响。

具体实施方式

实施例1

血栓通脉胶囊，其药用有效成分由以下重量份数的原料药制成：黄芪30g，地龙10g，土鳖虫10g，水蛭10g，桃仁20g，川芎15g，橘红15g，当归15g，鸡血藤15g。确定淀粉为辅料，浸膏与辅料配比为6:4，以85%乙醇作为润湿剂，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒，40℃干燥，再过40目筛，去除粉尘，得到颗粒，灌装胶囊即得。

实验例1

血栓通脉胶囊制备工艺、疗效、含量鉴别确定

1.1实验材料

1.1.1仪器与设备，见表1

1.1.2试剂，见表2

1.1.3 药材

本实验药材药材标准均按照《中国药典》2015版各药材项下选定。

1.1.4 液相条件

黄芪甲苷：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择乙腈-水（35:65），蒸发光散射检测器，流速为1.0ml/min，柱温40℃，漂移管温度40℃。

阿魏酸：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择乙腈-水（17:83），检测波长316nm，流速为1.0ml/min，柱温35℃。

橙皮苷：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择甲醇-水（40:60），检测波长284nm，流速为1.0ml/min，柱温35℃。

苦杏仁苷：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱（5μm，4.6×250mm），流动相选择甲醇-水（20:80），检测波长210nm，流速为1.0ml/min，柱温35℃。

2.1制备工艺研究

2.1.1加热回流提取试剂研究

按照处方比例称取药材，用10倍溶剂量的水或80%乙醇浸泡药材过夜，加热回流2h，提取液过滤，旋转蒸发仪蒸发提取液，待提取液略呈粘稠状，将提取液装入蒸发皿中，75℃水浴蒸干，再55℃减压烘干制成浸膏。

按《中国药典》2015版黄芪项下黄芪甲苷提取方法，精确称取1g浸膏粉，用25ml甲醇浸泡过夜，加热回流4h，快速滤纸滤过，将滤液蒸发至干，残渣中加入10ml水，并稍微加热使其溶解，再用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次25ml，合并上层正丁醇液，再用氨试液充分洗涤2次，每次25ml，弃去氨液，将正丁醇液蒸发至干，残渣中加入5ml水使其溶解，室温放置至溶液变凉，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5cm，柱高为35cm），以150ml蒸馏水洗脱柱子，弃去洗脱液，再用40%乙醇120ml继续洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇250ml洗脱，收集洗脱液，蒸发至干，残渣中加入1ml甲醇使其溶解。取样品适量，经HPLC法测定黄芪甲苷含量。结果测得80%乙醇提取液中的黄芪甲苷含量约为水提液中1.5倍，故采用乙醇作为加热回流提取试剂。

2.1.2血栓通脉胶囊乙醇加热回流提取工艺研究

按照处方比例称取药材，按表3相应的因素水平乙醇加热回流提取，合并提取液，将提取液过滤，旋转蒸发仪蒸发提取液，待提取液略呈粘稠状，将提取液装入蒸发皿中，75℃水浴蒸干，再55℃减压烘干制成浸膏。取适量样品，制备黄芪甲苷提取液，经HPLC法测定样品中黄芪甲苷含量,结果见表4、5。

从直观分析中偏差比较可知，各因素对黄芪甲苷提取率的影响程度为溶剂量>乙醇浓度>提取时间>提取次数，溶剂量对提取结果影响最大，其次为乙醇浓度和提取时间，提取次数的影响最小，综合考虑生产成本、生产耗时等方面影响，确定最佳提取条件为：乙醇浓度70%，溶剂倍量8倍，提取次数2次，提取时间1h。

2.1.3 最佳提取工艺的验证

按照处方比例称取药材，按正交试验得到的最佳工艺条件提取，制备3批供试品，取适量样品，测定浸膏中黄芪甲苷的含量。

精密称定黄芪甲苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.05μg/μl，0.10μg/μl ，0.25μg/μl，0.50μg/μl，0.75μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量（μg）作为横坐标绘制标准曲线。得到黄芪甲苷线性回归方程y=2219906.5685x-741089.8761，相关系数R²=0.9981，表明其在0.5-7.5μg之间线性关系良好，标准曲线如图1。

代入三批（20180807、20180815、20180902）供试品相应峰面积，求得每1.00g浸膏粉中黄芪甲苷含量分别为55.083μg、56.167μg、52.663μg 。三次试验所测得的黄芪甲苷含量相近，证明本提取工艺可行，效果稳定（见图1），图1 是黄芪甲苷标准曲线。

2.2 制粒灌装工艺研究

2.2.1 制粒辅料研究

分别称取5.00g血栓通脉浸膏粉，与5.00g辅料（蔗糖、乳糖、糊精、淀粉）按1:1比例混合，再喷以适量85%乙醇润湿，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒，40℃干燥。再过40目筛，去除粉尘，得到血栓通脉颗粒。比较不同辅料对制粒的影响，结果见表6。

