CN104161798B - 一种复方丹参提取物及其应用 - Google Patents
一种复方丹参提取物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种复方丹参提取物及其制备方法,所述提取物的制备方法包括以下步骤:取丹参、三七,加醇提取,得醇提液,浓缩,得醇提物;然后药渣再用水提,得水提液,所得水提取液通过大孔树脂精制,所得洗脱液浓缩,加碱水解,浓缩成稠膏或干燥,得水提物;合并所述醇提物和所述水提物即得。本发明所述的复方丹参提取物中去除了传统技术中的糖类、蛋白类等杂质成分,同时大幅提高了药效成分的含量。本发明还公开复方丹参提取物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域,尤其是涉及一种复方丹参提取物及其应用。
背景技术
随着生活水平的提高、世界人口老龄化以及发病群体的年轻化,心脑血管疾病逐年增加,已成为严重危害人类健康和生活质量的疾病。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”即“四高一多”的特点,目前,我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人!我国每年死于心脑血管疾病近300万人,占我国每年总死亡病因的51%。而幸存下来的患者75%不同程度丧失劳动能力,40%重残。
丹参又名赤参,紫丹参,红根等。苦,微寒。归心、肝经。能扩张冠状动脉,增加冠脉流量,改善心肌缺血、梗塞和心脏功能,调节心律,并能扩张外周血管,改善微循环;能提高机体耐缺氧能力;有抗凝血,促进纤溶,抑制血小板凝聚,抑制血栓形成的作用;能降低血脂,抑制冠脉粥样硬化形成;能抑制或减轻肝细胞变性、坏死及炎症反应,促进肝细胞再生,并有抗纤维化作用;能缩短红细胞及血色素的恢复期,使网织细胞增多,能促进组织的修复,加速骨折的愈合;有中枢神经有抑制作用;有抗肿瘤作用;能增强机体免疫功能;能降低血糖;对结核杆菌等多种细菌有抑制作用。
三七具有散瘀止血作用,是血证的常用药。《王楸药解》说它“和营止血,通脉行瘀,行瘀血而敛新血。凡产后、经期、跌打、痈肿,一切瘀血皆破;凡吐衄、崩漏、刀伤、箭伤,一切新血皆止。”《本草新编》指出:“三七根,止血之神药也。无论上、中、下之血,凡有外越者,一味独用亦效。加入于补血补气药中则更神。盖此药得补而无沸腾之患,补药得此而有安静之体也。”
临床上,丹参、三七通常联合应用,治疗心血管疾病,上市的药物有复方丹参片、复方丹参注射液等。但普通片剂、胶囊生产工艺落后,有效成分含量低,无质量控制指标,需口服经胃肠道吸收,在肝脏发生首过效应后吸收入血,生物利用度低,吸收慢.并不能适合心绞痛病人的急救之需。
发明内容
复方丹参滴丸是一种起效快、疗效好的冠心病治疗药物,临床上深受患者的欢迎。针对复方丹参滴丸的制备工艺,本发明从提取工艺方面进行了深入研究,利用大孔树脂精制去除了糖类、蛋白质等成分,提高了有效成分的含量,降低了服用量。从节约药材资源方面,提高了药材所含有效成分的综合利用率。
本发明的目的在于提供一种复方丹参提取物及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述复方丹参提取物的应用。
根据本发明的复方丹参提取物,其制备方法包括以下步骤:取丹参、三七,加醇提取,得醇提液,浓缩干燥,得醇提物;然后取所述醇提物的制备中生成的药渣,再用水提,得水提液,所得水提液通过大孔树脂精制,所得洗脱液浓缩,加碱水解,浓缩成稠膏或干燥,得水提物;合并所述醇提物和所述水提物即得。
优选的,所述丹参、三七药材的重量百分比为丹参20-98%,三七2%-80%。
根据本发明实施方式之一,所述醇提物的制备方法为:取丹参、三七药材,加2-8倍量乙醇回流提取1-3次,每次0.5-3小时,合并提取液,减压浓缩、干燥,即得。
优选的,所述乙醇为70%-100%的乙醇溶液。
最优选的,所述乙醇为95%的乙醇溶液。
根据本发明的另一实施方式,所述水提取液的制备方法为:取所述醇提物的制备中生成的药渣,加2-12倍量水回流提取1-3次,每次1-3小时,过滤,合并所得滤液,即得所述水提取液。
根据本发明的再一实施方式,所述洗脱液的制备方法为:取所述提取液,上大孔树脂柱,依次用水、70%-100%乙醇洗脱,所得乙醇洗脱液即为所述洗脱液。
优选的,所述大孔树脂柱使用前通过以下方法预处理:取大孔树脂,以70%-100%乙醇湿法装柱,然后用70%-100%乙醇洗至滤液与水混合不呈白色浑浊,最后用蒸馏水洗至无醇味。
更优选的,所述大孔树脂柱使用前通过以下方法预处理:取大孔树脂,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊,最后用蒸馏水洗至无醇味。
最优选的,所述大孔树脂与所述丹参三七的重量比为0.5-2。
根据本发明再一实施方式,所述水解方法为:取所述洗脱液,减压浓缩至无醇味,然后加入碱液,加热回流,即得。
优选的,所述碱液选自碳酸氢钠,碳酸钠,氢氧化钠,氢氧化钾的溶液,pH值为7-10。
更优选的,所述碱液为10%碳酸氢钠溶液。
根据本发明再一实施方式,所述水解时间为0.5-8小时。
最优选的,本发明的复方丹参提取物,其制备方法包括以下步骤:
