CN107998314B

CN107998314B - 一种补肾健脑的中药组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN107998314B
Application number: CN201810094855.3A
Authority: CN
Inventors: 高嵩; 白冰; 徐建; 石菊; 郭文英; 王伟
Original assignee: Jilin Xiuzheng Pharmaceutical New Medicine Development Co ltd
Current assignee: Fusong County Chinese Traditional Medicine Co.,Ltd.; JILIN XIUZHENG PHARMACEUTICAL NEW MEDICINE DEVELOPMENT Co.,Ltd.
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN107998314A

Abstract

本发明涉及药物领域，特别涉及组合物及其制备方法和应用。本发明提供了组合物包括动物脑、何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根、西洋参、紫苏子和石菖蒲。实验结果表明，本发明提供的组合物显著降低脑组织中乙酸胆碱醋酶的活性，减少其对乙酞胆碱的降解，增加其含量，从而改善学习、记忆能力，且作用效果优于对照组。此外，本发明提供的组合物能减少海马CAI神经细胞凋亡，而且本发明提供的组合物比对照组效果更为显著。本发明通过观测血管性痴呆大鼠给药后血液流变学、脑内乙酞胆碱醋酶活性、海马区神经细胞凋亡的观察，确定本发明提供的组合物对改善学习、记忆能力作用，且作用效果优于对照组。

Description

一种补肾健脑的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及一种补肾健脑的中药组合物及其制备方法。

背景技术

肾脏是人体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以尿液的排出清除体内代谢物及某些废物、毒素等，同时经重吸收功能保留水分及其他有用物质、如蛋白质、氨基酸、钠离子、葡萄糖、钾离子等，以调节水、电解质的平衡及维护酸碱平衡。肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素D3、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的问题，使新陈代谢得意正常进行。

随着环境的日益恶化、市场竞争的加剧，人们的生活节奏越来越快，生活和工作压力的增大，加之经常应酬和不合理的饮食结构，年轻人性欲无节度，极易造成肾脏亏虚。往往会出现肝肾阴亏，体力不支，肾虚痿痹的症状。肝肾阴虚证是肝肾两脏阴液不足所致的病证。肝肾阴虚证同肝肾阴虚。多由久病及肾，或房事过度，情志内伤，精血不足，损伤肝肾之阴等引起。慢性肝炎、肝硬化、心脑血管疾病、慢性肾炎、更年期综合征等，只要出现上述症状都可以按肝肾阴虚治疗。肝肾阴亏表现为头晕目眩，健忘耳鸣，失眠多梦，咽干口燥，腰膝酸软，胁痛，五心烦热，颧红盗汗，男子遗精，女子月经量少或闭经，舌红少苔，脉细数。肝肾阴虚，虚火上扰，头目失于阴精的滋养，故见头晕目眩，耳鸣健忘，口燥咽干；肝脉布于两胁，肝阴不足，肝脉失养，故见胁痛；阴虚内热，虚火上扰，故五心烦热，盗汗颧红，失眠多梦，男子遗精；冲任隶属肝肾，肝肾阴伤，冲任空虚，故月经量少或闭经；舌红少苔，脉细数也为阴虚内热之象。

尽管目前补肾的药物很多，但都是以西药为主，中药为辅。目前市场上的保护肾脏或补肾类西药或保健品的种类繁多，缺补肾效果不佳、副作用大，甚至有些补肾药物含有激素，造成人体内分泌紊乱，可能会对人体造成伤害。近年来，用中草药材补肾的药物相关的专利申请也有所增长，但很多并没有辩证分类治疗，中医认为，肾虚分肾阴虚和肾阳虚，要根据不同的症状做不同的诊治。肾虚多为长期积累成疾，切不可因急于求成而用大补之药进补，而应慢慢调理。对于补肾的药物市场的需求还很大，能够进一步提高药物的疗效也是很多患者所期待的。因此提供疗效好的补肾药物具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种补肾健脑的中药组合物及其制备方法。该组合物具有较好的补肾健脑功效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了组合物包括动物脑、何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根、西洋参、紫苏子和石菖蒲。

在本发明的一些具体实施方案中，以质量份计，包括如下组分：

本发明还提供了组合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：取动物脑经预处理，与水混合后匀浆、脱脂，过滤收集沉淀，去除溶剂，制得动物脑脱脂干粉；

步骤2：取所述动物脑脱脂干粉与水混合，调节pH值，回流水解，冷却，离心，收集沉淀和上清液，将所述上清液调节pH值，获得沉淀A及上清液A；

步骤3：取所述动物脑脱脂干粉与水混合，调节pH值，经胰蛋白酶酶解，灭酶，离心，过滤，分别收集沉淀和上清液，获得沉淀B和上清液B；

步骤4：合并所述沉淀A和所述沉淀B，经离子交换柱以30％氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，制得提取物A；

步骤5：合并所述上清液A与所述上清液B，用8000～12000道尔顿分子量的滤膜超滤，收集滤液，制得提取物B；

步骤6：取何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根与水混合后回流提取，过滤，收集滤液过大孔吸附树脂，经水洗脱，弃去洗脱液，再经60～80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，得提取物C；