一般休止角小于40°可满足胶囊剂生产的流动性要求，因此蔗糖、乳糖、淀粉三种辅料均满足要求，考虑到制粒难易度及成本原因，故选用淀粉作为辅料。

2.2.2 浸膏粉与辅料配比研究

在确定选择淀粉作为辅料后，尝试增加浸膏粉占比，提升最终所制颗粒中药物成分含量，减少服药剂量。浸膏粉与辅料配比对制粒的影响，结果见表7。

休止角小于40°可满足胶囊剂生产的流动性要求，综合产率，选择浸膏粉与淀粉比例6:4作为生产配比。

2.2.3 堆密度测定

精确称定三批（20180807、20180815、20180902）样品适量，将内容物颗粒置于25ml量筒内,将量筒上下振动5次,测定颗粒体积。己知颗粒质量m和体积V，根据公式ρ=m/V，计算颗粒的堆密度，结果见表8。

颗粒的平均堆密度为0.4713g/ml，可使用0号胶囊进行填充。

2.3 血栓通脉胶囊的质量标准研究

2.3.1 质量检测

按照筛选出的最佳提取方式、浸膏辅料配比制成胶囊，需进一步进行质量研究，包括性状、装量差异、水分、崩解时限，控制制剂质量。

2.3.2 性状检查

外观整洁，无变形、黏连、囊壳破裂等情况，内容物为棕黑色颗粒，气微，味苦，略带腥味。

2.3.3 水分检查

按照《中国药典》2015版四部通则0832烘干法测定制剂含水量，分别精确称取三批（20180807、20180815、20180902）样品2.00g，置于干燥至恒重的蒸发皿中，均匀铺开，精确称定总重。在105℃条件下恒温干燥5h，待样品冷却至室温，进行精密称定，直至两次称重的差异≤5mg。根据供试品重量的失去量计算含水量（%），结果见表9。

测定结果显示制剂的平均含水量为5.18%，小于药典规定的9%，符合要求。

2.3.4 装量差异

按照《中国药典》2015版四部通则0103胶囊剂项下，对三批（20180807、20180815、20180902）样品进行装量差异检查，每批取10粒胶囊，分别称定每粒胶囊内容物重量，结果见表10。

结果显示三批（20180807、20180815、20180902）样品的平均装量差异均小于药典规定的±10%。

2.3.5 崩解时限

按照《中国药典》2015版四部通则092项崩解时限检查法下，调节崩解仪水温至37±1℃后，对三批（20180807、20180815、20180902）样品进行崩解时限检查，每批取6粒胶囊放置于筛网吊篮中，加盖挡板，开启仪器，结果见表11。

结果显示，三批（20180807、20180815、20180902）胶囊均在13min内完全崩解，小于药典规定的30min，符合要求。

2.3.6 影响因素试验

按照《中国药典》2015版四部通则9001胶囊剂项下影响因素试验检测标准，取三批（20180807、20180815、20180902）样品，分别在高温（60℃）、高湿（相对湿度92.5%）、光照（4500lx±500lx）条件下放置10天。在第0天、第5天、第10天分别取样，检测各项指标变化，结果见表12-14。

比较了水与乙醇对血栓通脉方提取的效果，以黄芪甲苷作为考察指标，结果显示乙醇的提取效果比水提效果更佳。之后通过正交试验，确定了最佳提取条件为：乙醇浓度70%，溶剂倍量8倍，提取次数2次，提取时间1h。考虑到方便携带，便于吸收，故采用胶囊剂型对药物进行改造，以休止角作为考察指标，确定了浸膏与辅料（淀粉）比例为6:4。以《中国药典》2015版作为依据，对血栓通脉胶囊进行了性状检查、水分检查、装量差异、崩解时限、影响因素试验等质量检测。

2.4 薄层色谱鉴别药材

2.4.1 黄芪薄层鉴别（其它原料薄层鉴别省略）

按照《中国药典》2015版一部黄芪项下鉴别方法，取浸膏粉1g，加乙醇15ml，加热回流20min，快速滤纸过滤，将滤液蒸发至干，残渣中加入7.5ml 0.3%NaOH溶液使其溶解，再次过滤，滤液用稀盐酸调节pH值至5-6，用乙酸乙酯7.5ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干。残渣中加入1ml乙酸乙酯使其溶解，作为供试品溶液。用以上方法制作对照药材、阴性对照溶液。吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（10:1）作为展开剂，展开样品，取出硅胶板，吹风机吹干，置于氨蒸气中熏后，置紫外光灯（365nm）下检视，结果见图2(图2中，1、2、3是黄芪供试品溶液，4是黄芪标准药材，5是阴性对照)。图2是制剂中黄芪紫外灯（365nm）下TLC鉴别图谱。

2.5 有效成分含量测定

2.5.1 黄芪甲苷含量测定见2.1.3。

2.5.2 阿魏酸含量测定

精密称定阿魏酸标准品，加甲醇配制成浓度为0.10μg/μl、0.20μg/μl、0.51μg/μl、0.71μg/μl、1.00μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量（μg）作为横坐标绘制标准曲线。得到阿魏酸线性回归方程y=298925x-47829，相关系数R²=0.9983，表明其在1.0-10.0μg之间线性关系良好，阿魏酸标准曲线如图3。

代入三批（20180807、20180815、20180902）供试品相应峰面积，求得每1g浸膏粉中阿魏酸含量为10.461mg、11.014mg、10.659mg。