(1)取丹参、三七药材,加3倍量95%乙醇提取2小时,然后再加2倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,60℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加5倍量水提取2小时,然后再加4倍量水提取1小时,过滤,合并两次所得滤液,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干AB-8型大孔树脂的量:生药量(上述步骤(1)中丹参三七药材的量)=1:1,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,再用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1BV/hr流速上到已处理好的AB-8大孔树脂柱(大孔树脂量:生药量=1:1),然后用1BV水以1BV/hr水洗除杂,最后用2.5BV的95%乙醇作为洗脱液,以1BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,60℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入10%碳酸氢钠溶液16.1ml,加热回流2小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
本发明的复方丹参提取物,作为药物活性物质,需要时加入药物可接受的载体,按照制剂学的常规技术制成的所需的制剂。制剂中的药物活性物质,可以是0.1-99.9%,其余为药物可接受的载体。本发明的药物制剂,以单位剂量形式存在,所述单位剂量形式是指制剂的单位,如片剂的每片,胶囊的每粒胶囊,口服液的每瓶,颗粒剂每袋等。
本发明的制剂可以是任何可药用的剂型,这些剂型包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、滴丸剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。
优选的,本发明的制剂是口服剂型,如:滴丸剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
最优选的,本发明的剂型为滴丸剂。
根据本发明,所述滴丸剂是通过以下方法制备的:取本发明所述的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的辅料按照药辅比为1:2-5混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为60-100℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
优选的,所述辅料为PEG6000。
优选的,药辅比为1:3。
优选的,化料温度为80℃。
最优选的,所述滴丸剂是通过以下方法制备的:取本发明所述的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的辅料按照药辅比为1:3混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为80℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
根据本发明,所述复方丹参提取物的制备方法,包括以下步骤:取丹参、三七,加醇提取,得醇提液,浓缩干燥,得醇提物;然后取所述醇提物的制备中生成的药渣,再用水提,得水提液,所得水提液通过大孔树脂精制,所得洗脱液浓缩,加碱水解,浓缩成稠膏或干燥,得水提物;合并所述醇提物和所述水提物即得。
优选的,所述丹参、三七药材的重量百分比为丹参20-98%,三七2%-80%。
根据本发明实施方式之一,所述醇提物的制备方法为:取丹参、三七药材,加2-8倍量乙醇回流提取1-3次,每次0.5-3小时,合并提取液,减压浓缩、干燥,即得。
优选的,所述乙醇为70%-100%的乙醇溶液。
最优选的,所述乙醇为95%的乙醇溶液。
根据本发明的另一实施方式,所述水提取液的制备方法为:取所述醇提物的制备中生成的药渣,加2-12倍量水回流提取1-3次,每次1-3小时,过滤,合并所得滤液,即得所述水提取液。
根据本发明的再一实施方式,所述洗脱液的制备方法为:取所述提取液,上大孔树脂柱,依次用水、70%-100%乙醇洗脱,所得乙醇洗脱液即为所述洗脱液。
优选的,所述大孔树脂柱使用前通过以下方法预处理:取大孔树脂,以70%-100%乙醇湿法装柱,然后用70%-100%乙醇洗至滤液与水混合不呈白色浑浊,最后用蒸馏水洗至无醇味。
更优选的,所述大孔树脂柱使用前通过以下方法预处理:取大孔树脂,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊,最后用蒸馏水洗至无醇味。
最优选的,所述大孔树脂与所述丹参三七的重量比为0.5-2。
根据本发明再一实施方式,所述水解方法为:取所述洗脱液,减压浓缩至无醇味,然后加入碱液,加热回流,即得。
优选的,所述碱液选自碳酸氢钠,碳酸钠,氢氧化钠,氢氧化钾的溶液,pH值为7-10。
更优选的,所述碱液为10%碳酸氢钠溶液。
根据本发明再一实施方式,所述水解时间为0.5-8小时。
最优选的,本发明的复方丹参提取物的制备方法包括以下步骤:
(1)取丹参、三七药材,加3倍量95%乙醇提取2小时,然后再加2倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,60℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加5倍量水提取2小时,然后再加4倍量水提取1小时,过滤,合并两次所得滤液,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干AB-8型大孔树脂的量:生药量(上述步骤(1)中丹参三七药材的量)=1:1,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,再用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1BV/hr流速上到已处理好的AB-8大孔树脂柱(大孔树脂量:生药量=1:1),然后用1BV水以1BV/hr水洗除杂,最后用2.5BV的95%乙醇作为洗脱液,以1BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,60℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入10%碳酸氢钠溶液16.1ml,加热回流2小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