步骤7：取西洋参、紫苏子、石菖蒲，混合后粉碎，过筛，得药材细粉。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述pH值为2～5，所述回流水解的温度为60～80℃，所述回流水解的时间为3～6h，所述离心的转速为5000～8000r/min，所述离心的时间为5min，所述上清液的pH值为至7～8。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述pH值为7.5～8，所述胰蛋白酶的酶活为2500～4000；所述酶解的温度为30～60℃，所述酶解的时间为5～8h，所述离心的转速为5000～8000r/min，所述离心的时间为5min。

本发明还提供了上述的制备方法制得的组合物。

本发明还提供了组合物，以质量份计，包括如下组分：

其中，所述提取物A的制备方法为动物脑经预处理，与水混合后匀浆、脱脂，过滤收集沉淀，去除溶剂，制得动物脑脱脂干粉；

取所述动物脑脱脂干粉与水混合，调节pH值，回流水解，冷却，离心，收集沉淀和上清液，将所述上清液调节pH值，获得沉淀A及上清液A；

取所述动物脑脱脂干粉与水混合，调节pH值，经胰蛋白酶酶解，灭酶，离心，过滤，分别收集沉淀和上清液，获得沉淀B和上清液B；

合并所述沉淀A和所述沉淀B，经离子交换柱以30％氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，制得提取物A；

所述提取物B的制备方法为：合并所述上清液A与所述上清液B，用8000～12000道尔顿分子量的滤膜超滤，收集滤液，制得提取物B；

所述提取物C的制备方法为：取何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根与水混合后回流提取，过滤，收集滤液过大孔吸附树脂，经水洗脱，弃去洗脱液，再经60～80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，得提取物C；其中，何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根以质量份计

最佳的质量比例为9:9:6:6:6:6:6；

所述药材细粉的制备方法为：取西洋参、紫苏子、石菖蒲，混合后粉碎，过筛，得药材细粉；其中，西洋参、紫苏子、石菖蒲以质量份计

最佳的质量比为1:9:9。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提取物A的制备方法中，所述pH值为2～5，所述回流水解的温度为60～80℃，所述回流水解的时间为3～6h，所述离心的转速为5000～8000r/min，所述离心的时间为5min，所述上清液的pH值为至7～8。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提取物A的制备方法中，所述pH值为7.5～8，所述胰蛋白酶的酶活为2500～4000；所述酶解的温度为30～60℃，所述酶解的时间为5～8h，所述离心的转速为5000～8000r/min，所述离心的时间为5min。

在本发明的一些具体实施方案中，将提取物A、提取物B、提取物C、药材细粉按组方比例混合，由上述组合物与药学上可接收的载体或稀释剂组成，所诉制剂为片剂，颗粒剂，胶囊剂。

本发明还提供了上述的组合物在制备补肾和/或健脑的药物中的应用。

本发明提供了组合物包括动物脑、何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根、西洋参、紫苏子和石菖蒲。本发明提供的组合物能明显延长小鼠的潜伏期，减少错误反应的次数，缩短累加电击时间，与吡拉西坦相近。行为学检测结果表明，本发明提供的组合物的高、中剂量组逃避潜伏期优于脑复康组。此外，本发明提供的组合物高剂量组能提高大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比(P＜0.01，P＜0.05)，显著提高大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比(P＜0.05)，且同剂量比较，本发明提供的组合物比对照组提高的明显。表明本发明提供的组合物提高学习记忆能力优于对照组。大鼠脑组织内乙酰胆碱酯酶含量比较结果显示，与模型组相比，脑复康组、本发明提供的组合物高、中剂量组，脑组织乙酰胆碱脂酶含量明显降低，存在显著差异(P<0.05)。细胞凋亡实验结果表明，与模型组相比，各给药组海马CAI区细胞凋亡数目不同程度减少，其中本发明提供的组合物高剂量组海马CAI区神经细胞凋亡明显减少(P＜0.01)，脑复康组、本发明提供的组合物中剂量和对照组海马CAI区神经细胞凋亡有所减少(P＜0.05)。

