CN101461843A - 一种用于缺血性疾病的药物组合物及其在药物制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于缺血性疾病的药物组合物，它是由以下重量配比的原料组成：黄芪5－15份、丹参2－8份、川芎1－5份、红花1－5份、地龙1－3份。本发明同时公开了该药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物制剂中的应用；在制备治疗缺血性心肌病药物制剂中的应用；在制备治疗缺血性肠病药物制剂中的应用。本发明药物组合物可以用于预防和治疗缺血性脑卒中、缺血性心肌病以及缺血性肠病等缺血性疾病。也可用于治疗冠心病、动脉硬化、以及肠系膜静脉栓塞。其药物作用针对性强、药效明显。它为临床用药提供了更多的用药选择。

Description

一种用于缺血性疾病的药物组合物及其在药物制剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药配制品及其用途，具体地说是一种用于缺血性疾病的药物组合物及其在药物制剂中的应用。

背景技术

缺血性疾病是指由于动脉痉挛、狭窄、慢性闭塞而使受累器官处于低血流状态，造成器官的萎缩、功能障碍、甚至坏死。典型的缺血性疾病包括有缺血性脑卒中、缺血性心肌病、缺血性肠病等。

缺血性脑卒中是指突然发生的脑组织局部供血动脉血流灌注减少或血流完全中断，停止供血、供氧、供糖等，造成脑组织缺血缺氧，出现一系列的急性临床症状。若未能及时恢复供血，神经细胞、胶质细胞和血管将会坏死，形成脑梗死。缺血性脑卒中的主要原因为：①动脉粥样硬化所致血栓栓塞；②心脏来源的栓子所致脑栓塞。按照病理生理演变过程，临床上将缺血性脑卒中分为超早期(发病的6小时内)；早期(发病的6—72小时内)；急性后期(发病的72小时—1周内)；恢复期(发病的一周后)。缺血性脑卒中的超早期，发病时间短，未形成脑梗死，该期的病理生理状态是脑组织缺血缺氧，但未引起组织的结构改变，仅为不同程度的功能障碍，CT上可能还看不到病灶。若及时地恢复正常的供血，清除缺血组织内的某些有害的代谢产物，病人可能得到完全恢复。此期是缺血性脑卒中治疗的最理想时机，若选择溶栓疗法，一般认为会收到较满意的疗效。但实验与临床研究发现，血管再通、血液再灌注往往使原有症状更严重，即可发生再灌注损伤。有实验证实，血管闭塞3～4h(小时)后血流全部恢复，3d(天)后梗塞面积较完全永久闭塞增大2～2.5倍。另有许多研究报道认为，再灌注损伤几乎与所有的相关因素有关：①在生物化学方面，其可导致众多的相关生化物质改变，如神经介质紊乱、代谢产物过多、血栓素增多及前列环素减少、各种活性神经肽紊乱、细胞内钙离子升高、兴奋性氨基酸增多及抑制性氨基酸减少、细胞因子的改变、炎性因子的增高等。②在分子生物学方面，其可导致许多相关基因的变化，如缺血区及其周围出现大量的凋亡细胞，凋亡因子明显升高，凋亡相关的各种基因上调等。③在形态学方面，其可使缺血脑组织细胞坏变加重、水肿明显、梗死面积加大等。因此，在治疗缺血性脑卒中时，临床更为需要的药物是既可以适于早期用药，又可有效防止再灌注损伤。

缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy，ICM)是指由冠状动脉粥样硬化引起长期心肌缺血，导致心肌弥漫性纤维化，产生与原发性扩张型心肌病类似的临床综合征随着冠心病发病率的不断增加，ICM对人类健康所造成的危害也日渐严重。目前临床在治疗缺血性心肌病时，最有针对性的治疗就是改善心肌缺血。如服用硝酸甘油、硝酸异山梨酯、钙通道拮抗药等化学合成药物。这些药物存在的问题是硝酸酯类药物可以产生耐药性和药物依赖性。而钙通道拮抗药的禁忌较多。中医中药在治疗缺血性心肌病时多采用扶正去邪，辩证论治的原则。在组方中，多以植物中药为原料。其优点是药效缓和，毒副作用小。不足之处是，许多药物的原料资源紧缺，药品成本高。

缺血性肠病一般是指因肠壁缺血、缺氧，最终发生梗死的疾病。本病多见于患动脉硬化，心功能不全的老年患者。造成肠缺血的直接原因多为肠系膜动、静脉，特别是肠系膜上动脉因粥样硬化或血栓形成引起的血管闭塞及狭窄。临床在治疗缺血性肠病时，认为早期诊断，早期溶栓、抗凝治疗具有较好的效果。而事实上，缺血性肠病的临床表现往往缺乏特异性。因此通常难以在早期得到确诊。再者，现有用于缺血性肠病的溶栓、抗凝药物大多为化学合成药物，其同样存在许多不良反应。因此，临床医师更为期待能有既可有效预防缺血性肠病、也可用于治疗缺血性肠病的药物问世。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种用于缺血性疾病的药物组合物，同时提供该药物组合物在制备治疗缺血性疾病药物制剂中的三种应用。