本发明的目的还在于提供一种复方丹参制剂。
本发明的复方丹参制剂,以本发明所述的复方丹参提取物,作为药物活性物质,需要时加入其他活性成分和/或药物可接受的载体,按照制剂学的常规技术制成的制剂。本发明的制剂可以是任何可药用的剂型,这些剂型包括:片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、滴丸剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。
优选的,本发明的制剂是口服剂型,如:滴丸剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
最优选的,本发明的制剂为滴丸剂。
根据本发明,所述滴丸剂是通过以下方法制备的:取本发明所述的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的辅料按照药辅比为1:2-5混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为60-100℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
优选的,所述辅料为PEG6000。
优选的,药辅比为1:3。
优选的,化料温度为80℃。
最优选的,所述滴丸剂是通过以下方法制备的:取本发明所述的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的辅料按照药辅比为1:3混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为80℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
与未经醇提和大孔树脂精制,而采用传统水提醇沉的技术相比,本发明具有以下优势:
在产品质量方面,本发明所述的复方丹参提取物中去除了糖类、蛋白类等非药效成分,大幅提高了药效成分的含量。与按照传统的水提醇沉工艺制成的复方丹参提取物进行比较,丹参素含量提高83%,三七皂苷含量提高28.6%,丹参酮类成分含量提高了31.1倍,单糖和二糖的含量由8.6%降低到0%,体现了现代中药特点,也有利于制剂工艺的控制。
在服用剂量方面,以本发明所述复方丹参提取物为原料制备的精制复方丹参滴丸在保证药效的前提下,日服用量下降16.7%。服用更加方便,从而提高了服药患者的依从性。
本发明所述的提取物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
优选的,本发明所述提取物在制备治疗心肌缺血引起的疾病的药物中的应用。
优选的,本发明所述提取物在制备治疗抑制心肌损伤的药物中的应用。
试验表明,本发明的复方丹参提取物能显著缓解大鼠冠状动脉结扎所致急性心梗的主要症状指标,可以用于治疗心肌缺血引起的各种疾病,包括心肌梗死、急性冠状动脉综合征、房室阻滞、心律失常、冠心病心绞痛等。
试验表明,本发明的复方丹参提取物能显著改善中毒性心肌炎的主要症状指标,可以用于治疗心肌炎、心肌梗死等疾病引起的心肌细胞损伤,抑制心肌炎等疾病引起的心肌缺血。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1:本发明的复方丹参提取物的酚酸类成分指纹图谱。
图2:本发明的复方丹参提取物的皂苷类成分指纹图谱。
图3:本发明的复方丹参提取物的糖类成分指纹图谱。
图4:本发明的复方丹参提取物的丹参酮类成分图谱。
图5:复方丹参提取物对大鼠冠状动脉结扎所致急性心梗的影响试验不同给药组的心脏切片数码照片。
图6:复方丹参提取物对中毒性心肌炎的影响试验(体内中毒性心肌炎模型)中,不同给药组的心肌细胞超微结构电镜图,a-f分别为空白对照组、模型组、卡托普利组、提取物低组、提取物中组、提取物高组。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能解释为对本发明的限制。
试验例一复方丹参提取物工艺流程:
(1)取450g丹参药材、88g三七药材,加3倍量95%乙醇提取2小时,然后再加2倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,60℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加5倍量水提取2小时,然后再加4倍量水提取1小时,过滤,合并两次所得滤液,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干AB-8型大孔树脂的量:生药量(上述步骤(1)中丹参三七药材的量)=1:1,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,再用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1BV/hr流速上到已处理好的AB-8大孔树脂柱(大孔树脂量:生药量=1:1),然后用1BV水以1BV/hr水洗除杂,最后用2.5BV的95%乙醇作为洗脱液,以1BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,60℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入10%碳酸氢钠溶液16.1ml,加热回流2小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
4、复方丹参提取物滴丸的制备:
取复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的PEG6000按照药辅比为1:3混合均匀,加入冰片1克,进行化料,化料温度为80℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
试验例二复方丹参提取物与未经醇提及精制样品的检测数据及分析
分别测定本发明所述的复方丹参提取物的丹参素、三七皂苷及单糖和二糖的含量,并与按照传统的水提醇沉工艺制成的复方丹参提取物进行比较,数据显示:复方丹参提取物的丹参素含量提高83%,三七皂苷含量提高28.6%,单糖和二糖的含量由8.6%降低到0%(见图1、图2和图3)。本发明所述的复方丹参提取物中丹参酮的含量提高了31.1倍(图4)。按照相同的药辅比制成制剂,日服用量下降16.7%。
试验例三复方丹参提取物药效学评价试验
1.药物与试剂:
1.1复方丹参提取物(按本发明的实施例一制备,分为3个剂量组,分别为提取物低、提取物中、提取物高)。配制方法:称取样品,用蒸馏水溶解配制成所需浓度的药液。
1.2卡托普利片(阳性药):中美上海施贵宝制药有限公司,批号:1203032;配制方法:
将卡托普利片研磨成粉末,用蒸馏水溶解配制成所需浓度的药液。
1.30.9%氯化钠注射液:南京小营药业集团有限公司,批号:2012011301。
1.4注射用盐酸多柔比星:浙江海正药业股份有限公司,批号:120101。
1.5水合氯醛:国药集团化学试剂有限公司,批号:20100111。
1.6肌酸激酶(CK)测定试剂盒,批号:20120713;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒,批号:20120712;丙二醛(MDA)测定试剂盒,批号:20120717;超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,批号:20120709;肌酸激酶同工酶(CK-MB)测定试剂盒,批号:20120720;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒,批号:20120709;谷草转氨酶(AST)试剂盒,批号:20120713。均由南京建成生物工程研究所提供。
1.7红四氮唑(TTC),国药集团化学试剂公司,批号:F20120308;配制方法:称取TTC粉末,用PBS缓冲液溶解配制成1%的TTC溶液。
1.8高糖DMEM:美国GIBCO BRL公司产品。
1.9小牛血清:由杭州四季青公司提供,-20℃保存。
1.10胰蛋白酶:由南京sunshine科技有限责任公司提供。
1.11二甲基亚砜:上海凌峰化学试剂有限公司,批号:051123。
1.12青霉素:山东鲁抗医药股份有限公司,批号:B041103。
1.13链霉素:山东鲁抗医药股份有限公司,批号:040601。
2.主要试剂配制:
2.1高糖DMEM的配制:1L DMEM培养液中加入NaHCO33.7g加青霉素G钠,0.05g硫酸链霉素0.05g,用7.4%NaHCO3或1mol/L HCl调至pH为7.2-7.4。加小牛血清(20%的浓度)用于细胞培养。
2.2PBS缓冲盐溶液(g/L):NaCl8.0g,KCl0.20g,Na2HPO4·12H2O1.56g,KH2PO40.20g。用7.4%NaHCO3溶液或1mol/L HCl调pH值至7.4。
2.3消化液:胰酶,AMRESCO公司产品;EDTA-2Na,国药集团化学试剂有限公司产品。胰酶用PBS配至0.25%,过滤除菌;EDTA用PBS配至0.02%,高压灭菌。胰酶、EDTA1:1混合,4℃冰箱保存。
3.实验动物:
清洁级SD大鼠2批,230~250g,第一批大鼠由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供,动物合格证号:SCXK(苏)2009-0001,第二批大鼠由浙江省实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(浙)2008-0033;新生1~3天SD大鼠乳鼠,雌雄不限,由南京市江宁区青龙山动物养殖场提供。
4.实验仪器:
4.1HX-300呼吸机:成都泰盟科技有限公司。
4.2ECG-6511心电图机:上海光电医用电子仪器有限公司。
4.3HH-2数显恒温水浴锅:国华电器有限公司产品。
4.4BS224s型电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
4.5BS110s型电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
4.6DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。
4.7LDZ5-2离心机:北京医用离心机厂。
4.8超净工作台:苏州净化设备厂。
4.9倒置显微镜:OLYMPUS公司出厂,型号CKX41。
4.10水套式CO2无菌孵育箱:Thermo Electron Corporation,made in USA,FORMA3111,S/N:304481-7185。
4.11台式低速离心机:上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂,型号:CH80-2。
4.12恒温磁力搅拌器:上海司乐仪器有限公司,型号:85-2。
4.13电热鼓风干燥箱:上海福玛实验设备有限公司,型号:DGX-9143B-1。
4.14立式自控电热压力蒸汽灭菌器:上海博迅实业有限公司医疗设备厂,型号:YXQ-LS-50SⅡ。
4.15电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司,型号:BS224S。
4.16BIO-RAD Model680型酶标仪:英国BIO-RAD Laboratories Ltd。