2.5.3 橙皮苷含量测定

精密称定橙皮苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.02μg/μl、1.53μg/μl、2.01μg/μl、3.01μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量（μg）作为横坐标绘制标准曲线。得到橙皮苷线性回归方程y=298067x-169274，相关系数R²=0.9992，表明其在5.0-30.1μg之间线性关系良好，橙皮苷标准曲线如图4。

代入三批（20180807、20180815、20180902）供试品相应峰面积，求得每1g浸膏粉中橙皮苷含量为86.739mg、88.261mg、85.321mg。

2.5.4 苦杏仁苷含量测定

精密称定苦杏仁苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.01μg/μl、1.52μg/μl、2.00μg/μl、3.02μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量（μg）作为横坐标绘制标准曲线。得到苦杏仁苷线性回归方程y=565333x-613222，相关系数R²=0.9972，表明其在5.0-30.2μg之间线性关系良好，杏仁苷标准曲线如图5。

代入三批（20180807、20180815、20180902）供试品相应峰面积，求得每1g浸膏粉中苦杏仁苷含量为42.666mg、41.895mg、42.217mg。

以《中国药典》2015版作为依据，对成方中的黄芪药材进行薄层鉴定，并选取黄芪甲苷、阿魏酸、橙皮苷、苦杏仁苷等4种有效成分，建立了稳定、高效、方便、快捷的质量标准。

实验例2

血栓通脉胶囊含药血清对H₂O₂诱导HUVEC细胞氧化损伤的保护作用

3.1 实验材料

3.1.1细胞

人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）采购自中国科学院昆明细胞库（昆明细胞库编号：KCB2012087YJ）。

3.1.2实验动物

雄性SD大鼠30只，8周龄，体重165-175g，采购自北京华阜康生物科技股份有限公司，由吉林省实验动物质量检测中心进行质量检测，许可证号码：SCXK（吉）-2016-0003。每笼5只进行分笼饲养，培养温度20±2℃，使用普通动物饲料进行喂养。

3.2 实验方法

3.2.1 血栓通脉胶囊含药血清的制备

30只雄性8周龄SD 大鼠，随机分为三组，分别为空白对照组、给药组和阳性对照（复方丹参片）组。给药剂量按临床给药剂量和大鼠给药剂量的换算公式（大鼠给药剂量=人临床计量×成人体重×等效剂量比值/大鼠体重）计算，给药组大鼠每日给药量为2.0g/kg，阳性对照组给复方丹参片0.26g/kg，空白对照组给予等量生理盐水灌胃。每日灌胃一次，连续给药7天。末次给药前12h禁食不禁水，末次给药后2h腹主动脉取血。

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3-0.5g/kg）进行麻醉。打开腹腔，将腹腔脏器全部推至一旁，清理手术视野，打开腹后壁腹膜，分离开下腔静脉与腹主动脉，游离约1.5cm的腹主动脉，夹闭远心端使动脉膨起，插入采血针进行采血。见图6。

将取出的全血4℃静置1h，4℃3000rpm离心10min，分离血清。吸取血清，将同组的血清混合，56℃水浴灭活30min，用 0.22µm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。见图6大鼠腹主动脉分离。

3.2.2 HUVEC细胞培养

用含10%BS和双抗（100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素）的DMEM高糖培养基于5%CO₂培养箱中培养，培养温度为37℃，胰酶消化液用于细胞消化、传代。

3.2.3 H₂O₂诱导HUVEC细胞氧化损伤模型的制备

取对数生长期的细胞，按4×10³个/孔的密度将HUVEC铺进96孔板中，分为0、600、700、800、900、1000μmol/L H₂O₂组，每组三复孔，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含15%NS（正常血清）的DMEM培养基培养24h，再更换为含相应浓度H₂O₂的含15%NS的DMEM培养基造模12h。用CCK8试剂检测细胞活力，确定800μmol/L H₂O₂为造模浓度。

3.2.4 CCK8法检测HUVEC细胞活力

取对数生长期的细胞，按4×10³个/孔的密度将HUVEC铺进96孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，每组三复孔，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。吸去培养基，每孔加入新鲜配制的CCK8工作液（200μl CCK8试剂+800μl DMEM高糖培养基），避光孵育30min，酶标仪490nm波长检测OD值。

3.2.5 检测HUVEC的LDH释放量

取对数生长期的细胞，按1×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进12孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。收集细胞培养上清，4000rpm离心15min，取上清进行检测。

混匀后静置5min，酶标仪450nm波长测定吸光度。计算公式如下：

LDH活性（U/gprot）=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（0.2μmol/ml）/待测样品蛋白浓度（gprot/ml）。

3.2.6 检测HUVEC中GSH含量

取对数生长期的细胞，按1×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进12孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。用胰酶将细胞消化收集，PBS清洗2次，再用300μl PBS重悬细胞，超声破碎细胞。取破碎后细胞悬液100μl，加入100μl试剂一混匀，3500rpm离心10min，取上清液检测。

混匀后静置5min，酶标仪405nm波长测定吸光度。计算公式如下：

GSH含量（μmol/gprot）=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×样品稀释倍数（2）/待测样品蛋白浓度（gprot/ml）。

