CN116270880B - 一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物、其制备及应用 - Google Patents
一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物、其制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物、其制备方法及应用。该中药组合物包括以下原料药：丹参、琥珀粉、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子。本发明还公开了上述中药组合物的制备方法及在制备治疗失眠和焦虑症药物中的应用。本发明中药组合物可以改善特定脑区的功能连接及功能激活，并改善相应白质束的微观结构完整性，从而实现抗焦虑和改善失眠的作用。
Description
技术领域
本发明涉及中医药技术领域。更具体地，涉及一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物、其制备方法及应用。
背景技术
广泛性焦虑症(GAD)是焦虑障碍(AD)中最为常见的一种，一般作为其他类型焦虑症的补充诊断，临床症状为持续且难以缓解的焦虑和担忧，并伴有非特异性的生理和心理症状，如不安、疲劳、注意力难以集中、易怒、肌肉紧张或睡眠障碍等。失眠是指受各种心理或生理因素影响导致睡眠时间、深度不足，或入睡困难、睡后易醒等一系列综合征，影响患者日常生活工作。长期失眠患者除有乏力倦怠、记忆力下降、食欲减退外，往往伴有心烦意乱、易激怒、紧张、坐立不安等焦虑障碍的表现。有研究表明，睡眠障碍的人群中有6％～10％的失眠患者伴发焦虑障碍(陈春芳，中医药治疗失眠临床研究进展，中医药临床杂志，2019，31(09):1776-1780)。长期失眠会引发一系列生理和心理病变，成为焦虑、抑郁等精神疾病的风险因素，不良情绪也将加重失眠。苯二氮类药物具有明确的抗焦虑作用，部分药物还具有镇静助眠作用，常用于焦虑与失眠共病的情况。但苯二氮/>类药物长期使用不良反应较多，且有依赖性和耐受性，突然停药可出现反跳现象和戒断症状，导致停药困难。目前临床上普遍存在镇静催眠药非医疗使用和滥用的现象，主要是苯二氮/>类受体激动剂，此类药物的滥用会导致精神和躯体依赖、认知障碍、抑郁焦虑、跌倒风险和死亡风险升高等。中医药治疗GAD主要有辨证论治、针灸推拿等方法，其临床疗效显著且远期疗效优于西药治疗，但亦存在缺乏客观证候诊断及疗效评价标准，缺少对发病机制和中药治疗GAD作用靶点的系统深入科学研究等问题。
发明内容
目前，广泛性焦虑症(GAD)以明确的中枢神经情感网络异常为主要发病模式，皮质边缘系统的调节障碍，以及杏仁核处理威胁信息的异常，均是GAD患者产生焦虑行为的重要模式。最优的无创性研究脑功能和脑结构的技术，即磁共振成像及其丰富的成像序列。GAD情绪处理的脑机制体现在对负面刺激的异常偏见和对负面情绪的调节受损，这类机制的研究发现主要借助了功能磁共振成像技术。静息态功能磁共振成像(rs-fMRI)技术能探测基线状态下脑部自发神经活动的非侵入性方法，具有时空分辨率高、结构和功能同时成像等优点，被广泛地应用于失眠的脑机制研究中。
针对上述技术问题，本申请借助磁共振成像技术对中医药治疗失眠和焦虑症进行治疗机制研究，从而筛选并提供了可以有效改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物。
本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述中药组合物在制备治疗失眠和焦虑症的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物，该中药组合物包括以下原料药：丹参、琥珀粉、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子。
优选的，该中药组合物包括以下原料药：丹参10-40份、琥珀粉1-6份、酸枣仁10-60份、生地黄10-40份、知母5-30份、白术10-30份、枳壳10-30份和栀子3-20份。