具体实施方式

本发明公开了一种补肾健脑的中药组合物及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本病病位在脑，与肝、心、脾、肾等脏的功能也是密切相关，年老肾精亏损，七情内伤，久病不愈，损伤正气，耗损气血；或后天之本虚衰，致使气血生化无源；先天之本亏虚，不能上冲脑髓，髓窍失养；痰湿、血瘀痹阻，气血阻滞，脉络不通，脏腑气机不能上养脑脉；或湿热之气郁久，生热化火，浊耗气血、津液，使气血亏虚，肾精不足，脑髓无以充养，逐渐空虚。其病机为精髓耗减，脑机失养。人至老年，肾精呈生理性减少，不能上养于脑，或年老气血亏虚，不能濡养神元，逐渐发展为呆愚病症。此病的发生是因为脑髓无以充养，终至亏虚，神明之府废用的一类以呆滞、呆傻、愚笨、智能下降为主的神志失常的精神疾病。它的致病有痰、瘀、虚，互相错杂，本虚标实，多伴虚实夹杂。主要病理是在脑部血供不足的基础上导致的，而导致血供不足的主要原因恰恰又是一些脑部的血管疾病。随着受损脑组织的增加，最终出现认知功能障碍。其发生的核心环节是记忆中枢-海马环路的损害，其发生的主要原因为脑部血管性疾病致使所支持的中枢神经系统胆碱能损害，是因为胆碱能自身的传递障碍可引起脑部血流灌注不足，从而形成了它自身的前脑底核部位由于血供不足引起的缺血样病变，神经元细胞的缺失损害。目前临床上的治疗药物主要是CHEI、改善脑部血流循环、脑部细胞激活剂、神经细胞保护剂以及雌激素代替疗法等。这些药物虽有一定的疗效但是存在缺点颇多，如疗效不稳定，药品价格昂贵等这些弊端。而祖国医学对其却有着独特而丰富的认识，在治疗等各方面都有着独到的见解。如：病因病机、发病的症状、中医对本病的治疗等，中医药治疗有着多方法、多靶点、整体治疗、辩证治疗以及毒副作用小的优势，在治疗此病中发挥的作用愈来愈大。中医认为记忆力减退病位在脑，病性为本虚标实，虚实夹杂。外邪侵袭或者机体自身气血紊乱，引起气血功能障碍、失调，或气血亏虚或气滞血瘀，或痰浊痹阻，致使精亏髓虚，神明之府失去濡养，调控迟钝，逐发为记忆力衰退，甚者为痴呆。

动物脑提取物含有小分子肽、神经生长因子等多种活性成分，可用于治疗血管性认知障碍(VCI)、阿尔茨海默症(AD)等一些脑功能性疾病，目前已有众多的脑提取物产品进入临床，国外生产的脑活素已被广泛应用于血管性认知障碍(VCI)、阿尔茨海默病、脑中风、脑震荡、脑损伤的治疗，取得了一定的疗效。

本实验研究，对猪脑进行了提取与分离，旨在通过观察本发明提供的组合物对血管性认知功能障碍大鼠行为学实验(水迷宫法)和海马区神经细胞凋亡影响，研究本发明提供的组合物对血管性认知障碍(VCI)模型大鼠的神经细胞凋落死亡的影响，找到药物对疾病起作用基础。

本发明采用血管阻断法永久结扎双侧颈总动脉造模，造成大鼠慢性的脑缺血，使脑组织发生缺血、缺氧损害，尤其在易损区域，如大脑皮质和海马区，缺血更为明显。同时此造模方式操作简单，创伤少，重复性好，可较好的模拟人类的慢性低灌注引起的脑缺血、缺氧，最终导致神经细胞功能下降，学习记忆功能障碍，和因动脉粥样硬化，动脉管腔狭窄等原因造成的血管性痴呆基本相似，通过行为学试验也证实模型大鼠存在明显的学习、记忆障碍，是较理想造模方式。

在水迷宫实验中，由定位航行试验和空间探索试验两部分组成，定位航行试验可以了解各组大鼠的学习能力，而空间探索试验可以更全面的了解各组大鼠的学习、记忆能力。

学习、记忆等复杂生理过程的高级整合与神经递质密切相关，特别是乙酞胆碱是进行及维持高级神经功能的重要介质之一，在血管性痴呆的发病过程中，脑组织中的神经递质明显减少，尤其是大脑皮层的乙酞胆碱的减少与血管性痴呆的智力下降有着密切的关系。本发明通过观察各组大鼠脑组织内乙酰胆碱酯酶的含量变化，发现模型组的含量明显增高，与空白组相比存在显著差异，说明血管性痴呆大鼠脑组织内乙酸胆碱含量明显减少。而本发明提供的组合物显著降低脑组织中乙酸胆碱醋酶的活性，减少其对乙酞胆碱的降解，增加其含量，从而改善学习、记忆能力，且作用效果优于对照组。

近年研究发现不同的脑区神经元对缺血的敏感性不同，海马结构是最为敏感的区域，特别是海马CAI区是与空间辨别及学习记忆关系最为密切。通过TUNEL法可以准确的反映细胞凋亡最典型的形态特征，其敏感度和特异性都较高，目前被广泛应用。本发明结果显示模型组海马CAI区细胞凋亡数明显增多，而各给药组细胞凋亡数目虽然较空白组细胞凋亡数目增多，但于模型组比较，有显著减少，说明本发明提供的组合物能减少海马CAI神经细胞凋亡，而且本发明提供的组合物比对照组效果更为显著。

本发明通过观测血管性痴呆大鼠给药后血液流变学、脑内乙酞胆碱醋酶活性、海马区神经细胞凋亡的观察，确定本发明提供的组合物对改善学习、记忆能力作用，且作用效果优于对照组。

本发明提供的组合物及其制备方法和应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

取健康猪脑2kg，除去结缔组织，按猪脑与水溶液比例为1:1混合后，进行匀浆，将匀浆后的猪脑匀浆液与70％乙醇比例为1:0.8混合，将混合液置于反应釜中，恒温25℃搅拌脱脂30分钟后，过滤，收集沉淀，挥干溶剂，得猪脑脱脂干粉800g。