5.复方丹参提取物对大鼠冠状动脉结扎所致急性心梗的影响:
取清洁级雄性SD大鼠,按体重随机分为9组,分别为伪手术组(蒸馏水),模型组(蒸馏水),提取物低(生药剂量81.15mg/kg),提取物中(生药剂量162.3mg/kg),提取物高(生药剂量324.6mg/kg),每组10只。各组大鼠每天灌胃给药一次,连续给药7天。给药容积为0.5ml/100g体重。于末次给药后1h,腹腔注射水合氯醛300mg/kg麻醉,仰位固定,手术切口部位先后用碘酒和酒精消毒,之后在第三、四根肋骨开胸,并进行人工呼吸,暴露心脏,用医用无损伤缝合针5/0结扎冠脉左前降支,迅速关闭胸腔并常规消毒,手术操作过程不超过30s,术后继续人工呼吸1~2min,肌注(i.m)20万单位青霉素预防感染。手术开始前5min、结扎后0s、1min、5min、15min、1h、4h分别记录标准II导联心电图,考察心电图J点的变化。
实验结束后,立即取出心脏,用生理盐水洗去血液,剪去心房及心底部血管,称心室重量,将心室沿房室沟平均切成5片放入1%TTC溶液内,在37℃恒温水浴染色5min,取出后首先拍数码照片,而后分离未染色部分(即梗塞部分)并称重计算其占整个心室重量的百分率(心肌梗塞百分率),并与缺血模型组进行组间t检验。计算梗塞百分率公式如下:
梗塞百分率(%)=苍白区重量/(心室重量)×100%
取心脏之前,对大鼠进行眼眶静脉丛取血1~2ml,2000rpm速度离心25min分离出血清,按试剂盒方法测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活性。结果见表1、表2、表3及图5。
表1.对冠脉结扎所致心肌缺血大鼠J点变化(mv)的影响
注:#P<0.05,##P<0.01,造模后各时间点与造模前进行自身前后比较;▲P<0.05,▲▲P<0.01,各组同时间点与模型组进行组间比较。
由表1可见,各手术组大鼠冠脉结扎手术后心电图J点显著高于手术前(p<0.01),说明造模成功。与模型组比较,术后15min,提取物中、提取物高组能显著性抑制J点的抬高(p<0.05),术后1h,提取物高组能显著性抑制J点的抬高(p<0.05),术后4h,提取物中、提取物高组能显著性抑制J点的抬高(p<0.05)。其他各组间比较均无显著性差异。
表2.对大鼠冠脉结扎所致心肌梗塞的影响
▲P<0.05,▲▲P<0.01,与模型组进行比较;c P<0.05,cc P<0.01,提取物中组与提取物高组进行组间比较。
由表2可见,模型组及各给药组心肌梗塞率均显著高于伪手术组,表明造摸成功。与模型对照组相比,提取物高组能够显著降低心肌梗塞率(p<0.05)。提取物中组与提取物高组比较,提取物中能极显著性降低心肌梗塞率(p<0.01)。
表3.对冠脉结扎所致心肌缺血大鼠血液生化指标的影响
*P<0.05,**P<0.01,与伪手术组进行比较;▲P<0.05,▲▲P<0.01,与模型组进行比较。
由表3可见,模型组血清中MDA、LDH、CK、CK-MB水平显著高于伪手术组(P<0.01),而SOD水平显著低于伪手术组(P<0.01),表明造模成功。与模型对照组相比,提取物中、提取物高组可显著降低心肌缺血大鼠血清MDA含量(P<0.05),提取物高组可显著性降低心肌缺血大鼠血清LDH(P<0.05),提取物中、提取物高组可显著性升高心肌缺血大鼠血清SOD活性(P<0.05),提取物高组可显著性降低心肌缺血大鼠血清CK的活力(P<0.05),提取物高组可显著性降低心肌缺血大鼠血清CK-MB(P<0.05)活力。
6.复方丹参提取物对中毒性心肌炎的影响:
6.1体外中毒性心肌炎模型:
新生1~3天SD大鼠乳鼠脱臼处死,用2%碘酊及75%乙醇分别消毒胸腹部皮肤,用虹膜剪剪开胸部皮肤,暴露皮下组织。用碘酊及乙醇消毒皮下组织,开胸取心,在盛有PBS液的平皿中洗去残留积血。分离心室,剪成1mm3碎块,以备消化。
根据实验要求,选用分次消化法制备心肌细胞悬液。为获得高纯度心肌细胞采用贴瓶分离法,将心肌细胞悬液静置在三角瓶或深的平皿中,37℃静置180min,很快上皮细胞贴壁,而心肌细胞尚未贴瓶,小心吸出细胞悬液,移种于其他培养皿中,按5×105/ml密度接种于96孔培养板,在37℃及5%CO2条件下,用含20%小牛血清的DMEM培养基静置培养。根据细胞贴壁生长及培养基pH值变化情况,每2~3天更换培养基一次。
原代培养72h的心肌细胞,换液、加药分组,模型组,卡托普利组(40μg/ml),提取物低(生药剂量253.6μg/ml),提取物中(生药剂量507.2μg/ml),提取物高(生药剂量1014.4μg/ml),孵育24h后加入阿霉素(1μg/ml)作用1h,空白对照组加入同等量的培养基。
显微镜下观察造模前及造模后心肌细胞搏动频率及变化的百分比,实验结果如表4所示。
表4.造模前及造模后心肌细胞搏动频率及变化的百分比
*P<0.05,**P<0.01,与空白对照组进行比较;▲P<0.05,▲▲P<0.01,与模型组进行比较。
由表4可见,各给阿霉素组与空白对照组造模前后变化的百分比相比,均有极显著性差异,表明造模成功(P<0.01)。与模型组相比,阳性药组、提取物高组显著性抑制阿霉素致体外心肌细胞搏动频率的降低(P<0.05)。其它各组间比较均无显著性差异(P>0.05)。
6.2体内中毒性心肌炎模型:
取清洁级雄性SD大鼠,按体重随机分为10组,分别为空白对照组(蒸馏水),模型组(蒸馏水),卡托普利组(15mg/kg),
提取物低(生药剂量81.15mg/kg),提取物中(生药剂量162.3mg/kg),提取物高(生药剂量324.6mg/kg),每组10只。各组大鼠每天灌胃给药一次,连续给药7天。给药容积为0.5ml/100g体重。于末次给药后1h,记录大鼠体重(BW1),尾静脉注射阿霉素(5mg/kg)造模24h后,称重(BW2),断颈处死,立刻开胸取出心脏,在冷生理盐水中洗去血液,剪去心脏周围组织和血管,滤纸吸去水分,用电子天平称量全心重(CW),计算全心重/体重(CW/BW,mg/g)即为心重指数,结果如表5所示。迅速取常规心肌组织块用2.5%戊二醛固定,做成电镜切片后观察心肌细胞超微结构,如图5所示。另取心肌组织研磨成组织匀浆,严格按照试剂盒说明测定心肌乳酸脱氢酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)的活力,结果如表6所示。