在本发明处方中，丹参，味苦微寒，归心、肝经，能活血祛瘀，清心除烦，能直接作用于心神不宁的核心病理环节。清严洁等《得配本草》载：“心血不足以养神，神不安而虚火动者，丹参补之。”故而心神不安，虚火内动，最宜丹参，为方中君药之一。琥珀粉，味甘平，归心、肝、膀胱经，活血散瘀，镇惊安神，能使浮越之心气内敛，与丹参共为君药。《本草经解》：“主安五脏，定魂魄，杀精魅邪气……五脏藏，阴者也，血有所凝，则五脏为之不安，琥珀甘平和血，故安五脏也；随神往来者谓之魂，并精出入者谓之魄，魄阴而魂阳也，琥珀气平入肺，肺主气，味甘入脾，脾统血，质坚有镇定之功，所以入肺脾而定魂魄也，魂魄定则神气内守。”
GAD在症状上与悗病较为相似，根据王肯堂提出的治疗“悗”的基本思路，包括辛甘化阳以助阴长，苦寒泻伏火以救肾水，补益肾水以降心火，潜镇心气浮越以安神，故方中臣知母养阴清热，滋阴除燥，臣酸枣仁补益心血，安神宁心。知母，甘苦寒，归肺、胃、肾经，清吴仪洛《本草从新》载，“辛苦寒滑，泻肾家有余之火(膀胱邪热、服此亦清)，因而上清肺金(兼泻胃热)”，故知母能滋阴以救肾水。酸枣仁味甘酸，性平，归肝、胆、心经，清黄宫绣《本草求真》载，“生则能导虚热，故疗肝热好眠，神昏燥倦之症；熟则津液，故疗胆虚不眠，烦渴虚汗之症”。又臣以生地，寒凉以补益肾水，使心神宁而肾志定。《冯氏锦囊秘录》载生地：“味甘苦，大寒，无毒。禀仲冬之气以生稼，禀地之和气以长黄者，土之正色也。甘能入脾，苦能入心，故兼入心脾。蒸晒至黑，则减寒性，而专补肾脏精血也。”生地专擅养阴补津，补益脾肾。
脾胃为气机升降之枢纽，故方佐以白术健脾益气，和调脾胃；胸中气郁，容易化火，故佐苦寒之栀子清心除烦，取法仲景栀子豉汤，以宣清胸中郁热；配伍枳壳宽胸行气，以开气郁。枳壳善理气除满，宽胸消滞，阴虚内燥，易致气滞或气郁，故方中须有理气之品，并防养阴滋腻之弊，为佐药之用。
诸药合用，共奏安神宁心，滋肾定志，轻宣郁热之功。用于治疗阴虚火旺所致的焦虑、失眠、抑郁等症，症见心烦焦躁、情绪不宁、口渴心悸、失眠多梦、自汗盗汗、体虚乏力、严重者可有兴趣减退，情绪低落等表现，舌颤瘦红，有裂纹，苔薄黄，脉细数或促。
在本发明中，示例性的，所述改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物，包括以下重量份的原料药：丹参15份、琥珀粉3份、酸枣仁15份、生地黄15份、知母10份、白术10份、枳壳10份和栀子6份。
示例性的，所述改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物，包括以下重量份的原料药：丹参10份、琥珀粉5份、酸枣仁50份、生地黄30份、知母10份、白术10份、枳壳10份和栀子6份。
示例性的，所述改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物：丹参20份、琥珀粉2份、酸枣仁20份、生地黄15份、知母20份、白术20份、枳壳20份和栀子15份。
本发明上述中药组合物的各原料药组成基本方，具体实施时，根据临床症状在上述中药组合物的基础上可以进行调整，以达到改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症，并改善某些合并临床症状的目的，进一步增强本发明组合物的适应性，提高治疗效果。基于本发明的基本方所做的这些调整方也在本申请的保护范围内。
第二方面，本发明提供了上述改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物的制备方法。实际上，本发明的中药组合物可以按照本领域常规制备方法来制备，例如煎煮法、浸渍法、回流法等等。在此提供了如下制备方法仅为更好地理解本发明，本领域技术人员应该理解此制备方法不应对本发明的保护范围构成限制。
本发明的改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)按照处方量称取丹参、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子，加水煎煮，过滤得药液，干燥，得干膏粉；
(2)按照处方量称取琥珀粉，与步骤(1)获得的干膏粉混合均匀，即得。