取猪脑脱脂干粉400g，加2000ml倍量水混匀，再加入6mol/L盐酸调节Ph值为3，70℃热回流水解5h，冷却至室温，以6500r/min的速度离心分离5min，收集沉淀，上清液再用6mol/L的氢氧化钠溶液调节Ph至7.5，得到沉淀A及上清液A。

取猪脑脱脂干粉400g，加2000ml倍量水混匀，用1％的氢氧化钠溶液调节脱脂干粉溶液Ph值在7.7，再加入猪脑脱脂干粉量16g的胰蛋白酶(2500IU/g酶活力)，45℃恒温酶解6.5h，煮沸30min灭活酶，冷却以6500r/min的速度离心分离5min，过滤，分别收集沉淀及上清液。得到沉淀B及上清液B。

合并沉淀A与沉淀B，置离子交换柱(DEAE sepharose FF)，以30％氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得猪脑提取物A。

合并上清液A与上清液B，用10000道尔顿分子量滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩，干燥、得猪脑提取物B。

取何首乌90g、丹参90g、薏苡仁60g、五味子60g、天麻60g、远志60g、葛根60g，加入3840ml量水回流提取2次，每次60分钟，滤过，滤液浓缩至0.5g生药每毫升，通过处理过的大孔吸附树脂，用3倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液，再用6倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以下减压浓缩，得提取物C。

取西洋参10g、紫苏子90g、石菖蒲90g，混合后粉碎，过100目筛，得药材细粉。

取提取物A18g、提取物B10g、提取物C50g、药材细粉24g，混合至干法制粒机中，压制颗粒。

实施例2

取健康猪脑4kg，除去结缔组织，按猪脑与水溶液比例为1:1混合后，进行匀浆，将匀浆后的猪脑匀浆液与70％乙醇比例为1:0.8混合，将混合液置于反应釜中，恒温25℃搅拌脱脂30分钟后，过滤，收集沉淀，挥干溶剂，得猪脑脱脂干粉1600g。

取猪脑脱脂干粉800g，加2000ml倍量水混匀，再加入6mol/L盐酸调节Ph值为2，60℃热回流水解3h，冷却至室温，以5000r/min的速度离心分离5min，收集沉淀，上清液再用6mol/L的氢氧化钠溶液调节Ph至7，得到沉淀A及上清液A。

取猪脑脱脂干粉800g，加2000ml倍量水混匀，用1％的氢氧化钠溶液调节脱脂干粉溶液Ph值在7.5，再加入猪脑脱脂干粉量16g的胰蛋白酶(4000IU/g酶活力)，30℃恒温酶解5h，煮沸30min灭活酶，冷却以5000r/min的速度离心分离5min，过滤，分别收集沉淀及上清液。得到沉淀B及上清液B。

合并上清液A与上清液B，用8000道尔顿分子量滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩，干燥、得猪脑提取物B。

取何首乌180g、丹参180g、薏苡仁120g、五味子120g、天麻120g、远志120g、葛根120g，加入7680ml量水回流提取2次，每次60分钟，滤过，滤液浓缩至0.5g生药每毫升，通过处理过的大孔吸附树脂，用3倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液，再用4倍柱体积的60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以下减压浓缩，得提取物C。

取西洋参20g、紫苏子180g、石菖蒲180g，混合后粉碎，过100目筛，得药材细粉。

取提取物A16g、提取物B8g、提取物C40g、药材细粉16g，混合加入适量辅料，压制成片。

实施例3

取猪脑脱脂干粉800g，加2000ml倍量水混匀，再加入6mol/L盐酸调节Ph值为5，80℃热回流水解6h，冷却至室温，以8000r/min的速度离心分离5min，收集沉淀，上清液再用6mol/L的氢氧化钠溶液调节Ph至8，得到沉淀A及上清液A。

取猪脑脱脂干粉800g，加2000ml倍量水混匀，用1％的氢氧化钠溶液调节脱脂干粉溶液Ph值在8，再加入猪脑脱脂干粉量16g的胰蛋白酶(酶活力3200IU/g)，60℃恒温酶解8h，煮沸30min灭活酶，冷却以8000r/min的速度离心分离5min，过滤，分别收集沉淀及上清液。得到沉淀B及上清液B。

合并上清液A与上清液B，用12000道尔顿分子量滤膜进行超滤，收集滤液，浓缩，干燥、得猪脑提取物B。

取何首乌180g、丹参180g、薏苡仁120g、五味子120g、天麻120g、远志120g、葛根120g，加入7680ml量水回流提取2次，每次60分钟，滤过，滤液浓缩至0.5g生药每毫升，通过处理过的大孔吸附树脂，用3倍柱体积的水洗脱，弃去洗脱液，再用4倍柱体积的80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，50℃以下减压浓缩，得提取物C。