表5.对体内心肌炎模型大鼠体重及心重指数的影响
*P<0.05,**P<0.01,与空白对照组进行比较;▲P<0.05,▲▲P<0.01,与模型组进行比较。
由图6可知,空白对照组心肌细胞肌丝排列规则,Z线结构清楚,线粒体丰富,其嵴平行密集。模型组及提取物低组肌丝和线粒体排列紊乱,细胞肿胀,出现空泡样变性,胞核水肿严重。阳性药卡托普利组损伤显著减轻,Z线清楚,线粒体丰富,未见空泡样变性。提取物中、高组心肌细胞损伤较模型组轻,肌丝和线粒体排列较整齐,空泡样变性明显减少,仅见胞核轻度肿胀,水肿减轻。
表6.对体内中毒性心肌炎大鼠心肌酶的影响
*P<0.05,**P<0.01,与空白对照组进行比较;▲P<0.05,▲▲P<0.01,与模型组进行比较;○P<0.05,○○P<0.01,与卡托普利组进行比较。
由表6可见,各给阿霉素组与空白对照组相比,心肌酶均显著性升高,表明造模成功(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,阳性药卡托普利组能极显著性抑制阿霉素致心肌酶LDH的活力的升高(P<0.01),提取物高组能显著性抑制阿霉素致心肌酶LDH的活力的升高(P<0.05);与模型组相比,卡托普利组,提取物中、高组能显著性抑制阿霉素致心肌CK的活力的升高(P<0.05);与模型组相比,阳性药能显著性抑制阿霉素致心肌AST的活力的升高(P<0.05)。与阳性药组比较,提取物低、中组心肌酶CK的活力显著性升高(P<0.05),提取物高组心肌酶CK的活力极显著性升高(P<0.01)。其它各组间比较均无显著性差异(P>0.05)。
7、实验结论
与模型组比较,术后15min,提取物中、高剂量组能显著性抑制J点的抬高(p<0.05),术后1h,提取物高剂量组能显著性抑制J点的抬高(p<0.05),术后4h,提取物中、高剂量组能显著性抑制J点的抬高(p<0.05)。与模型对照组相比,提取物高剂量组能够显著降低心肌梗塞率(p<0.05)。提取物中剂量组与提取物高剂量组比较,提取物中剂量组能极显著性降低心肌梗塞率(p<0.01)。与模型对照组相比,提取物中、高剂量组可显著降低心肌缺血大鼠血清MDA含量(P<0.05),提取物高剂量组可显著性降低心肌缺血大鼠血清LDH(P<0.05),提取物中、高剂量组可显著性升高心肌缺血大鼠血清SOD活性(P<0.05),提取物高剂量组可显著性降低心肌缺血大鼠血清CK的活力(P<0.05),提取物高剂量组可显著性降低心肌缺血大鼠血清CK-MB(P<0.05)活力。试验表明,本发明的复方丹参提取物可以有效治疗心肌缺血引起的各种疾病,包括心肌梗死、急性冠状动脉综合征、房室阻滞、心律失常、冠心病心绞痛等。
与模型组相比,卡托普利组、提取物高剂量组能显著性抑制体外中毒性心肌炎心肌细胞搏动频率的降低(P<0.05)。与模型组相比,提取物高剂量组能显著性抑制体内中毒性心肌炎心肌酶LDH的活力的升高(P<0.05);与模型组相比,提取物中、高剂量组明显减轻心肌细胞超微结构损伤,并能显著性抑制体内中毒性心肌炎心肌CK的活力的升高(P<0.05)。与阳性药组比较,提取物低、中剂量组心肌酶CK的活力显著性升高(P<0.05),提取物高剂量组心肌酶CK的活力极显著性升高(P<0.01)。上述试验表明,本发明的复方丹参提取物可以抑制心肌炎、心肌梗死等疾病引起的心肌细胞损伤,抑制心肌炎等疾病引起的心肌缺血。
实施例一
(1)取450g丹参药材、88g三七药材,加3倍量95%乙醇提取2小时,然后再加2倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,60℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加5倍量水提取2小时,然后再加4倍量水提取1小时,过滤,合并两次所得滤液,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干AB-8型大孔树脂的量:生药量(上述步骤(1)中丹参三七药材的量)=1:1,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,再用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1BV/hr流速上到已处理好的AB-8大孔树脂柱(大孔树脂量:生药量=1:1),然后用1BV水以1BV/hr水洗除杂,最后用2.5BV的95%乙醇作为洗脱液,以1BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,60℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入10%碳酸氢钠溶液16.1ml,加热回流2小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
实施例二