第三方面，本发明提供了一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的药物，该药物包括上述中药组合物或者上述制备方法制备的中药组合物。
根据实际需要，所述药物还可以包括药学上可接受的辅料。例如溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料等等，按照常规制剂工艺，制成各种制剂，例如煎剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、口服液等剂型。
本发明还提供了上述中药组合物或者通过上述制备方法制备得到的中药组合物在制备治疗失眠和焦虑症的药物中的应用。
另外，如无特殊说明，本发明中药组合物各原料药均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围的中药组合物均可以达到延缓动脉粥样硬化及肾功能不全进展的目的。
本发明的有益效果如下：
本发明组方思路取法于《证治准绳》对“悗”病机和治法的论述。全方由丹参、琥珀粉等8味药组成，具有安神宁心，滋肾定志，轻宣郁热的作用。本方前期在门诊以协定处方形式治疗GAD患者，经处方筛选，共有156例病例，临床有效率达90％。GAD发病中“心神被扰”是不可避开的环节，无论致病的病因是阴虚还是实火，是痰火还是气郁，都需要干预治疗心神被扰的关键病理过程。经后期临床研究证实，本发明中药组合物具有与盐酸丁螺环酮相当的抗焦虑作用，治疗广泛性焦虑症的临床总有效率为86％，且本发明中药组合物在改善患者中医症状方面优于盐酸丁螺环酮，临床副作用更小，较好的安全性。在明确临床疗效及治疗优势的基础上，进一步借助多模态磁共振技术深入研究本发明中药组合物干预广泛性焦虑症与失眠共病的脑功能与脑结构变化，证实本方可以改善特定脑区的功能连接及功能激活，并改善相应白质束的微观结构完整性，从而实现抗焦虑和改善失眠的作用。本研究能为推广中医药在该领域的治法应用提供基础，为进一步研究本发明中药组合物干预脑白质相关疾病提供更多理论支持。
附图说明
图1示出中、西药组HAMA量表评分及HAMA量表减分率分布图；
图2示出中、西药组中医症状积分量表评分及减分率分布图；
图3示出中、西药组GAD-7量表评分变化趋势图；
图4示出中药组治疗前后mALFF、mfALFF、szReHo的差异脑区，其中，CM表示中药组，pre代表治疗前，post代表治疗后；
图5示出中药组治疗前后KFA、MK差异脑区，其中，CM表示中药组，pre代表治疗前，post代表治疗后；
图6示出中药组治疗前后AK、RK差异脑区，其中，CM表示中药组，pre代表治疗前，post代表治疗后；
图7示出对髓鞘保护作用的电镜结果(n＝1)；
图8示出WB检测结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物
原料药处方：丹参15g、琥珀粉3g、酸枣仁15g、生地黄15g、知母10g、白术10g、枳壳10g和栀子6g。
制备方法：
(1)按照上述处方量称取丹参、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子，加水，小火煎煮，过滤得药液。
服用方法：
(1)上述制得的药液直接服用。
(2)琥珀粉另冲服，与汤药同服。
实施例2一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物
原料药处方：丹参10g、琥珀粉5g、酸枣仁50g、生地黄30g、知母10g、白术10g、枳壳10g和栀子6g。
制备方法：
(1)按照处方量称取丹参、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子，加水煎煮，过滤，滤液浓缩成浸膏，然后干燥，得干膏粉；
(2)按照处方量称取琥珀粉，与步骤(1)获得的干膏粉混合均匀，即得。
实施例3一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的药物(颗粒剂)
原料药处方：丹参20g、琥珀粉2g、酸枣仁20g、生地黄15g、知母20g、白术20g、枳壳20g和栀子15g。
制备方法：