本发明的目的是这样实现的：

本发明的药物组合物是由以下重量配比的原料组成：

黄芪5-15份、丹参2-8份、川芎1-5份、红花1-5份、地龙1-3份。

本发明同时提供了上述药物组合物在以下三方面的医药新用途：

(1)上述药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物制剂中的应用。

(2)上述药物组合物在制备治疗缺血性心肌病药物制剂中的应用。

(3)上述药物组合物在制备治疗缺血性肠病药物制剂中的应用。

本发明将上述5味中草药伍用，产生了良好的协同作用，其具体表现在：

(1)本发明药物组合物可有效改善脑组织缺血，减少脑梗死范围，降低全血黏度值和血浆纤维蛋白原，减轻再灌注损伤所致神经缺损，对PC₁₂细胞具有营养和促进细胞增殖的作用，对H₂O₂引起的PC₁₂细胞凋亡具有保护作用。因此本发明首次提出该药物组合物可在制备治疗缺血性脑卒中药物制剂中得到应用。

(2)本发明药物组合物可增加冠脉血流量、降低冠脉阻力、减少心肌缺血程度及范围，改善了心肌缺血，减少心肌梗死范围。因此本发明首次提出该药物组合物可在制备治疗缺血性心肌病药物制剂中得到应用。

(3)本发明药物组合物可延缓肠系膜血管内血栓形成，同时具有溶解肠系膜血管内血栓的作用，因此本发明首次提出该药物组合物可在制备治疗缺血性肠病药物制剂中得到应用。

本发明药物组合物，可按照常规的中草药提取技术对其进行提取。再按照常规制剂要求，将提取物与常规的药用辅剂(如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等)混合，制成颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服液等口服制剂或注射液、输液剂等注射制剂。但所有这些剂型的选择，不能用于限制本发明的保护范围。

本发明在此提供一种药物制剂方法：

称取丹参、川芎，加3倍量70％乙醇浸泡3次，每次48小时，合并乙醇提取液，滤过，回收乙醇至无醇味，备用。药渣与黄芪、地龙粗粒、红花药材加8倍量水，煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，与醇提部分合并，继续浓缩至相对密度为1.25-1.30(80℃)的清膏，取清膏加入辅料适量，制成临床可接受的剂型，如片剂、口服液体制剂、胶囊剂、颗粒剂等。

本发明药物组合物可以用于预防和治疗缺血性脑卒中、缺血性心肌病以及缺血性肠病等缺血性疾病。也可用于治疗冠心病、动脉硬化、以及肠系膜静脉栓塞。其药物作用针对性强、药效明显。它为临床用药提供了更多的用药选择。

本发明用于预防或治疗缺血性脑卒中、缺血性心肌病或缺血性肠病等疾病时，可经口服或不经口服给药。给药量也因剂型不同以及患者病情的轻重不同而有所不同。在临床应用中应尊重医嘱。

一般来说，成年人口服用药量，每天以生药量计22-100g比较适宜。肌注或静脉注射用药每天以生药量计22-44g比较适宜。

本发明的优选配方为：

黄芪10份、丹参5份、川芎3份、红花3份、地龙1份。

本发明药物组合物(以下简称SQNB)所具有有益效果，通过下述试验得到了证实。

实验一 SQNB对光化学诱导的大鼠局灶性脑梗死的治疗作用

1、实验动物及分组：雄性3月龄SD大鼠，体重：200-250g，由解放军总医院实验动物中心提供，动物为清洁级(合格证号：D98010)，共60只。随机分为空白对照组、SQNB1组、SQNB2组和金纳多药物治疗组(以下简称金纳多组)、溶栓胶囊药物治疗组((以下简称溶栓组)，每组12只。

2、实验方法：10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35ml/100g)后，于头正中切开头皮，分离左顶部骨膜，暴露左顶部颅骨；股静脉注射2％玫瑰红(ROSEBENGA)(SINGMA公司生产，分子量1017)25mg/kg，5min后用冷光源照射左顶部10min，冷光源距颅骨5mm，用黑色脚步覆盖周围颅骨，暴露照射范围约5×8mm²，照射温度22℃。

3、实验用药与给药方法：

SQNB(采用实施例1所制药物)；金纳多片：每片含40mg银杏叶提取物(德国威玛舒培大药厂生产，批准文号：X970357，批号：2210899)；溶栓胶囊0.25g/粒(山西中远威药业有限公司生产，批号：20000810)。

根据成人剂量与体重折算系数比公式计算大鼠每公斤体重用药量。SQNB组大鼠每日用药量(按生药量计)：SQNB1组3.2g/kg/体重/天，SQNB2组为6.4g/kg/体重/天；金纳多组200mg/kg/体重/天；溶栓组大鼠每日用药量为213mg/kg/体 重/天。各组大鼠一天用药量分别为溶于2ml饮用水灌胃。给药时间是成模大鼠术后3h、术后1d、2d、3d、4d，共5d。空白对照组给予等量饮用水灌胃。

4、结果

4.1 一般情况观察

空白对照组及治疗组均于术后2-3d内出现活动减少，体重减轻。3d后体重增加，毛皮光泽及亮度渐好转，精神状态亦有明显改善，自主化活动增加。SQNB组恢复较空白对照组及金纳多组稍快，单个之间均无显著差异。详见表1-1。