(1)取490g丹参药材、10g三七药材,加2倍量100%乙醇提取3小时,然后再加3倍量100%乙醇提取1h小时,合并提取液,40℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加10倍量水回流提取1小时,过滤,再加入6倍量水回流提取0.5小时,过滤,药渣弃去。提取液合并,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干D-101型大孔树脂的量:生药量=0.5:1,以85%乙醇湿法装柱,继而用85%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,然后用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1.5BV/hr流速上柱,然后用2BV水以1.5BV/hr水洗除杂,最后用5BV的70%乙醇作为洗脱液,以1.5BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,取洗脱液80℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入5%碳酸钠溶液10ml,加热回流8小时,得复方丹参水解液,60℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
实施例三
(1)取100g丹参药材、400g三七药材,加5倍量70%乙醇提取0.5小时,然后再加2倍量70%乙醇提取2h小时,合并提取液,70℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加2倍量水回流提取3小时,过滤,再加入6倍量水回流提取2小时,过滤,药渣弃去。提取液合并,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干HPD-400型大孔树脂的量:生药量=1:2,以70%乙醇湿法装柱,继而用70%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,然后用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以0.5BV/hr流速上柱,然后用1.5BV水以1.2BV/hr水洗除杂,最后用1BV的100%乙醇作为洗脱液,以0.5BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,80℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入5%碳酸钠溶液10ml,加热回流6小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
实施例四
(1)取400g丹参药材、100g三七药材,加5倍量85%乙醇提取2小时,然后再加4倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,50℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加6倍量水回流提取2.5小时,过滤,再加入5倍量水回流提取1.5小时,过滤,药渣弃去。提取液合并,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干NKA-9型大孔树脂的量:生药量=1:1.5,以90%乙醇湿法装柱,继而用90%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,然后用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以0.8BV/hr流速上柱,然后用0.8BV水以0.8BV/hr水洗除杂,最后用2BV的90%乙醇作为洗脱液,以0.8BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,65℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入1%氢氧化钾溶液5ml,加热回流0.5小时,得复方丹参水解液,65℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
实施例五
(1)取450g丹参药材、50g三七药材,加3倍量90%乙醇提取2.5小时,然后再加3倍量90%乙醇提取1.5h小时,合并提取液,65℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加4倍量水回流提取2.5小时,过滤,再加入3倍量水回流提取2小时,过滤,药渣弃去。提取液合并,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干DM-301型大孔树脂的量:生药量=1:1.5,以80%乙醇湿法装柱,继而用80%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,然后用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1.2BV/hr流速上柱,然后用1.2BV水以1.2BV/hr水洗除杂,最后用4BV的80%乙醇作为洗脱液,以1.2BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,55℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味(约为药材量的1/4),得精制复方丹参浓缩液。加入10%碳酸氢钠溶液20ml,加热回流4小时,得复方丹参水解液,55℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
实施例六
取实施例一的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的PEG6000按照药辅比为1:3混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为80℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
实施例七