(1)按照处方量称取丹参、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子，加水煎煮，过滤，滤液浓缩成浸膏，然后干燥，得干膏粉；
(2)按照处方量称取琥珀粉，与步骤(1)获得的干膏粉混合均匀，按照常规的颗粒剂制备工艺制成颗粒。
实验例1临床研究
目的：评价本发明中药组合物治广泛性焦虑症(GAD)的临床疗效，采用多模态磁共振技术评价中药治疗前后GAD患者脑功能和结构的改变。
方法：招募符合纳排标准的广泛性焦虑症患者100例，采用随机化方法分为中药组50例和西药组50例。以HAMA量表、中医症状积分量表、GAD-7评价患者的焦虑状况。中药组服用本发明汤剂，西药组服用盐酸丁螺环酮片，疗程6周；在50名中药组受试者中，随机抽选10名患者参与治疗前后脑磁共振检查。
本发明汤剂(丹琥宁神方)处方及煎煮方法：
处方：丹参15g、琥珀粉3g、酸枣仁15g、生地黄15g、知母10g、白术10g、枳壳10g和栀子6g。煎煮方法：取丹参、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子饮片以水1400ml，小火煎煮40分钟，取汤药400ml，分2次服用，每次200ml，早晚饭后温服。琥珀粉另冲服，与汤药同服，每次1.5g，1天2次。
结果：
1.与治疗前相比，中、西药组在治疗6周后，HAMA量表、中医症状积分量表、GAD-7量表评分与基线相比均明显下降，具有显著统计学差异(P<0.01)。见表1、图1，表2、图2，表3、图3。
表1中、西药组治疗后HAMA量表总分变化及组间比较(分)
注：*P＝0.00001＜0.01，有显著统计学差异；**P＝0.00014＜0.01，有显著统计学差异；组间采用独立样本T检验，#P＞0.05，无统计学差异。
表2中、西药组治疗后中医症状积分表评分(分)
注：中、西药组治疗前后对比采用配对样本T检验，*P<0.01，*P<0.01，有显著统计学差异；组间对比采用独立样本T检验，#P>0.05，无统计学差异。
表3中、西药组治疗后GAD-7量表评分(分)
注：中、西药组治疗前后对比采用配对样本T检验，*P<0.01，*P<0.01，有显著统计学差异；组间对比采用独立样本T检验，#P>0.05，无统计学差异。
2.中药组HAMA量表减分率总有效率为86.0％，西药组总有效率为84.0％；中、西药组的减分率无统计学差异(P>0.05)；HAMA量表子项“失眠”“自主神经系统症状”“抑郁心境”，两组有统计学差异(P<0.05)。见表4。
表4中、西药组治疗后HAMA量表子项减分率分布对比(％)
注：采用非参数Mann-Whitney检验，*P<0.05。
3.中药组中医症状积分量表减分率总有效率为88.0％，西药组总有效率为84.0％，两组间有统计学差异(p<0.05)；两组在3周末“心神不宁”的减分率上有统计学差异(P<0.05)，6周末无统计学差异；两组在6周末“入睡困难”“性别相关症状”的减分率上有统计学差异(P<0.05)。见表5。
表5中、西药组治疗后中医症状积分减分率分布情况(％)
4.中药组治疗前后mALFF值的差异团块分布在左侧小脑上部和顶下缘角回2个脑区。其中左侧小脑上部的mALFF值，中药组治疗前大于治疗后(T＝-6.793，P<0.05)；顶下缘角回的mALFF值，中药组治疗后大于治疗前(T＝8.341，P<0.05)。mfALFF值的差异团块分布在顶下缘角回和右侧额中回2个脑区。中药组治疗后的mfALFF值均大于治疗前(T＝7.853，P<0.05；T＝6.038，P<0.05)。差异团块有2个，Cluster1以左侧小脑后叶为主，延伸至椎体束和舌回，包括椎体束(96mm3)；Cluster2分布在左侧顶叶，包括顶下缘角回(152mm3)、顶下小叶(136mm3)。szReHo值的差异团块体现在眶部额中回。中药组治疗后眶部额中回的szReHo值大于治疗前(T＝5.447，P<0.05)。见表6、图4。
表6中药组(治疗后－治疗前)静息态参数的差异脑区(AAL)
注：差异团块选取的显著性阈值为P<0.05，本表中所有P值均小于0.001。