表1-1  各治疗组不同时间点体重变化

 

	术前	术后1d	术后2d	术后3d	术后4d	术后5d
							对照组	255.75±14.81	244.25±12.41	245.7±18.16	254.88±19.26	261.00±10.89	265.63±21.01
SQNB2组	254.13±11.35	246.38±13.12	259.38±14.25	258.14±11.45	261.83±15.26	266.40±11.38
							SQNB1组	256.13±17.26	247.88±15.12	254.38±16.58	257.00±14.32	261.38±12.16	272.00±15.42
溶栓组	259.60±11.95	245.83±12.15	247.00±16.34	250.00±15.43	253.17±16.17	260.16±19.20
							金纳多组	256.20±19.21	240.60±16.54	258.40±14.36	266.20±20.02	262.20±15.25	276.60±14.78

4.2 神经功能评定

大鼠于光化学诱导成功后3h、1d、2d自主活动减少，但大部分未见肢体瘫痪。空白对照组有2只于术后24h出现病灶对侧前爪向内侧屈曲，活动受限，评分为1分，金纳多组有一只类似情况，且均在72h内缓解。SQNB组和溶栓组大鼠无神经功能缺失的表现。

4.3 梗塞灶体积

大鼠脑组织经TTC染色后，均在照射区大脑皮层出现边界清晰、范围恒定的苍白梗塞灶。SQNB组及溶栓组梗死体积灶体积均较空白对照组减小，统计学差异极显著(P<0.001)。金纳多组梗死灶体积也较空白对照组小(P<0.05)。SQNB组与金纳多组相比，梗塞灶体积明显小，统计学有显著差异性(P<0.05)。详见表1-2

表1-2  各组大鼠脑梗死体积比较(均数±标准差)

 

组别	n	梗塞灶体积(mm3)
			空白对照组	12	16.54±5.91
SQNB2组	12	5.56±2.41**
			SQNB1组	12	6.09±1.55**▲
金纳多组	12	11.35±4.193*
			溶栓组	12	7.66±4.44**

注：**与空白对照组比较(P<0.001)；*与空白对照组比较(P<0.05)^▲与金纳多组比较(P<0.05)

实验二 SQNB对线拴法大鼠局灶脑缺血及再灌注损伤的治疗作用

1、实验动物及分组：

雄性3月龄SD大鼠，体重：200-250g，由解放军总医院实验动物中心提供，动物为清洁级(合格证号：D98010)，共72只。随机分为假手术组、病理对照组和SQNB组和金纳多组、溶栓组，每组12只。

2、动物模型制备

大鼠用10％水合醛氯腹腔注射麻醉，平卧于手术台上，四肢线绳固定，消毒视野，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，分别于CCA、ICA处穿线以备拉提，游离ECA主干，至舌动脉和颌动脉分叉处用7个0丝线扎结ECA，用7个0丝线在ECA自CCA分出处打一活结备用，提拉CCA、ICA处穿线阻断血流，在ECA离心段结扎处附近剪开一个0.2mm小口，将4个0丝线插入，ECA近端活结扎死，放松CCA、ICA处穿线恢复血流，剪断ECA远端，拉直使之与ICA呈一直线，将线栓经CCA分叉处沿ICA插入颅内至大脑前动脉，直至遇到阻力为止。从侧面阻断大脑中动脉开口，尼龙线插入深度由分叉部计18.5±0.5mm。缝合颈部皮肤。于术后6h拔出栓线，支撑脑缺血再灌注损伤大鼠模型。

3、实验用药及给药方法同实验1

4、结果

4.1 大鼠的自然死亡和7d存活情况：

病理对照组大鼠的自然死亡数高达50％，SQNB组自然死亡比率下降到25％，金纳多组大鼠死亡比例为33.33％。溶栓组大鼠的死亡比例为41.7％。详见表2-1。

表2-1  各组大鼠死亡例数和百分比(％)

 

组别	n	自然死亡数  (％)	7d存活数    (％)
				假手术组	12	0           (0)	12          (100)
病理对照组	12	6           (50)	6           (50)
				SQNB2组	12	3           (25)	9           (75)
SQNB1组	12	3           (25)	9           (75)
				金纳多组	12	4           (33.3)	8           (66.7)
溶栓组	12	5           (41.7)	7           (58.3)

4.2 一般状况及体重变化：

对照组及SQNB组于术后均出现精神不振，皮毛光泽暗淡，术后第3dSQNB组大鼠的精神状态和皮毛光泽恢复较对照组快。所有大鼠术后后均出现体重下降，治疗组大鼠术后3d始体重增加，第7dSQNB组和金纳多组大鼠的平均体重较病理对照组重，统计学有显著性差异，与溶栓组相比也有显著性差异。病理对照组存活大鼠体重增加较缓慢。详见表2-2。

表2-2  各组大鼠体重变化

 