取实施例一的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的PEG4000按照药辅比为1:2混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为70℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
实施例八
取实施例一的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的辅料按照药辅比为1:5混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为90℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
实施例九
取实施例一的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的PEG4000按照药辅比为1:2.5混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为85℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
实施例十
取实施例一的复方丹参提取物,加适量水溶化,与预溶化的辅料按照药辅比为1:3.5混合均匀,加入冰片适量,进行化料,化料温度为75℃。化料均匀后,转移至滴丸机的滴灌中;药液滴至0-10℃的液体石蜡中,取出滴丸,除油,筛网选丸,即得。
实施例十一
片剂
【处方】实施例一得到的提取物100g 微晶纤维素50g 微粉硅胶3g硬脂酸镁1.5g
【制法】取原、辅料分别过100目筛;取浸膏、微晶纤维素,混匀,用60%乙醇适量作为粘合剂制软材,过20目筛制颗粒,60℃干燥,取出,过30目筛整粒,加入微粉硅胶及硬脂酸镁,混匀,压片,制成1000片,即得。
实施例十二
【处方】实施例二得到的提取物75g 微晶纤维素37g 微粉硅胶2.3g硬脂酸镁1.1g
【制法】取原、辅料分别过100目筛;取浸膏、微晶纤维素,混匀,用60%乙醇适量作为粘合剂制软材,过20目筛制颗粒,60℃干燥,取出,过30目筛整粒,加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁,混匀,压片,制成1000片,即得。
实施例十三
取实施例三所得提取物5.0g与10g木糖醇,0.8g低聚异麦芽糖,10g赤藓糖醇,0.05阿斯巴甜,其余为水即得复方丹参口服液。
实施例十四
取实施例一所得提取物25%,木糖醇48%,麦芽糖6%,14%环糊精,7%乳酸钙按照软胶囊常规工艺制备复方丹参软胶囊。
Claims (4)
1.一种复方丹参提取物,其特征在于,所述提取物的制备方法包括以下步骤:
(1)取丹参、三七药材,加3倍量95%乙醇提取2小时,然后再加2倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,60℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加5倍量水提取2小时,然后再加4倍量水提取1小时,过滤,合并两次所得滤液,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干AB-8型大孔树脂的量:步骤(1)中丹参三七药材的量的生药量=1:1,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,再用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1BV/hr流速上到已处理好的AB-8大孔树脂柱,大孔树脂量与生药量比=1:1,然后用1BV水以1BV/hr水洗除杂,最后用2.5BV的95%乙醇作为洗脱液,以1BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,60℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味,为药材量的1/4,得精制复方丹参浓缩液,加入10%碳酸氢钠溶液16.1ml,加热回流2小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
2.如权利要求1所述的提取物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取丹参、三七药材,加3倍量95%乙醇提取2小时,然后再加2倍量95%乙醇提取1h小时,合并提取液,60℃减压浓缩、干燥,即得醇提物;
(2)取醇提药渣,加5倍量水提取2小时,然后再加4倍量水提取1小时,过滤,合并两次所得滤液,即得水提液;
(3)大孔树脂预处理:取干AB-8型大孔树脂的量:步骤(1)中丹参三七药材的量的生药量=1:1,以95%乙醇湿法装柱,然后用95%乙醇洗至滤液与水(1:3)混合不呈白色浑浊即可,再用大量的蒸馏水洗至无醇味,备用;
(4)取所述水提液,以1BV/hr流速上到已处理好的AB-8大孔树脂柱,大孔树脂量与生药量比=1:1,然后用1BV水以1BV/hr水洗除杂,最后用2.5BV的95%乙醇作为洗脱液,以1BV/hr洗脱,收集洗脱液,备用;
(5)取步骤(4)所得洗脱液,60℃减压浓缩,回收乙醇至无醇味,为药材量的1/4,得精制复方丹参浓缩液,加入10%碳酸氢钠溶液16.1ml,加热回流2小时,得复方丹参水解液,70℃减压浓缩至干,即得水提物;
(6)合并步骤(1)所得醇提物与步骤(5)所得水提物即得本发明所述复方丹参提取物。
3.一种复方丹参制剂,其特征在于,以权利要求1所述的复方丹参提取物,作为药物活性物质,需要时加入药物可接受的载体,按照制剂学的常规技术制成的制剂。
4.如权利要求1所述的提取物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
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