5.中药组(治疗后－治疗前)的KFA值差异团块主要分布在左侧前额叶和左侧尾状核，差异白质束包括左丘脑前辐射、胼胝体体部、左上放射冠和左上额枕束，治疗后的KFA值小于治疗前(T＝-4.257，p＝0.0000)。MK值差异团块主要分布在右侧尾状核头部，差异白质束包括右丘脑前辐射、右内囊前肢和右内囊后肢，治疗后的MK值小于治疗前(T＝-8.457，p＝0.0000)。AK值差异团块主要分布在内侧和旁扣带脑回、左侧楔前叶、左侧岛叶、左侧补充运动区和右侧海马，差异白质束包括双侧上纵束、左丘脑前辐射、双侧扣带回、左皮质脊髓束、左钩束、右皮质脊髓束和右上放射冠，治疗后的AK值小于治疗前(T＝-7.271，p＝0.0000)。RK值差异团块主要分布在右侧丘脑，差异白质束包括右丘脑前辐射、右内囊前肢和右内囊后肢，治疗后的RK值小于治疗前(T＝-7.984，p＝0.0000)。见表7、表8、图5、图6。
表7中药组(治疗后－治疗前)DKI参数的差异脑区(AAL)
表8中药组(治疗后－治疗前)DKI参数的差异脑白质束(JHU White-MatterTractography Atlas)
小结：
1.丹琥宁神方能有效降低GAD患者HAMA量表评分、中医症状积分量表评分和GAD-7评分，有效改善GAD患者的临床症状。
2.丹琥宁神方具有与盐酸丁螺环酮相当的抗焦虑作用，丹琥宁神方治疗广泛性焦虑症的临床总有效率为86％，丹琥宁神方在改善患者中医症状方面优于盐酸丁螺环酮，临床副作用更小，较好的安全性。
3.丹琥宁神方能广泛作用于前额叶皮质、前扣带回、边缘系统等复杂情感加工网络的脑区，能降低如左侧小脑上部、顶下缘角回等的mALFF值，升高眶部额中回等的szReHo值，从而改善脑区间的功能连接。
4.丹琥宁神方针对脑结构也有较好的干预作用，如能降低右丘脑前辐射、右内囊前肢和右内囊后肢等白质束的MK值，降低双侧上纵束、左丘脑前辐射、双侧扣带回等的AK值，改善局部白质微观结构，强化白质的传导功能。
实验例2丹琥宁神方对焦虑抑郁模型小鼠行为学评价及机制研究
1材料和方法
1.1实验动物
C57BL/6N雄性小鼠
1.2动物模型
焦虑抑郁模型建立方法：(1)冰水游泳3min；(2)足底电击2min：自制电击，1mA，30mv，每次电击10s，间隔时间随机；(3)夹尾2min；(4)倾斜24h；(5)潮湿垫料24h；(6)黑白颠倒24h；(7)禁食禁水24h；(8)异物干扰24h，8种刺激随机应激持续8周，进行行为学检测。
1.3动物分组
分为正常组、模型组、西药组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组，每组10只。
1.4实验药物的配制和剂量
本发明药物组(丹琥宁神方)：处方：丹参15g、琥珀粉3g、酸枣仁15g、生地黄15g、知母10g、白术10g、枳壳10g和栀子6g。按照上述处方制成颗粒。西药为盐酸丁螺环酮。
大剂量组：用成人两天的颗粒制剂和纯净水配制140ml药液，每只小鼠的灌胃量为0.2ml/10g/d，相当于24g/kg/d的生药量。
中剂量组：用成人一天的颗粒制剂和纯净水配制140ml药液，每只小鼠的灌胃量为为0.4ml/10g/d，相当于12g/kg/d的生药量。
小剂量组：用成人半天的颗粒制剂和纯净水配制140ml药液，每只小鼠的灌胃量为0.2ml/10g/d，相当于6g/kg/d的生药量。
西药组：将20mg盐酸丁螺环酮碾碎后和纯净水配置140ml药液，每只小鼠的灌胃量为0.2ml/10g/d，相当于2.85mg/kg/d的用药量。
正常组和模型组小鼠每天给予等体积纯净水灌胃。
灌胃一日一次，持续8周。
1.5行为学观察方法
1.5.1糖水实验
蔗糖加纯净水配成1％的蔗糖水，第1d每笼1瓶糖水24h，第2天糖水、纯净水各1瓶饮水24h，糖水位置不变，第3天小鼠禁水24h，第4天200g1％蔗糖水和纯净水各1瓶按原来位置摆放24h，后称糖水和白水的饮水量，根据公式计算糖水百分比＝糖水/(糖水+纯净水)。
1.5.2高价十字迷宫
将小鼠放入迷宫中央，头朝开臂，并注意此后每只实验动物均方子同一位置。同时开启摄像监控记录5min内实验动物开臂和闭臂的进入次数及进入各臂的时间。实验过程中实验者需距离迷宫1米的距离。记录结束后将实验动物放回饲养笼内。同时清理迷宫，并用5％的醋酸水溶液或75％的酒精擦拭迷宫，借以消除动物气味对后继实验动物的影响。分析：开臂进入次数百分比＝开臂进入次数/(开臂进入次数+封闭臂进入次数)％、开臂滞留时间百分比＝开臂滞留时间/(开臂滞留时间+闭臂滞留时间)％。