取提取物A20g、提取物B12g、提取物C60g、药材细粉30g，混合加入适量辅料，压制成片。

实施例4

根据下述提取物比例混合，制备成实验组A-I。

表1组方筛选表

将不同组方比例实验组进行药效学对比：

实验方法：

选健康成年小鼠120只，体质量(18±2)g，雌雄各半，随机分成12组，每组10只。空白组，模型组，吡拉西坦组(0.5g/kg)，实验组A(1.2g/kg)，实验组B(1.2g/kg))，实验组C(1.2g/kg)，实验组D(1.2g/kg)，实验组E(1.2g/kg)，实验组F(1.2g/kg)，实验组G(1.2g/kg)，实验组H(1.2g/kg)，实验组I(1.2g/kg)。各组均灌胃给药，剂量为20ml/kg，空白组和模型组给等容积生理盐水，每日1次，连续15d。于第14天给药后1h开始训练，训练前10min，空白组腹腔注射生理盐水，其余各组均腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(1.5mg/kg)。训练时先将小鼠放人避暗箱明室，小鼠进入暗室受到电击(36V)后逃至明室，此后会再次进人暗室。适应3min后，将小鼠背向暗室放入明室，同时记时，小鼠进入暗室受到电击视为错误反应。训练5min，记录小鼠自放人明室至首次进人暗室的时间(潜伏期)、5min内错误次数及累加遭受电击的时问(错误反应时间)，作为学习成绩。24h后重新测试，将小鼠背向暗室放入明室，同时记时，余方法同训练，记录小鼠首次进入暗室的潜伏期、5min内错误反应次数及累加遭受电击的时间，作为记忆成绩。

实验结果

用东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍，采用避暗法训练小鼠的学习记忆能力。结果显示，模型组小鼠的学习记忆成绩明显低于空白组(P<0.01，P<0.001)，即潜伏期明显缩短，错误次数明显增多，累加电击时间明显延长。而参苏补肾胶囊和吡拉西坦能明显延长小鼠的潜伏期，减少错误反应的次数，缩短累加电击时间。与模型组比较，各指标差异显著(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。实验组E的效果与吡拉西坦相近，作用效果优于实验组A-I。结果见表2。

表2避暗法观察不同组别对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的改善作用

注：与空白组比较：^▲P<0.05，^▲▲P<0.01，^▲▲▲P<0.001；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实施例5不同组方参苏补肾胶囊对D-半乳糖致衰老模型大鼠肝肾功能及其自由基代谢的影响

1.模型建立及给药

取健康大鼠120只，雌雄均半，随机分成12组，即空白组，模型组，六味地黄丸组，参苏补肾胶囊A-I组(见实施例4)。分组后，除正常对照组颈背部注射生理盐水外，其他各组均注射配制的D-半乳糖溶液(125mg/kg)复制亚急性衰老模型，造模同时，灌胃给药，六味地黄丸组给予六味地黄丸药液0.4g/kg，参苏补肾胶囊A-I组分别给予参苏补肾胶囊A-I药液1.2g/kg，，正常对照组与模型组给予纯化水，连续造模、给药8周。

2.取材及处理

末次给药结束24h后，称取大鼠体重，腹腔注射10％水合氯醛完全麻醉，于腹主动脉采集血液，室温下放置2h，3000r/min离心，时间10min，去上清液血清，用于肝肾功能指标检测；取肾组织，于冰冷生理盐水中漂洗去组织表面残留血液，滤纸吸干，称重，加入适量生理盐水，在冰水浴中机械匀浆，最终制得10％肾组织匀浆，将制得的组织匀浆在2000r/min条件下离心15min，取组织匀浆上清液，用于自由基代谢指标检测。

3.生化指标测定

采用酶标仪对实验大鼠血清进行ALT、AST、ALP、CREA、BUN各指标检测；按照试剂盒说明书要求，对实验大鼠肾组织匀浆中的SOD、MDA、T-AOC各指标水平进行测定。

4.实验结果

4.1对大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN指标含量的影响

与正常对照组相比，模型组ALT含量明显降低，具有统计学意义(P<0.01)，AST、ALP、BUN、CREA皆有明显増加，具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，各给药组ALT含量明显升高，AST、ALP、BUN、CREA皆有明显降低，具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，其中实验组E的效果与六味地黄丸组相近，作用效果优于实验组A-I。结果见表3。

表3对大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN指标含量的影响

注：与空白组比较：^▲P<0.05，^▲▲P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

4.2对大鼠皆组织中SOD、MDA及T-AOC指标含量的影响

与正常对照组相比，模型组SOD和T-AOC水平均显著降低，MDA含量明显升高，且具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各给药组SOD和T-AOC水平均显著升高，MDA含量显著降低，有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，其中实验组E的效果与六味地黄丸组相近，作用效果优于实验组A-I。结果见表4。

表4对大鼠肾组织中SOD、MDA及T-AOC指标含量的影响

注：与空白组比较：^▲▲P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

结论

东莨菪碱为M受体阻断剂。可破坏小鼠的空间记忆，造成小鼠记忆获得障碍，结果易重复，模型较为理想，在国内外被广泛采用。高体积分数乙醇会作用于大脑和小脑，抑制中枢，产生近记忆缺失，时空定向力障碍，增加小鼠的错误反应次数及延长错误反应时间。避暗法是利用鼠类的嗜暗习性而设计的。可以检测小鼠的习惯性记忆。实验结果表明，东莨菪碱所致小鼠获得性记忆障碍模型制作成功.记忆障碍小鼠的习惯性记忆出现明显损伤，参苏补肾胶囊使得记忆障碍小鼠的记忆潜伏期延长，错误次数减少，遭受电击的时间缩短，有明显的改善作用。实验组E效果与阳性药吡拉西坦相近，作用效果优于实验组A-I。