组别	术前	术后1d	2d	3d	4d	5d	6d	7d
									病理对照组	242.1±8.0	232.2±9.7	229.2±11.8	219.1±10.8	223.6±9.8	221.8±8.8	226.7±7.8	235.2±8.0
SQNB2组	241.2±8.0	227.3±11.8	203.5±16.8	239.2±14.2	243.6±11.1	249.9±10.8	254.2±13.4	260.6±15.8*▲
									SQNB1组	242.5±8.0	231.5±10.5	227.9±13.8	230.1±9.8	239.3±13.8	242.1±11.6	253.1±10.8	259.9±11.3*▲
金纳多组	242.3±6.8	230.1±12.8	232.1±10.8	233.0±9.8	239.5±9.9	240.9±10.8	250.1±9.0	251.9±8.8*
									溶栓组	242.5±7.2	228.5±20.8	210.9±17.8	211.9±13.8	220.3±12.5	230.1±11.2	233.3±11.1	240.1±11.9

注：*与病理对照组比较(P<0.05)；^▲与溶栓组比较(P<0.05)

4.3 神经功能评分结果(详见表2-3)。

术后3h对照组及SQNB组、金纳多组和溶栓组大鼠的神经功能评分各组分间无显著差异。术后24和48h病理对照组大鼠神经功能评分增高，死亡例数增多，术后第7dSQNB组神经功能评分较病理对照组低，统计学均有显著性差异(P<0.05)。其余各治疗组神经功能评分较病理对照组相比，统计学无显著性差异(P>0.05)。SQNB组神经功能评分与溶栓组相比，统计学均有显著性差异(P<0.05)。详见表2-3。

表2-3  个组大鼠神经功能评分

 

组别	术后	24h	2d	3d	4d	5d	6d	7d
									病理对照组	2.1±0.42	3.0±0.55	3.2±0.53	3.2±0.61	3.2±0.63	2.8±0.60	2.6±0.60	2.5±0.63
SQNB2组	2.2±0.35	2.3±0.63	2.3±0.61	2.3±0.65	2.3±0.59	1.8±0.63	1.8±0.63	1.6±0.60*▲
									SQNB1组	2.5±0.44	2.7±0.61	2.5±0.62	2.5±0.67	2.2±0.63	1.6±0.61	1.6±0.61	1.5±0.62*▲
金纳多组	2.0±0.47	2.8±0.63	2.6±0.51	2.6±0.53	2.5±0.60	2.4±0.63	2.2±0.72	2.1±0.73
									溶栓组	2.0±0.35	3.0±0.71	3.2±0.62	3.3±0.61	3.2±0.63	2.7±0.59	2.7±0.59	2.6±0.59

注：*与病理对照组比较(P<0.05)；^▲与溶栓组比较(P<0.05)

4.4 血液流变学和血浆纤维蛋白原检查结果：

SQNB组血液的切变率(分别为200、30、5和1)的全血黏度值和血浆纤维蛋白原的平均值均较病理对照组和金纳多组低，统计学均有显著性差异(P<0.05)；但与溶栓组相比统计学无显著差异。详见表2-4。

表2-4  各组大鼠全血粘度(mPas)和血浆纤维蛋白原检查结果

 

实验项目	对照组	SQNB2组	SQNB1组	金纳多组	溶栓组
							n＝6	n＝9	n＝9	n＝8	n＝7
切变率200	4.74±0.27	3.05±0.51*▲	3.19±0.27*▲	4.39±0.44	3.15±0.46*▲
						切变率30	6.98±1.65	4.33±1.29*▲	4.64±1.30*▲	6.24±2.65	4.25±1.25*▲
切变率5	14.09±2.16	8.21±2.75**▲▲	8.36±2.50**▲▲	11.86±2.39*	8.28±3.65**▲▲
						切变率1	36.88±7.72	20.43±6.91**	20.21±6.17**▲▲	29.53±8.93	19.53±7.93**▲▲
血浆纤维蛋白原	337.9±21.0	210.6±20.2**▲▲	276.8±21.1**▲▲	320.7±27.2	200.1±27.2**▲▲

与病理对照组比较：*P<0.05**P<0.01；与金纳多组比较：^▲P<0.05  ^▲▲P<0.01

4.5 脑梗死灶体积

存活7d的小鼠，麻醉处死，TTC染色，梗死灶体积图像分析。由表2-5各组大鼠脑梗死灶体积可见，SQNB组和金纳多组梗死灶体积较病理对照组小，统计学均有显著差异(P<0.05)。SQNB组较溶栓组小，统计学有显著差异(P<0.05)，但与金纳多组相比无显著性差异(P>0.05)。

表2-5  各组大鼠脑梗死灶体积

 

组别	脑梗死灶体积(mm3)
		病理对照组(n＝6)	41.9±7.3
SQNB2组(n＝9)	26.1±6.9*▲
		SQNB1组(n＝9)	26.5±5.2*▲
金纳多组(n＝8)	31.3±6.7*▲
		溶栓组(n＝7)	40.7±9.8

与病理对照组比较：*P<0.05；与溶栓胶囊组比较：^▲P<0.05

4.6 脑组织病理学

在48h内死亡大鼠，脑组织HE染色可见病变侧脑水肿明显，中线结构向对侧移位，侧脑室受压。在脑梗死病灶内显微镜下可见点片状出血灶，神经元数目减少，呈缺血性改变，大鼠死亡原因为脑缺血再灌注损伤引起的脑水肿，脑疝。其他各组48h内死亡大鼠的脑大体病理所见与病理对照组相似。