1.5.3旷场实验
开口的木盒底部形成9个等大的方格。场地中央置一彩色瓶子以激发小鼠的好奇心。照明来自以高出场地中央2.8m的40W白炽灯。预适应：每只小鼠放入场地中央自由活动3min。每只小鼠面朝墙放入同一个拐角方格，并让其自由探索环境5min。每只小鼠测试结束后，湿布擦洗场地并用干布擦干。数据分析：跨越方格总数(以双后肢跨出作为标准，时间也以后肢为算。)第一格的潜伏期、周边时间、抬腿次数(双腿离地)。
1.5.4强迫游泳实验
强迫游泳实验测试工具为透明塑料圆筒(25cm×10cm)，水面高12cm，温度(25±1)℃。实验开始时将小鼠放入水中，测试时间为6min，视频记录整个过程，统计每只小鼠在测试后4min内的不动时间。
1.6形态学观察
1.6.1小鼠脑组织灌注取材
(1)取正常组、模型组、丁螺环酮组、丹琥宁神组高、中、低剂量组小鼠各1只用以灌注取材，1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，眼科剪开胸；
(2)将输液器针头从左心室插入至主动脉，37℃生理盐水迅速滴注同时剪开右心耳，直至肝脏变白或肠管水肿后，可换为4℃4％多聚甲醛固定液进行内固定；
(3)如灌注成功可见小鼠尾巴翘起，4％多聚甲醛固定液灌注30min左后时可见小鼠全身尤其是颈部僵硬，即可停止灌注；
(4)用手术器械小心取出完整脑组织置于4％多聚甲醛固定液中后固定48h左右，用镊子夹入30％蔗糖溶液脱水，脱水完全(脑组织沉底)后包埋用冰冻切片机进行切片，厚度为20μm，脑组织切片置于冰冻切片保护液中-20℃保存待用。
1.6.2透射电镜观察小鼠脑组织胼胝体区域
(1)取材固定：新鲜组织确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，组织体积3mm×3mm×3mm，迅速投入2.5％戊二醛固定液中4℃固定3h以上。
(2)0.1M磷酸缓冲液PBS(PH7.4)漂洗3次，每次10min。
(3)用0.5％的锇酸·0.1M固定3h，0.1M磷酸缓冲液PBS(PH7.4)漂洗3次，每次10min。
(4)依次入50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精上行脱水，每次15min。
(5)Spurr树脂浸透包埋。
(6)70℃聚合48h。
(7)切片机切片60-80nm超薄切片。
(8)铀铅双染色(2％醋酸双氧铀，柠檬酸铅，各染色10min)，切片室温干燥。
(9)取景：透射电子显微镜取景。
1.7ELISA检查
1.7.1小鼠血清标本采集
(1)每组取6只小鼠用于血清标本的采集。
(2)用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠。
(3)手术剪打开腹腔，手术显微镜下分离腹主动脉。
(4)1ml注射器抽取全血约800μl～900μl于5ml促凝管中，全血标本室温静置20min，血液充分凝固，上层析出黄色透亮液体，低温离心机3000r/min，离心10min。
移液枪收集上层血清标本，置于-20℃冰箱保存待用，保存时如出现沉淀，使用前应再次离心，避免反复冻融，该血清标本用于ELISA测定5-HT、GABA的含量。
1.7.2ELISA法测定小鼠血清5-羟色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)
1.7.2.1样品处理
用样本稀释液将待测样本10倍稀释待用。
1.7.2.2操作步骤
(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
(3)样本孔加入待测样本50μl，空白孔不加。
(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封板后37℃孵育60min。
(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
(6)每孔加底物A、B各50ul，37℃避光孵育15min。