本研究结果表明，参苏补肾胶囊具有提高大鼠肾组织中SOD和T-AOC活性水平，降低MDA含量的作用，与六味地黄丸功效相似，说明参苏补肾胶囊补益肝肾效果显著。ALT、AST、ALP是肝脏中重要酶系，CREA及BUN是评价肾脏功能的重要指标，当肝肾组织出现损伤或者病变，其对应的功能指标水平也将出现不同程度的变化。本实验结果表明，实验组对所测肝肾功能指标水平均有改善作用，在ALT、AST、ALP、CREA及BUN指标中表现出较为理想的效果，说明参苏补肾胶囊具有改善衰老模型大鼠肝肾功能的作用。实验组E效果与阳性药吡拉西坦相近，作用效果优于实验组A-I。

实施例6改善大鼠学习记忆能力的研究

1.动物分组及给药

Wistar大鼠100只，留空白组和假手术组各10只，其余大鼠造模，取成活者60只随机分6组：模型组，阳性对照组(脑复康0.3g·kg^-1)，对照组(1g·kg^-1)，本发明实施例1～3提供的组合物高、中、低剂量组(2，1，0.5g·kg^-1)。正常对照组与模型组灌胃给予等量生理盐水，各给药组按体质量10mL·kg^-1灌胃给药，每天1次，共45天，大鼠自由饮水和摄食，每周称重。

对照组：

原参苏补肾胶囊制备工艺：

取猪脑去杂质搅碎，经丙酮脱脂、胆固醇三次，依次加入丙酮5倍、4倍、3倍，每次搅拌30分钟，滤过，滤渣80℃干燥，粉碎成细粉，取细粉加蒸馏水调至成浆状，调节ph6.5-7，水浴恒温45℃，再经蛋白酶水解后，真空干燥，粉碎成细粉，过100目筛，备用；另取西洋参、石菖蒲、紫苏子等三味，粉碎成细粉；其余何首乌、薏苡仁、五味子、天麻、丹参、远志、葛根加水煎煮3次，第一次10倍量水，煎煮3小时，第二次7倍量水，煎煮2小时，第三次5倍量水，煎煮1小时，滤过合并滤液，浓缩至相对密度1.15-1.20的稠膏，加西洋参、石菖蒲、紫苏子细粉混匀，真空干燥，粉碎成细粉，再取猪脑粉混匀，装胶囊即得。

2.模型复制

采用双侧颈总动脉永久结扎法：大鼠术前12h禁食、4h禁水，用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定，颈前部去毛消毒后沿颈正中切开，分离出双侧颈总动脉，双重丝线结扎，避免损伤颈交感神经和迷走神经，术中注意保暖，术后缝合伤口，动物送回动物房饲养，术后第三天取存活大鼠进行分组试验。

3.检测指标

3.1行为学实验采用Morris水迷宫检测：水迷宫为一园形不锈钢水池，直径为150cm，高50cm，水深30cm，水温控制在(25±1)℃，把水池分为4个象限，每个象限标明一个入水点，任选一个象限，正中放置一个平台，高28cm，直径为15cm，迷宫上方装有摄象头，和录像机和显示器相连接，自动录入大鼠游泳轨迹进行分析。

3.1.1定位航行实验：共需5天，每天上午、下午各一次，将大鼠从两个象限的入水点放入水中，记录其在2分钟里寻找平台所用的时间(逃避潜伏期)和游泳路径。如果大鼠在2分钟内未找到平台，则潜伏期为120s。并将大鼠放置于平台15s，再将大鼠放回笼中。此实验通过训练大鼠游泳寻找平台。观测其逃避潜伏期和游泳路径检测大鼠的学习能力。

3.1.2空间探索实验：大鼠在做完定位航行实验后，在第6天撤除平台，选择一个入水点放入水中，记录2分钟内大鼠在池内的游泳轨迹和时间，分析各组大鼠在原平台象限游泳的时间和路径与总游泳时间和路径的比值。此实验观察大鼠在5天训练后的空间学习和记忆力的变化，学习记忆正常大鼠常能记住平台的空间位置，故能很快找到平台位置，撤除平台后，学习记忆正常的大鼠在2分钟内会在原平台象限反复寻找平台，而学习记忆差的大鼠则还是在迷宫里漫无目的的寻找平台。通过计算他们的比值，可以进一步的反映大鼠的空间学习记忆能力。