3.2.7 检测HUVEC中NO含量

取对数生长期的细胞，按1×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进12孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。用胰酶将细胞消化收集，PBS清洗2次，再用300μl PBS重悬细胞，超声破碎细胞。取破碎后细胞悬液300μl，加入200μl的试剂一混匀，再加试剂二100μl混匀，静置10min，4000rpm离心15min，取上清液检测。

3.2.8 检测HUVEC中SOD含量

取对数生长期的细胞，按1×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进12孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。用胰酶将细胞消化收集，PBS清洗2次，再用300μl PBS重悬细胞，超声破碎细胞。12000rpm离心15min，取上清液检测。

3.2.9 检测HUVEC中MDA含量

取对数生长期的细胞，按2×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进6孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。用胰酶将细胞消化收集，PBS清洗2次，再用150μl PBS重悬细胞，超声破碎细胞。12000rpm离心15min，取上清液检测。

3.2.10 检测HUVEC中ROS含量

取对数生长期的细胞，按1×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进12孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。用胰酶将细胞消化收集，按照1:1000用无血清DMEM稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。每孔细胞重悬于500μl稀释好的DCFH-DA中，37ºC细胞培养箱内孵育30分钟，每隔5min颠倒混匀一次。用PBS清洗装载后细胞三次，重新计数，将细胞铺入96孔板中，每组4复孔，使每孔均为2×10⁴。使用荧光酶标仪，设定激发波长488nm，发射波长525nm，检测目标荧光。

3.2.11 Western Blot检测HUVEC中PARP、p-IRE1、IRE1、p-eif2α、eif2α、 cleavedcaspase-3和GAPDH的表达水平。

取对数生长期的细胞，按2×10⁵个/孔的密度将HUVEC铺进6孔板中，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，放入二氧化碳培养箱培养8h，待其贴壁后，吸去培养基，更换为含相应大鼠血清的DMEM培养基培养24h，除空白对照组外，其余各组再更换为含800μmol/L H₂O₂的含相应大鼠血清的DMEM培养基造模12h。用lysisbuffer将细胞收集下来，反复冻融三次裂解细胞，4℃ 12000rpm离心15min，取上清液进行BCA蛋白定量。用上样缓冲液将样品浓度调整一致，上样量为15μg。将样品置于沸水浴中5min，使蛋白质变性，将制备好的蛋白样品-20℃保存。

按配方配制10%的分离胶，在分离胶上加蒸馏水覆盖封闭，待其凝固后，再按配方配制浓缩胶。待凝胶完全凝固后，将玻璃板与电泳装置正确连接，倒入电泳液，小心拔出梳齿防止凝胶破碎，在上样孔内依次加入三色预染蛋白marker和已制备好的蛋白样品。先用80V恒压电泳至溴酚蓝条带跑至分离胶浓缩胶交界处，更换为120V电压继续电泳，直至溴酚蓝条带跑至玻璃板底部时，停止电泳。

剪取适宜大小的PVDF膜，放入甲醇中浸泡2min激活。将凝胶小心从玻璃板中取出，裁取所需部分，将其置于事先已润湿的转膜滤纸上，再将已经激活的PVDF膜用转膜液洗涤几次，将其与凝胶紧密贴合，用刮板赶出PVDF膜与凝胶之间的气泡，再覆盖转膜滤纸。按正确顺序放置好夹子，夹紧后置于转膜装置中，倒入预冷的转膜缓冲液，将转膜装置置于冰水混合物中，250mA恒流电转90min。

待转膜结束后，将PVDF膜取出，用含2% BSA的TBST溶液在低速摇床上室温封闭1h。将封闭好的PVDF膜置于已按说明稀释好的一抗溶液中，4℃摇床孵育过夜。次日回收一抗，将PVDF膜用TBST溶液漂洗三次，再将其放入用5%脱脂奶粉配制的二抗中，室温孵育1h。用TBST漂洗三次后，使用ECL显影液及化学发光图像分析仪进行显影。

3.3 实验结果

3.3.1 H₂O₂诱导HUVEC细胞氧化损伤模型的确定

实验结果表明，HUVEC细胞经不同浓度的H₂O₂损伤后，与对照组相比，各组的细胞活力均显著下降，各组间比较表明，随着H₂O₂浓度的提高，细胞活力呈下降趋势，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。其中800μmol/L H₂O₂处理后细胞活力降至53.61±0.004%，差异具有统计学意义（P＜0.01），故选择800μmol/L H₂O₂处理作为氧化损伤模型。结果见图7。图7 HUVEC在不同浓度H₂O₂处理下细胞活力比较（mean±SD，n=3，**P＜0.01 vscontrol）。

3.3.2 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC细胞活力的影响

实验结果表明，与对照组相比，不同浓度的血栓通脉胶囊含药血清均对H₂O₂处理的HUVEC细胞有保护作用，且随着含药血清浓度的提高，保护作用显著增强，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。其中中剂量组（10%）和高剂量组（15%）的保护作用优于阳性对照组。结果见图8。图8 不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC细胞活力的影响（mean±SD，n=3，## P＜0.01vs control，*P＜0.05vs15%NS，** P＜0.01vs15%NS）。