(7)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
1.8WB检测应用western-blot法检测Claudin11、ERK、CREB、TGF-β3、p38MAPK、MMP-9的变化。
1.8.1样本蛋白提取
(1)Protein Extraction Kit(中)(GenePool/GPP1815)试剂盒说明书操作，对客户提供的组织样品进行蛋白提取。
(2)依照电泳上样量需要，用水及SDS-PAGE Loading Buffer(5×)(GenePool/GPP1820)调整蛋白浓度，100℃煮沸变性10min。
1.8.2SDS-PAGE凝胶配制
按SDS-PAGE Gel Kit(GenePool/GPP1816)说明书操作，根据目的蛋白的分子量，配制12％(Phospho-p38 MAPK，TGF beta 3，Phospho-CREB)，13％(Claudin 11)，10％(MMP9)的分离胶，5％浓缩胶。
1.8.3SDS-PAGE凝胶电泳
(1)待检测蛋白样品上样量：上样35μg。
(2)电泳条件：浓缩胶恒压80V，约20min；分离胶恒压120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。
1.8.4湿转转膜
(1)转膜方法：准备一张大小合适的PVDF膜，浸泡于甲醇中30sec，再转移至WBTransfer Buffer(GenePool/GPP1817)中，备两张与PVDF膜大小一样的厚滤纸浸泡于WBTransfer Buffer(GenePool/GPP1817)中备用；切除多余凝胶部分，按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序放入海绵垫夹层中，赶尽气泡。
(2)转膜条件：按照电流300mA恒流转膜；0.22μm孔径PVDF膜，转膜时间2h(Phospho-p38 MAPK，TGF beta 3，Phospho-CREB)，2.5h(MMP9)，1h(Claudin 11)。
1.8.5WB检测目的蛋白
(1)封闭：转移结束后将PVDF膜浸泡于Milk Blocking Buffer(GenePool/GPP1819)/BSA Blocking Buffer(GenePool/GPP1818)中，摇床中轻摇1h。
(2)一抗稀释：用1％BSA/5％milk稀释一抗。
(3)一抗孵育：封闭结束后，将PVDF膜置于杂交袋中，加入2中配制好的一抗，用封膜机封口，4℃孵育过夜。
(4)洗膜：TBST(GenePool/GPP1822)洗膜3次，每次5min。
(5)二抗孵育：用Milk Blocking Buffer(GenePool/GPP1819)稀释二抗，羊抗兔-HRP或羊抗小鼠-HRP(根据一抗来源自行选择相应二抗)1：5000稀释，室温轻摇50min。
(6)洗膜：TBST(GenePool/GPP1822)洗膜4次，每次5min。
(7)ECL(GenePool/GPP1824)反应、胶片曝光：将PVDF膜浸泡于ECL(GenePool/GPP1824)显色液中1min，暗室中曝光、显影并定影。
1.9统计方法
将所用数据录入电脑后，釆用SPSS26.0统计软件进行统计学分析。先对数据进行正态性检验和方差齐性检验，若数据服从正态分布则釆用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较选用LSD，若出现方差不齐时，釆用K个独立样本(Kruskal-Wallis)检验。检验标准均为0.05，所用统计数据以均值±标准差表示。
2.结果
2.1行为学实验结果
2.1.1糖水偏好实验结果
表9糖水偏好实验结果(n＝10)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表9所示，模型组相比于正常组小鼠的糖水偏好率降低，差异具有统计学差异(p<0.01)；相较于模型组，西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大、中、小剂量组小鼠的糖水偏好率均有提升，但只有西药组和中药大剂量组的小鼠糖水偏好率与模型组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.1.2高价十字迷宫开放臂进入次数百分比