3.2乙酸胆碱醋酶活性测定

大鼠麻醉状态下，断头取脑，冰生理盐水冲洗，称取组织重量加9倍生理盐水制备成10％匀浆，3000转/分离心10分钟，分为两份。

3.2.1第一份取组织上清再按生理盐水按1:9稀释成1％组织匀浆，参照蛋白含量测定试剂盒说明书，计算所测样本的蛋白含量。

蛋白含量＝(测定管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度

3.2.2取第二份上清液作为样本，参照乙酸胆碱醋酶试剂盒说明书，计算脑组织中乙酰胆碱醋酶活性。

TchE活性＝(测定管OD值-对照管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度/蛋白含量

3.3细胞凋亡的检测采用法

大鼠麻醉状态下，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插管，剪开右心耳，经升主动脉先灌注生理盐水，待右心耳流出清水时灌注多聚甲醛，待大鼠尾巴完全僵直时断头取脑，取出脑组织，甲醛固定24小时，常规石蜡包埋、厚连续冠状切片，参照试剂盒说明；

3.3.1常规脱蜡、复水，后续过程在湿盒内进行；

3.3.2 3％H₂O₂阻断内源性辣根过氧化物酶30min；

3.3.3用0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min；

3.3.4切片浸入2×SSC溶液(80℃)20min；

3.3.5用0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min；

3.3.6用蛋白酶K消化5min；

3.3.7用0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min；

3.3.8 TDT缓冲液孵育10min；

3.3.9 TDT反应液37℃下孵育1h；

3.3.10切片浸入2×SSC溶液10min，以终止反应；

3.3.11用0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min；

3.3.12用链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min；

3.3.13用0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min；

3.3.14用0.04％的DAB显色10min；

3.3.15苏木素复染5min，常规复水、透明、封片；

镜检，在海马区的神经细胞层，分别选择个相邻视野，以个视野为单位，结果取个视野的平均值，然后在光学显微镜下拍片。

4.实验结果：

4.1行为学检测结果

4.1.1大鼠前5天的逃避潜伏期结果

如表5在第1天，各组大鼠寻找平台的时间没有明显的差异(P>0.05)。经过一天的训练后，在第2天，空白组、脑复康组、本发明提供的组合物高剂量组大鼠的逃避潜伏期与模型组相比明显缩短(p<0.05)，对照组、本发明提供的组合物中剂量、低剂量组和模型组逃避潜伏期变化不明显。又经过几天的训练后，到第5天时，模型组的逃避潜伏期还是没有明显的缩短，和其它各组逃避潜伏期比较都存在明显差异(p<0.05)，各给药组逃避潜伏期都明显比第1天缩短，其中本发明提供的组合物高、中剂量组逃避潜伏期优于脑复康组。本发明提供的组合物高、中剂量组逃避潜伏期明显优于对照组。

表5各组大鼠前5天逃避潜伏期结果观察(x±s，n＝10)

注：与正常组比较^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

4.1.2撤除平台后大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比

从表6可以看出，随着训练次数的增加，所有大鼠寻找平台的潜伏期都呈下降趋势，与空白组比较，模型组大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比明显缩短(P＜0.01)；与模型组相比，脑复康组和本发明提供的组合物高剂量组能提高大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比(P＜0.01，P＜0.05)，本发明提供的组合物中剂量组和对照组提高大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比(P＜0.05)，且同剂量比较，本发明提供的组合物比对照组提高的明显。表明本发明提供的组合物提高学习记忆能力优于对照组。

表6撤除平台后大鼠在原平台象限游泳时间和路径与总游泳时间和路径比(x±s，n＝10)

注：与正常组比较^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

4.2大鼠脑组织内乙酰胆碱酯酶AchE含量结果比较

与空白组比较，模型组AchE酶活明显升高，有一定差异(P＜0.05)，说明模型制备成功。与模型组相比，脑复康组、本发明提供的组合物高、中剂量组，脑组织乙酰胆碱脂酶含量明显降低，存在显著差异(P<0.05)，而对照组脑组织乙酰胆碱脂酶含量无明显变化，详见表7。

表7大鼠脑组织内乙酞胆碱酯酶含量比较

注：与正常组比较^#P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05。

4.3细胞凋亡的比较

从表8可以看出，与空白组相比，模型组海马CAI区细胞凋亡数目明显增加(P＜0.01)；与模型组相比，各给药组海马CAI区细胞凋亡数目不同程度减少，其中本发明提供的组合物高剂量组海马CAI区神经细胞凋亡明显减少(P＜0.01)，脑复康组、本发明提供的组合物中剂量和对照组海马CAI区神经细胞凋亡有所减少(P＜0.05)，且本发明提供的组合物组海马CAI区神经细胞凋亡数量少于对照组。

表8各组实验动物海马CAI区神经细胞凋亡情况

注：与正常组比较##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实施例7参苏补肾胶囊对D-半乳糖致亚急性衰老模型大鼠肝肾功能的影响

1.模型建立、给药方法及生化指标测定-同实施例4

2.实验结果

2.1对大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN指标含量的影响

与正常对照组相比，模型组ALT含量明显降低，具有统计学意义(P<0.01)，AST、ALP、BUN、CREA皆有明显増加，具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，本发明提供的组合物高、中剂量ALT含量明显升高，AST、ALP、BUN、CREA皆有明显降低，具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)且同剂量比较，本发明提供的组合物比对照组提高的明显。结果见表9。

表9对大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN指标含量的影响

n＝10)