3.3.3 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC LDH释放量的影响

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可促进HUVEC的LDH释放，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而血栓通脉胶囊含药血清可降低H₂O₂处理的HUVEC细胞的LDH释放量，且随着含药血清浓度的提高，保护作用显著增强，除低剂量组外，与模型组相比均有显著差异（P＜0.01），其中中剂量组（10%）和高剂量组（15%）作用与阳性对照组水平相当。结果见图9。图9不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC LDH释放量的影响（mean±SD，n=2，## P＜0.01vs control，** P＜0.01 vs 15%NS）。

3.3.4 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中GSH含量的影响

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可降低HUVEC中的GSH含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而血栓通脉胶囊含药血清可提高H₂O₂处理的HUVEC细胞中的GSH含量，除低剂量组外，与模型组相比均有显著差异（P＜0.05），其中中剂量组（10%）和高剂量组（15%）作用与阳性对照组水平相当或优于阳性对照组。结果见图10。图10不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中GSH含量的影响（mean±SD，n=2，##P＜0.01vs control，*P＜0.05vs15%NS，** P＜0.01vs15%NS）。

3.3.5 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中NO含量的影响

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可降低HUVEC中的NO含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而血栓通脉胶囊含药血清可提高H₂O₂处理的HUVEC细胞中的NO含量，且随着含药血清浓度的提高，保护作用显著增强，与模型组相比均有显著差异（P＜0.05），其中中剂量组（10%）和高剂量组（15%）作用与阳性对照组水平相当或优于阳性对照组。结果见图11。图11不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中NO含量的影响（mean±SD，n=2，## P＜0.01vs control，*P＜0.05vs 15%NS，** P＜0.01vs 15%NS）。

3.3.6 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中SOD含量的影响

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可降低HUVEC中的SOD含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而血栓通脉胶囊含药血清可提高H₂O₂处理的HUVEC细胞中的SOD含量，除低剂量组外，与模型组相比均有显著差异（P＜0.05），其中中剂量组（10%）和高剂量组（15%）作用与阳性对照组水平相当或优于阳性对照组。结果见图12。图12不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中SOD含量的影响（mean±SD，n=2，## P＜0.01vs control，*P＜0.05vs15%NS，** P＜0.01vs 15%NS）。

3.3.7 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中MDA含量的影响

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可提高HUVEC中的MDA含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而血栓通脉胶囊含药血清可降低H₂O₂处理的HUVEC细胞中的MDA含量，且随着含药血清浓度的提高，保护作用显著增强，各组与模型组相比均有显著差异（P＜0.01）。结果见图13。图13不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中MDA含量的影响（mean±SD，n=3，## P＜0.01 vs control，** P＜0.01 vs 15%NS）。

3.3.8 血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中ROS含量的影响

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可显著提高HUVEC中的ROS含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而血栓通脉胶囊含药血清可降低H₂O₂处理的HUVEC细胞中的ROS含量，且随着含药血清浓度的提高，保护作用显著增强，各组与模型组相比均有显著差异（P＜0.01）。结果见图14。图14不同浓度血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中ROS含量的影响（mean±SD，n=4，## P＜0.01vs control，** P＜0.01vs 15%NS）。图14血栓通脉胶囊含药血清对HUVEC中PARP、p-IRE1、IRE1、p-eif2α、eif2α、 cleaved caspase-3和GAPDH表达水平的影响。

实验结果表明，与对照组相比，H₂O₂处理可显著提高HUVEC中PARP、cleavedcaspase-3的表达量，表明H₂O₂处理可显著诱导HUVEC细胞的凋亡，而含药血清可显著下调PARP、cleaved caspase-3的表达量，且随着含药血清浓度的提高，下降越明显；H₂O₂处理可显著提高HUVEC中p-IRE1、p-eif2α的表达量，表明内质网应激通路参与了H₂O₂诱导的HUVEC细胞凋亡，而含药血清可显著抑制p-IRE1、p-eif2α的量，且随着含药血清浓度的提高，抑制作用越明显。结果见图15。

实验例3

血栓通脉胶囊抑制FeCl₃诱导大鼠颈总动脉血栓形成

4.1 实验材料

4.1.1实验动物

雄性SD大鼠40只，8周龄，体重155-170g；雄性昆明小鼠20只，6-8周龄，体重18-20g，采购自辽宁长生生物技术股份有限公司，由中国食品药品检定研究所进行质量检测，许可证号码：SCXK（辽）-2015-0001。大鼠每笼4只，小鼠每笼5只，进行分笼饲养，培养温度20±2℃，大、小鼠均使用普通动物饲料进行喂养。

4.2 实验方法

4.2.1 实验动物分组

将SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组和阳性对照组，每组8只。适应性饲养7天后开始灌胃给药，连续给药7天，给药剂量按公式计算，低剂量组组大鼠每日给药1.0g/kg，高剂量组组大鼠每日给药2.0g/kg，阳性对照组给复方丹参片0.26g/kg，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

昆明小鼠随机分为对照组、低剂量组、高剂量组和阳性对照组，每组5只。适应性饲养7天后开始灌胃给药，连续给药7天，给药剂量按公式计算，低剂量组小鼠每日给药2.0g/kg，高剂量组小鼠每日给药4.0g/kg，阳性对照组给复方丹参片0.52g/kg，对照组给予等量生理盐水灌胃。