实验三 SQNB对PC₁₂细胞的营养及抗凋亡作用

1、实验动物及分组：

雄性3月龄SD大鼠，体重：200-250g，由解放军总医院实验动物中心提供，动物为清洁级(合格证号：D98010)，共36只。随机分为对照组、SQNB1组、SQNB2组，每组12只。

2、实验方法：

2.1 含SQNB大鼠血清对PC₁₂细胞的营养作用

PC₁₂细胞按2×10⁴个/ml接种于24孔板中，加入含10％小牛血清的EMEM培养基，于37℃，5％CO₂培养过夜(10-12h)。将细胞随机分成共4组，吸去原培养液，分别加入含10％各组大鼠血清的DMEM培养液中继续培养。分别于加药后24h、60h和86h照相，胰酶消化、收集各组(每组6孔)细胞，制成单细胞悬液，MTT法测定OD₅₉₅.

2.2SQNB对H₂O₂所致PC₁₂细胞凋亡的保护作用

PC₁₂细胞按2×10⁴个/ml接种于24孔板中，加入含10％小牛血清的EMEM培养基，于37℃，5％CO₂培养过夜(10-12h)。将细胞随机分成共6组，吸去原培养液，正常对照组加入含10％小牛血清DMEM培养基；凋亡模型组加入含100μMH₂O₂的10％小牛血清DMEM，SQNB1组、SQNB1组分别加入100μMH₂O₂的10％各组大鼠血清的DMEM培养基。细胞在37℃、5％CO₂中孵化24h后，吸去各孔培养液，胰酶消化，用含5％相应血清的培养基制成单细胞悬液，MTT法测定OD₅₉₅.

2.3DNA片断化分析

收集2×10⁶个细胞，加入200μl裂解液(10mM EDTA，50mM Tris-HCL，pH8.0，100μg/ml蛋白酶K)，56℃作用1-2h，等体积酚-氯仿-异戊醇抽提，离心收集上清，1/10体积3M醋酸钠和2倍体积乙醇沉淀DNA，12000转/min离心15min，70％乙醇洗沉淀2次，空气干燥，用10-20μl用含Rnase50μg/ml TE溶解DNA，1％琼脂糖电泳，120V，12h。

3、实验用药与给药方法：

SQNB组药量同实验1，每只大鼠2ml，每天上午灌胃一次，对照组给予等量饮用水灌胃，连续7d(2ml)，1次/日。第7d下午，用10％水合醛氯麻醉大鼠，迅速腹主动脉取血，无菌分离血清，-20℃保存。

4、结果

4.1 MTT法观察SQNB对神经细胞的营养作用

加入不同处理组大鼠含药血清作用24h、60和86h后，SQNB1组、SQNB2组大鼠血清处理细胞均比对照组生长旺盛，MTT结果也显示SQNB组细胞数明显高于对照组(P<0.001)，且SQNB组间比较无统计学差异。表明，SQNB可明显促进细胞存活和增值，且无剂量与效应关系。详见3-1。

表3-1  给药后不同时间各组OD₅₉₅值(x±SD)

 

组别	给药后24h	给药后60h	给药后86h
				对照组	0.27±0.073	0.65±0.037	1.17±0.074
SQNB2组	0.54±0.036*	0.91±0.106*	1.53±0.055*
				SQNB1组	0.61±0.035*	1.12±0.125*	1.52±0.109*

4.2 MTT法观察SQNB对神经细胞凋亡的保护作用

实验结果显示，用100μMH₂O₂可明显引起PC₁₂细胞凋亡。MTT实验结果显示：SQNB对凋亡的保护作用呈现出明显的剂量效应关系，大剂量(SQNB2组)显效明显高于小剂量(SQNB1组)(P<0.001)，且非常接近不加H₂O₂的空白对照组，表明大剂量SQNB可以几乎完全地对抗H₂O₂氧化损伤作用。详见3-2。

表3-2  SQNB对H₂O₂所致PC₁₂细胞凋亡的保护作用

 

组别	OD595值(x±SD)
		空白对照组	1.005±0.170**
100μMH2O2组(凋亡组)	0.543±0.034
		SQNB2组	0.631±0.049△
SQNB1组	0.795±0.077△△

^*与凋亡组比较P<0.001；^△与凋亡组比较P<0.05；^△△与凋亡组比较P<0.001；

4.3 DNA片断化分析

100μMH₂O₂可明显诱导细胞凋亡，出现DNA ladder。含SQNB组大鼠血清处理的PC₁₂细胞，DNA ladder的出现明显减轻。实验结果表明含SQNB的大鼠血清具有抑制H₂O₂诱导PC₁₂细胞凋亡的作用。

实验四 SQNB对大鼠凝血时间和血小板聚集率的影响

1、实验动物及分组：

雄性3月龄SD大鼠，体重：200-250g，由解放军总医院实验动物中心提供，动物为清洁级(合格证号：D98010)，共48只。随机分为模型组、SQNB1组、SQNB2组和金纳多组，每组12只。