4.2对大鼠肾组织中SOD、MDA及T-AOC指标含量的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肾组织中SOD和T-AOC水平均显著降低，MDA含量明显升高，且具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，本发明提供的组合物高、中剂量组大鼠肾组织中SOD和T-AOC水平均显著升高，MDA含量显著降低，有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，且同剂量比较，本发明提供的组合物比对照组提高的明显。结果见表10。

表10对大鼠肾组织中SOD、MDA及T-AOC指标含量的影响

结论：

本发明采用——血管阻断法永久结扎双侧颈总动脉造模，造成大鼠慢性的脑缺血，使脑组织发生缺血、缺氧损害，尤其在易损区域，如大脑皮质和海马区，缺血更为明显。同时此造模方式操作简单，创伤少，重复性好，可较好的模拟人类的慢性低灌注引起的脑缺血、缺氧，最终导致神经细胞功能下降，学习记忆功能障碍，和因动脉粥样硬化，动脉管腔狭窄等原因造成的血管性痴呆基本相似，通过行为学试验也证实模型大鼠存在明显的学习、记忆障碍，是较理想造模方式。

学习、记忆等复杂生理过程的高级整合与神经递质密切相关，特别是乙酞胆碱是进行及维持高级神经功能的重要介质之一，在血管性痴呆的发病过程中，脑组织中的神经递质明显减少，尤其是大脑皮层的乙酞胆碱的减少与血管性痴呆的智力下降有着密切的关系。本试验通过观察各组大鼠脑组织内乙酰胆碱酯酶的含量变化，发现模型组的含量明显增高，与空白组相比存在显著差异，说明血管性痴呆大鼠脑组织内乙酸胆碱含量明显减少。而本发明提供的组合物显著降低脑组织中乙酸胆碱醋酶的活性，减少其对乙酞胆碱的降解，增加其含量，从而改善学习、记忆能力，且作用效果优于对照组。

近年研究发现不同的脑区神经元对缺血的敏感性不同，海马结构是最为敏感的区域，特别是海马CAI区是与空间辨别及学习记忆关系最为密切。通过TUNEL法可以准确的反映细胞凋亡最典型的形态特征，其敏感度和特异性都较高，目前被广泛应用。本实验结果显示模型组海马CAI区细胞凋亡数明显增多，而各给药组细胞凋亡数目虽然较空白组细胞凋亡数目增多，但于模型组比较，有显著减少，说明本发明提供的组合物能减少海马CAI神经细胞凋亡，而且本发明提供的组合物比对照组效果更为显著。

参苏补肾胶囊方中诸药恰具有补肾健脑功效，从中医理论上印证其延缓衰老作用。本发明具有提高大鼠肾组织中SOD和T-AOC活性水平，降低MDA含量的作用，与六味地黄丸功效相似，说明本发明补益肝肾效果显著对所测肝肾功能指标水平均有改善作用。有研究表明，衰老大鼠的肝肾会出现组织结构的退行性病变，组织细胞超微结构的不同程度损伤。当肝肾组织呈现组织结构的退行性病变时，其代谢水平和生理功能都会受到一定程度的影响，在临床上往往通过肝肾功能指标的检测来诊断肝肾的生理功能是否异常，进而判断组织可能的疾病。ALT、AST、ALP是肝脏中重要酶系，CREA及BUN是评价肾脏功能的重要指标，当肝肾组织出现损伤或者病变，其对应的功能指标水平也将出现不同程度的变化。实验研究结果表明在ALT、AST、ALP、CREA及BUN指标中表现出较为理想的效果，说明参苏补肾胶囊具有改善衰老模型大鼠肝肾功能的作用，且作用效果优于对照组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.组合物，其特征在于，以质量份计，由如下组分制成：

提取物A 8~10份提取物B 4~6份提取物C 20~30份药材组合物 8~15份

合并所述沉淀A和所述沉淀B，经离子交换柱以30%氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液，制得提取物A；

所述提取物B的制备方法为：合并所述上清液A与所述上清液B，用8000~12000道尔顿分子量的滤膜超滤，收集滤液，制得提取物B；

所述提取物C的制备方法为：取何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根与水混合后回流提取，过滤，收集滤液过大孔吸附树脂，经水洗脱，弃去洗脱液，再经60~80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，得提取物C；其中，何首乌、丹参、薏苡仁、五味子、天麻、远志、葛根的质量比为9:9:6:6:6:6:6；

所述药材组合物的制备方法为：取西洋参、紫苏子、石菖蒲，混合后粉碎，过筛，得药材细粉；其中，西洋参、紫苏子、石菖蒲的质量比为1:9:9。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述提取物A的制备方法中，所述pH值为2~5，所述回流水解的温度为60~80℃，所述回流水解的时间为3~6h，所述离心的转速为5000~8000r/min，所述离心的时间为5min，所述上清液的pH值为至7~8。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述提取物A的制备方法中，所述pH值为7.5~8，所述胰蛋白酶的酶活为2500~4000；所述酶解的温度为30~60℃，所述酶解的时间为5~8h，所述离心的转速为5000~8000r/min，所述离心的时间为5min。

4.根据权利要求1~3任一项所述的组合物在制备补肾和/或健脑的药物中的应用。