4.2.2 FeCl₃诱导SD大鼠颈总动脉血栓形成

末次给药2h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，将麻醉好的SD大鼠全身喷以75%乙醇消毒，仰卧位固定于动物试验台上，颈部剪毛脱毛备皮，碘伏消毒手术部位。沿颈中线做一3-5cm切口，分离皮下肌肉及结缔组织，暴露左侧颈总动脉，分离约2cm动脉，在动脉下垫一锡纸条保护其余组织不被FeCl₃腐蚀，用一宽1cm的浸有50% FeCl₃的滤纸条紧密包裹动脉，计时25min，造成颈总动脉血栓。对照组以生理盐水替代FeCl₃。见图16。

剪下滤纸条包裹的动脉血管段，吸净血管内残余血液，精确称重，再将血管剖开，取出血栓，精确称重血管重量，计算血栓重量及血栓形成率。计算公式如下：

血栓重量=含血栓血管重量-去除血栓血管重量

血栓抑制率（%）=（对照组血栓重量-给药组血栓重量）/对照组血栓重量×100%。见图16。图16 是FeCl₃诱导SD大鼠颈总动脉血栓形成（A.分离SD大鼠左侧颈总动脉，B.将锡纸条和浸有50% FeCl3 的滤纸条穿过颈总动脉，C.用锡纸条和滤纸条紧密包裹住动脉，D.25min后血栓造模成功）。

4.2.3 体外血栓形成试验

颈总动脉血栓造模后，立即以含1/10的3.8%枸橼酸钠的抗凝采血管对SD大鼠进行腹主动脉采血。从采出的全血中取1.5ml加入塑胶软管内，放入体外血栓形成仪，37℃顺时针旋转15min，取下软管，在一事先称重好的滤纸上倒出血栓，吸去血栓表面残余血液，将血栓放入恒温烘干箱内37℃烘干30min，取出血栓称量干重，并计算血栓抑制率。

4.2.4抗血小板凝集实验

颈总动脉血栓造模后，立即以含1/10的3.8%枸橼酸钠的抗凝采血管对SD大鼠进行腹主动脉采血。从采出的全血中取出1.5ml加入2ml EP管中，1000rpm离心5min，分离出的上层血浆即为富血小板血浆（PRP）。将剩余血浆3000rpm离心10min，分离出的上层血浆即为贫血小板血浆（PPP）。

将血小板聚集仪预热至37℃，将200μl PPP加入比浊管中，按提示插入机器进行调零。再将200μl PRP加入比浊管并在其中放入转子，按提示插入机器进行检测。再按机器提示，用微量进样器在PRP中快速加入10μl ADP诱导剂（100μmol/L），检测血小板最大聚集率，计算血小板聚集抑制率。

公式如下：

血小板聚集抑制率（%）=（对照组平均聚集率-给药组平均聚集率）/对照组平均聚集率×100%。

4.2.5 凝血时间及出血时间检测

昆明小鼠末次给药后2h，用内径0.9-1.1mm，长100mm的毛细玻璃管对小鼠进行眼后静脉丛采血。从血液流入玻璃管即开始计时，当血液注满玻璃管后，将其置于桌面，每隔15s折断5mm，缓慢拉开，观察折断面是否有凝血丝出现，直至凝血丝出现时停止计时，所计时长即为凝血时间。

用手术刀在距小鼠尾部末端5mm处做一切口，血液流出时即开始计时，每隔30s用干净的滤纸擦拭创口，观察是否继续出血，直至不再出血时停止计时，即为出血时间。

4.2.6 ELISA法检测大鼠血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1（内皮素-1）指标的变化

颈总动脉血栓造模后，立即以含1/10的3.8%枸橼酸钠的抗凝采血管对SD大鼠进行腹主动脉采血。将取出的全血4℃静置1h，4℃ 3000rpm离心10min，分离血清。

①TXB2、6-Keto-PGF1α：实验准备阶段，按试剂盒说明，配制好生物素化抗体、HRP酶结合物、洗涤液以及标准品工作液。在酶标板中依次加入倍比稀释好的各浓度标准品工作液和待测血清50μl，立即在每孔中加入生物素化抗体50μl，贴好覆膜，37℃恒温孵育45min。取出酶标板，弃去液体并甩干，每孔加350μl洗涤液，浸泡1-2min，弃去洗涤液，并将酶标板甩干，重复洗板三次。每孔中加入酶结合工作液100μl，贴上覆膜，37℃孵育30min。取出酶标板，弃去液体并甩干，并重复洗板五次。每孔中加入底物溶液90μl，贴上覆膜，避光37℃孵育15min（可按实际情况适当延长或缩短，但不可超过30min）。取出酶标板，每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪检测450nm处的OD值。