2、实验方法：

2.1 凝血时间检测方法

利用线拴法之称脑缺血再灌注损伤模型(见上)，再灌注24h，10％水和氯醛麻醉。固定于台上，腹主动脉采血将血滴于玻片上，以细玻璃棒挑起后有丝状凝血为准，记录凝血时间。

2.2 ADP诱导的血小板聚集率测定

10％水合氯醛腹腔注射麻醉，打开腹腔暴露腹主动脉，从腹主动脉采血，3.8％枸橼酸钠与血的比例为1∶9，采血后轻轻混匀。每只大鼠常规制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，运用生物显微镜计数PRP的血小板数，用PPP调PRP至血小板为45-55万/mm3(大于55万/mm3，用PPP调整)，取PRP与PPP各20μl分别置于两个比色杯中，加入10μl生理盐水，混合后置37℃保温2min，PRP杯诱导聚集反应，反应时间5min。用血小板聚集仪测定血小板最大聚集(PA)。

3、实验用药与给药方法：

成模鼠于术后3h、术后1d、2d、3d、4d给予SQNB，剂量同实验一，灌胃，每只大鼠2ml，每天上午灌胃一次，模型组给予等量饮用水灌胃。

4、结果

4.1 脑缺血3h，再灌注24h后，SQNB组和金纳多组大鼠的凝血时间较模型组延长，统计学均有显著性差异(P<0.01)；而且SQNB组大鼠的凝血时间与金纳多组相比统计学有显著性差异(P<0.05)。详见表4-1.

表4-1  SQNB对局灶性MCAO大鼠凝血时间的影响

 

组别	SQNB1组	SQNB2组	金纳多组	模型组
					凝血时间(s)	6.58±0.95*△△	8.0±0.64*△△	5.46±0.93	2.57±0.54

*与金纳多组比较(P<0.05)^△△与模型组比较(P<0.01)

结果显示，SQNB组及金纳多组大鼠的血小板聚集率较模型组低(P<0.01)，SQNB组大鼠的血小板聚集率与金纳多组相比，统计学无显著差异(P>0.05)。详见表4-2.

表4-2  SQNB对大鼠局灶性脑缺血时血小板聚集率的影响

 

组别	SQNB1组	SQNB2组	金纳多组	模型组
					血小板聚集率	41.62±4.83**	38.66±2.44**	42.04±6.36**	62.8±5.24

*与模型组比较(P<0.05)**与模型组比较(P<0.01)

实验五 SQNB对大鼠心肌缺血性梗死的预防、治疗的作用

试验例：

材料与方法

仪器

16道生理记录仪(MP—150型，美国BIOPAC)，全自动血气分析仪(ABL5，丹麦)，全自动生化分析仪(TBA-120FR，日本)，彩超(L4000C1 PR，韩国)，液闪计数器(Wallac，发玛西亚)，全自动血气分析仪(TBA-120FR，日本)。试剂与药物

肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购于北京中生生物工程高技术公司，内皮素(ET)、血栓素B₂(TxB₂)、6—酮—前列腺素F₁α(6-KetoPGF1α)放免药盒购于北京福瑞生物工程公司，红四氮唑购于天津联星生物技术公司。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒购于南京建成生物试剂公司。

SQNB注射液：10ml/支(实施例2所制备)。

人参茎叶皂苷注射液：沈阳双鼎制药有限公司制备。

实验动物

Wistar大鼠，购于北京维通利华公司，SPF级，雄性，体重240—260g。合格证号：SCX(京)2002-0003。

实验分组

SQNB 1组、SQNB 2组，人参茎叶皂苷组，模型组，假手术组和正常组。每组10只。

大鼠心肌缺血模型的复制

大鼠冠脉结扎按文献方法稍加改进(参考李仪奎，等：中药药理实验方法学；第一版，上海科学技术出版社，上海，1991)，在乙醚麻醉下仰位固定于手术台，自左侧3—4肋间开胸，暴露心脏，于肺动脉圆锥及左心耳间以0号线立即结扎冠脉左前降支，将心脏送回胸腔，并挤出胸腔内血液和气体，迅速关闭胸腔，开胸时间不超过30S。假手术组仅置缝线而不结扎冠脉左前降支。

药物干预

各组动物于术后即刻经舌下静脉给药，正常组及假手术组注射生理盐水；SQNB1组注射SQNB注射液1.8ml/kg；SQNB2组注射SQNB注射液3.6ml/kg；人参茎叶皂苷组注射人参茎叶皂苷注射液1.8ml/kg。各组给药体积用生理盐水调整至3.6ml/kg。

指标检测

超声检测

各组动物给药后150min，10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，取平卧位，剪去胸前区毛，涂耦合剂。参照文献方法(李仪奎，等：中药药理实验方法学；第一版，上海科学技术出版社，上海，1991)选用9MHz高频矩阵探头，垂直于左胸壁，并与胸骨成10—30度夹角，显示心脏沿二尖瓣口至心尖方向的左室长轴像。将探头转动90度，显示垂直于左室长轴的左室短轴像。将扫描深度调为4mm，在B型超声左室长轴像引导下，左室内径最大处(即乳头肌水平)显示M型超声图像，测量左室内径及室壁厚度，然后将取样点置于二尖瓣处，显示多普勒超声，测量血流速度。每项指标均测量三个心动周期，取平均值，进行左室功能分析。测量参数：心率(HR)，射血分数(EF)，心输出量(CO)和左室短轴缩短率(FS％)。

左室内压测定

各组动物完成超声检测后，随即仰卧位固定于手术台上，在甲状软骨下缘沿颈前正中线向下达胸骨上切迹切开皮肤及皮下组织，分离颈阔肌与深筋膜，从胸骨舌骨肌、胸骨甲状肌和胸锁乳突肌之间向深部解剖，暴露右侧颈总动脉，将右侧颈总动脉与迷走神经分离，结扎右侧颈总动脉远心端，动脉夹临时夹闭右侧颈总动脉近心端，在右侧颈总动脉上作一下斜行切口。实验用内充肝素—生理盐水溶液(125U/ml)心导管与16道生理记录仪压力放大器的压力换能器连接，在16道生理记录仪监侧下，将心导管沿右颈总动脉逆行插入左心室，固定导管后创面用生理盐水纱布覆盖，同时监测II导联心电图，稳定动物状态30min，测定左心室内压(LVSP)、舒张末期压(LVEDP)，再经微分计算左室内压上升最大速率(+dp/dt._max)及下降最大速率(-dp/dt_max)，并将上述指标进行同步记录。

血生化指标检测

左室内压测定完毕，立即取动脉、静脉血，全自动血气分析仪检测动、静脉血氧浓度；取动脉血全自动生化分析仪参照试剂盒说明书检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；液闪计数器参照试剂盒说明书检测内皮素(ET)、血栓素B₂(TxB₂)、6—酮—前列腺素F₁α(6-KetoPGF1α)。

心肌梗死范围检测

取血完毕，立即取下心脏，生理盐水冲洗，称取全心、左心室重量，在心脏结扎线以下，平行于冠状沟均匀地将心脏横切成5片，然后置于1％TTC染色液中，37℃染色5—10分钟，可以看见被染色的心肌缺血梗塞部分呈现白色，小心分离白色区，称重，为梗死区重量，计算梗死区占左心室及全心脏的百分比。

统计学处理：

实验数据以x±s表示，进行方差分析，F检验，组间比较，q检验。

实验结果：

1、SQNB对实验性心肌缺血大鼠左室功能的影响(详见表5-1、表5-2)

表5-1  SQNB对实验性心肌缺血大鼠心率、心输出量、射血分数、左室短轴缩短率的影响

与模型组相比，*：P<0.05  **：P<0.01

由表1可见，SQNB组可明显增加心输出量、射血分数和左室短轴缩短率。

表5-2  SQNB对实验性心肌缺血大鼠左室内压的影响

与模型组相比，*：P<0.05  **：P<0.01

由表5-2可见，SQNB能够增高LVSP、+dp/dt._max、-dp/dt_ma，降低LVEDP。

本实验表明：SQNB具有增加冠脉血流量、降低冠脉阻力、减少心肌缺血程度及范围的功效，从而改善心肌缺血；同时SQNB注射液能降低左室舒张末期压，使血液易从心外膜向心内膜下区流动，从而能对冠状动脉血流量进行重新分配；

SQNB对实验性心肌缺血大鼠心肌梗死范围的影响(见表5-3)

表5-3  SQNB对实验性心肌缺血大鼠心肌梗死范围的影响

与模型组相比，*：P<0.05  **：P<0.01

由表5-3可见，SQNB能够明显减少实验性心肌缺血大鼠心肌梗死范围(P<0.05-0.01)。

3SQNB对实验性心肌缺血大鼠心肌酶的影响(见表5-4)

表5-4  SQNB对实验性心肌梗死大鼠心肌酶的影响

与模型组相比，*：P<0.05  **：P<0.01

由表5-4可见，SQNB能够明显抑制CK、LDH活性(P<0.05)。

故SQNB具有抑制心肌酶升高、减少心肌损伤的作用。

SQNB注射液对实验性心肌缺血大鼠氧化损伤的影响(见表5-5)

表5-5  SQNB对实验性心肌缺血大鼠血清SOD、MDA的影响

与模型组相比，*：P<0.05  **：P<0.01

由表5可见，SQNB能够明显增加实验性心肌缺血大鼠血清SOD活性，降低MDA含量，与模型组相比，有显著性差异(P<0.05-0.01)。

5SQNB实验性心肌缺血大鼠内皮细胞功能的影响(见表5-6)

表5-6  SQNB对实验性心肌缺血大鼠血清ET、TxB₂、6-KetoPGF1α的影响

与模型组相比，*：P<0.05  **：P<0.01

由表6可见，SQNB能够明显降低实验性心肌缺血大鼠血清ET、TxB₂浓度，增加6-KetoPGF1α浓度(P<0.05-0.01)。

综上所述：SQNB可明显增加实验性心肌缺血大鼠心输出量、射血分数和左室短轴缩短率；增高LVSP、+dp/dt._max、-dp/dt_ma，降低LVEDP；明显减少实验性心肌缺血大鼠心肌梗死范围(P<0.05-0.01)；明显抑制CK、LDH活性(P<0.05)；增加血清SOD活性，降低MDA含量；明显降低血清ET、TxB₂浓度，增加6-KetoPGF1α浓度(P<0.05-0.01)。具有增加冠状动脉血流、改善心肌缺血、减少心肌损伤的作用。