②ET-1：实验准备阶段，按试剂盒说明，配制好生物素化抗体、HRP酶结合物、洗涤液以及标准品工作液。在酶标板中依次加入倍比稀释好的各浓度标准品工作液和待测血清100μl，贴好覆膜，37℃孵育90min。取出酶标板，弃去液体并甩干，再加入生物素化抗体100μl，贴好覆膜，37℃孵育60min。取出酶标板，弃去液体并甩干，每孔加350μl洗涤液，浸泡1-2min，弃去洗涤液，并将酶标板甩干，重复洗板三次。取出酶标板，每孔加入酶结合工作液100μl，贴上覆膜，37℃孵育30min。取出酶标板，弃去液体并甩干，并重复洗板五次。每孔加入底物溶液90μl，贴上覆膜，避光37℃孵育15min（可按实际情况适当延长或缩短，但不可超过30min）。取出酶标板，每孔加入50μl终止液，立即用酶标仪检测450nm处的OD值。

4.2.7 观察HE染色血管切片

SD大鼠颈总动脉血栓造模后，剪下颈总动脉，将取下的颈总动脉血管段置于10%甲醛中进行固定，然后进行脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察切片。

4.3 实验结果

4.3.1 血栓通脉胶囊对SD大鼠颈总动脉血栓重量的影响

使用分析天平精确称取含血栓血管重量及去除血栓血管重量，计算出血栓重量，并计算血栓抑制率。

实验结果表明，与对照组相比，50% FeCl3可造成SD大鼠颈总动脉血栓形成，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而与模型组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著抑制血栓形成（P＜0.01），其中低剂量组效果最好，抑制率可达到52.36%。结果见图17。

实验结果表明，与模型组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著抑制体外血栓形成，差异具有统计学意义（P＜0.01）。低剂量组和高剂量组效果均超过阳性组，其中低剂量组效果最好，抑制率可达到70.70%。结果见表15和图18。

4.3.2血栓通脉胶囊对SD大鼠血小板聚集的影响

实验结果表明，与对照组相比，模型组血小板聚集率显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而与模型组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著抑制血小板聚集（P＜0.01），且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组效果超过阳性对照组，其抑制率可达到77.56%。结果见表16和图19。

4.3.3血栓通脉胶囊对昆明小鼠出血时间和凝血时间的影响

实验结果表明，与对照组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著延长昆明小鼠的出血时间，差异具有统计学意义（P＜0.05）。血栓通脉胶囊随给药剂量的提高，出血时间显著延长，与对照组相比均有显著差异（P＜0.01），低剂量组和高剂量组对出血时间的延长效果均好于阳性对照组。与对照组相比，血栓通脉胶囊及复方丹参片均可显著延长昆明小鼠的凝血时间，差异具有统计学意义（P＜0.01）。血栓通脉胶囊低剂量组和高剂量组对凝血时间的延长效果均好于阳性对照组，其中低剂量组效果最好。结果见表17和图20、图21。

4.3.4血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中TXB2（血栓素B2）、6-Keto-PGF1α（6-酮-PGF1α）、ET-1（内皮素-1）含量的影响

实验结果表明，与对照组相比，血栓模型组SD大鼠血清中6-Keto-PGF1α含量显著下降、而TXB2、ET-1含量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而与模型组相比，血栓通脉胶囊和复方丹参片均可显著下调大鼠血清中TXB2、ET-1含量，而提高6-Keto-PGF1α含量（P＜0.01）。结果表明，血栓通脉胶囊可显著提高SD大鼠的抗栓能力。结果见图22-24。图22 血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中TX2含量的影响（mean±SD，n=4，## P＜0.01vscontrol，** P＜0.01vs TM）。图23血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中6-Keto-PGF1α含量的影响（mean±SD，n=4，## P＜0.01vs control，** P＜0.01vs TM）。图24血栓通脉胶囊对SD大鼠血清中ET-1含量的影响（mean±SD，n=4，## P＜0.01 vs control，** P＜0.01 vs TM，* P＜0.05 vs TM）。

4.4 小结

实验结果显示，与对照组相比，血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠体内及体外血栓形成，且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组效果好于低剂量组。同时血栓通脉胶囊可显著抑制SD大鼠血小板聚集，且随剂量增加，抑制效果增强，高剂量组抑制率甚至可达到77.56%。与对照组相比，血栓通脉胶囊可显著延长昆明小鼠的出血时间及凝血时间，随给药剂量的提高，出血时间显著延长，高剂量组效果最好，而低剂量组的凝血时间要长于高剂量组。与模型组相比，血栓通脉胶囊可显著下调SD大鼠血清中TXB2、ET-1含量，而提高6-Keto-PGF1α含量。以上结果均提示血栓通脉胶囊可能增强SD大鼠及昆明小鼠的抗栓能力。

实验例4

血栓通脉胶囊治疗脑血栓临床报告

结论：经血栓通脉胶囊治疗脑血栓累计50例临床观察：治愈率48％，显效率88％，有效率98％，无效率2％。疗效显著。

二、诊断标准

脑梗死诊断标准：全国第四届脑血管病学术会议通过（1995），见中华神经科杂志1996:6；379.