实验六、SQNB对大鼠肠系膜血管内血栓形成的预防和溶栓作用

1、实验动物及分组：

雄性3月龄Wister大鼠，体重：220-250g，由解放军总医院实验动物中心提供，随机分为对照组、病理对照组、SQNB组和金纳多组，每组12只。

2、实验方法：

大鼠用20％乌拉坦溶液0.7ml/100g体重肌肉注射麻醉，由尾静脉注射光敏剂血卟啉0.125mg/100g体重，剪去腹部毛发，在腹部正中作一长约2cm垂直切口，暴露小肠，将大鼠放在观察板上呈仰卧位，用小镊子轻轻拉出小肠，并将小肠展开放在观察台上，选好有微血管得奖肠系膜，选择直径为40-50μm血流正常无细胞黏附的细静脉作为血栓形成靶血管，用落射荧光显微镜100瓦汞灯作为光源经UV紫外滤光片，照射在靶血管上，光斑直径200μm，光照1min，用落射荧光显微镜连续观察10min并记录。

3、实验用药与给药方法：

SQNB组及金纳多组大鼠于实验前5d始每日分别给予SQNB(实施例1所制药物)或金纳多混悬液灌胃(2ml)，1次/日，连续5d。用药量同实验一。对照组给予等容量饮用水灌胃。

4、结果

SQNB组大鼠于静脉注射血卟啉后紫外连续照射1min，于光照32sec后血管内开始有血小板黏附，比对照组大鼠血栓出现时间晚，停止光照后血小板黏附也逐渐增多，部分大鼠血栓形成，但未堵塞管腔，血流仍能通过，部分血栓被血流冲散。金纳多组大鼠于光照后26sec开始有血小板附壁，血栓出现的时间介于SQNB与对照组之间，在光照开始后的前2min内，血小板黏附明显，形成壁栓，与对照组的血栓大小相近，在5-10min时，只有少部分附壁血栓被冲走。SQNB的血栓大小在光照后1min、10min，均较对照组及金纳多组小(P<0.05)，结果见表6-1、表6-2.。

表6—1  各组大鼠不同时间点肠系膜血管内栓大小(μm²)

 

	1min	2min	5min	10min
					SQNB组	1600±97*	1820±112*	1760±109*	1690±115*
金纳多组	3000±121	3020±132	2510±88	3040±104
					对照组	3150±107	3160±99	3410±180	3310±134

*P<0.05

表6-2  大鼠不同时间点肠系膜血管内血栓面积占管腔的百分比(％)

 

	1min	2min	5min	10min
					SQNB组	39.5	41.8*	32.6*	40.0*
金纳多组	40.1	40.7	44.5	42.4
					对照组	50.2	48.2	45.0	47.8

实施例1

本发明药物的胶囊制剂：

称取黄芪5kg、丹参2kg、川芎1kg、红花1kg、地龙1kg。

将黄芪、丹参、川芎、红花、地龙加入8倍量50％乙醇，浸泡提取3次，每次3小时，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25(75℃)，加入55％乙醇，进行醇沉，回收乙醇，浓缩成清膏。

将上述清膏干燥、粉碎装入胶囊。每粒含生药量10g。

实施例2

本发明药物的注射液

称取黄芪10kg、丹参5kg、川芎3kg、红花3kg、地龙1kg。

按照实施例1所述方法制备提取物。提取物按照常规方法进行除热源处理并加入蒸馏水，用氯化钠调节等渗压，过滤，灌装。制成每10ml含生药量20g的注射液。

实施例3

本发明药物的片剂制剂：

称取黄芪15kg、丹参8kg、川芎5kg、红花5kg、地龙3kg。

将丹参、川芎，加3倍量70％乙醇浸泡3次，每次48小时，合并乙醇提取液，滤过，回收乙醇至无醇味，备用。药渣与黄芪、地龙粗粒、红花药材加8倍量水，煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，与醇提部分合并，继续浓缩至相对密度为1.30(80℃)的清膏。将所制清膏加入辅料、混匀制粒，压成片剂。每片含生药量5g。

实施例4

本发明药物的口服液制剂：

按照实施例1制备清膏，将所制清膏加蒸馏水溶解，过滤，灌装。每100ml含生药量40g。

实施例5—7：

上述实施例只是药物组分的用量配比有所不同，其可按照常规制剂方法制成各种剂型，且其均具有本发明所述效果。

Claims (5)

1、一种用于缺血性疾病的药物组合物，其特征在于它是由以下重量配比的原料组成：黄芪5-15份、丹参2-8份、川芎1-5份、红花1-5份、地龙1-3份。

2、根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于它是由以下重量配比的原料组成：黄芪10份、丹参5份、川芎3份、红花3份、地龙1份。

3、权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗缺血性脑卒中药物制剂中的应用。

4、权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗缺血性心肌病药物制剂中的应用。

5、权利要求1或2所述的药物组合物在制备治疗缺血性肠病药物制剂中的应用。