动脉粥样硬化性脑梗死

（1）常于安静状态下发病。

（2）大多数发病时无明显头痛和呕吐。

（3）发病较缓慢，多逐渐进展或呈阶段性进行，多与脑动脉粥样硬化有关，也可见于动脉炎、血液病等。

（4）一般发病后1~2天内意识清楚或轻度障碍。

（5）有颈内动脉系统和（或）椎-基底动脉系统症状和体征。

（6）应做CT或MRI检查。

（7）腰穿脑脊液一般不应含血。

三、脑梗死治疗标准

（一）治愈：语言正常流利，肢体肌力V级。

（二）显效：语言流利，肢体肌力IV级，可独立行走。

（三）有效：语言可正常表达，肌力III级

（四）无效：肢体肌力无恢复或病情进行性加重。

（五）头颅CT检查。

四、病例报告

病例1、刘某某，女，69岁。

该患者于2019年9月20日晨起时发现左侧肢体运动不灵活，在当地诊所用药（用药不详）无效，于21日到通化市中西医结合医院门诊行头颅CT检查，诊断：右侧基底节区腔隙性脑梗塞。查体：神清、语言笨拙、伸舌居中、左侧肢体肌力II级、腱反射减弱。临床诊断：脑血栓形成。后给血栓通脉胶囊口服零胶囊(含药0、5克)。一次4粒，一日3次囗服。7天后语言明显改善，可正常与人对话。15天后左侧肢体肌力V级，正常行走。于2019年 11月6日复查头颅CT报告：颅脑CT扫描未见明显异常。

病例2、王某某，男，62岁。

该患者于2019年10月31日与他人生气后出现左侧肢体运动不灵，呈进行性加重，在家中自行服牛黄安宫丸无效，于2019年11月1日到通化市中西医结合医院门诊行头颅CT检查，诊断：右侧基底节区腔隙性脑梗塞。查体：神清、语明、伸舌居中、左侧肢体肌力I级，临床诊断脑梗死。给口服血栓通脉胶囊零号胶囊(含药量0、5克)，4粒/次、3次/日、口服12天后，肢体活动自如，于2019年12月7日复查头颅CT：未见明显异常。

上面描述，只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制。

Claims

1.血栓通脉药物，其特征在于其药用有效成分由以下重量份数的原料药制成：黄芪25－35份，地龙8－12份，土鳖虫8－12份，水蛭8－12份，桃仁15－25份，川芎12－18份，橘红12－18份，当归12－18份，鸡血藤12－18份。

2.按照权利要求1所述的血栓通脉药物，其特征在于由以下重量克数的原料药制成胶囊：黄芪30g，地龙10g，土鳖虫10g，水蛭10g，桃仁20g，川芎15g，橘红15g，当归15g，鸡血藤15g。

3.一种如权利要求1或2所述血栓通脉药物的制备方法，其特征在于步骤如下：用8倍溶剂量的70%乙醇，先浸泡药材过夜，再加热回流1h，提取2次，将药液过滤，而后旋转蒸发仪蒸发药液，待药液略呈粘稠状，将药液装入蒸发皿中，75℃水浴蒸干，再55℃减压烘干制成浸膏；浸膏粉与辅料淀粉按6:4比例混合，再喷以适量85%乙醇润湿，揉搓成团，机械按压通过20目筛整粒，40℃干燥，再过40目筛，去除粉尘，灌装，包装，即得血栓通脉胶囊。

4.一种如权利要求1或2所述血栓通脉药物的含量测定方法，其特征在于该方法中包括如下任一种或几种组合：

（1）黄芪甲苷的含量测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱，使用蒸发光散射检测器检测，流动相选择乙腈-水=35:65，流动相流速为1.0ml/min，柱温 40℃，漂移管温度40℃；精密称定黄芪甲苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.05μg/μl，0.10μg/μl ，0.25μg/μl，0.50μg/μl，0.75μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量μg作为横坐标，绘制标准曲线；得到黄芪甲苷线性回归方程y=2219906.5685x-741089.8761，相关系数R2=0.9981，表明其在0.5-7.5μg之间线性关系良好；

（2）阿魏酸的含量测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱，流动相选择乙腈-水=17:83，检测波长为316nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃；精密称定阿魏酸标准品，加甲醇配制成浓度为0.10μg/μl、0.20μg/μl、0.51μg/μl、0.71μg/μl、1.00μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到阿魏酸线性回归方程y=298925x-47829，相关系数R²=0.9983，表明其在1.0-10.0μg之间线性关系良好；

（3）橙皮苷含量测定：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱，流动相选择甲醇-水=40:60，检测波长为284nm，流动相流速为1.0ml/min，柱温35℃；精密称定橙皮苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.02μg/μl、1.53μg/μl、2.01μg/μl、3.01μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到橙皮苷线性回归方程y=298067x-169274，相关系数R²=0.9992，表明其在5.0-30.1μg之间线性关系良好；

（4）苦杏仁苷含量测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱InertSustain C18 柱，流动相选择甲醇-水=20:80，检测波长为210nm，流动相流速为_哦1.0ml/min，柱温35℃；精密称定苦杏仁苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.50μg/μl、1.01μg/μl、1.52μg/μl、2.00μg/μl、3.02μg/μl的标准品溶液，依次进样10μl，通过HPLC获得数据，以峰面积作为纵坐标，进样量作为横坐标绘制标准曲线；得到苦杏仁苷线性回归方程y=565333x-613222，相关系数R²=0.9972，表明其在5.0-30.2μg之间线性关系良好。