表10高价十字迷宫实验开放臂进入次数百分比结果(n＝10)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表10所示，正常组组的开放臂进入次数明箱高于模型组，差异具有统计学意义(p<0.01)；西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组开放臂进入次数高于模型组，差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.1.3旷场实验行为学结果
2.1.3.1运动距离
表11旷场实验之运动距离结果(n＝10)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表11所示，在旷场实验中模型组小鼠比正常组小鼠的运动距离短，差异具有统计学差异(p＜0.05)；相较于模型组，西药组、中药大、中、小剂量组的小鼠运动距离都有提高，但只有中药大剂量组小鼠运动距离相较模型组的提高具有统计学差异(p＜0.05)。
2.1.3.2中心区域运动时间
表12旷场实验之中心区域运动时间结果(n＝10)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表12所示，相较于正常组小鼠，模型组小鼠的中心区域运动时间明显缩短，差异具有统计学意义(p＜0.05)。相较于模型组，西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大、中、小剂量组的中心区域运动时间均有不同程度的增加，但只有西药组和中药中剂量组与模型组之间的差异具有统计学意义(p＜0.05)。
2.1.4.强迫游泳实验后四分钟不动时间
表13强迫游泳实验结果(n＝10)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表13所示，相较于正常组，模型组小鼠的后四分钟不动时间明显增加，差异具有统计学意义(p<0.01)；相较于模型组，西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大、中、小剂量组的后四分总不动时间均有下降，其中西药组小鼠的后四分钟不动时间相较于模型组的减少，具有统计学意义(p<0.05)；中药中剂量组小鼠的后四分钟不动时间相较于模型组显著降低，差异具有统计学意义(p<0.01)。
2.2病理电镜观察
如图7所示：正常组小鼠少突胶质细胞密度明显大于模型组；在模型组可见胼胝体髓鞘疏松；丹琥宁神方大剂量组、中剂量组和西药(丁螺环酮组)小鼠胼胝体区髓鞘密度及厚度显著高于模型组，表明丹琥宁神方对髓鞘具有保护作用。
2.3ELISA检测结果
2.3.1ELISA检测结果之5-TH
表14 5-TH检测结果(n＝6)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表14所示：模型组小鼠血液中5-TH的浓度显著低于正常组(p<0.01)；与模型组相比，西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大、中、小剂量小鼠血液中5-TH的含量均有不同程度的提高，其中西药组和中药中剂量组小鼠血液中5-TH的浓度显著高于模型组(p<0.01)，中药大剂量组小鼠血液中5-TH的浓度显著高于模型组(p<0.05)。
2.3.2ELISA检测结果之GABA
表15GABA检测结果(n＝6)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表15所示：模型组小鼠血液中GABA的浓度显著低于正常组(p<0.01)；西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大剂量组和中药中剂量组小鼠血液中GABA的浓度显著高于模型组(p<0.01)。
2.4WB检测结果
参见图8。
2.4.1前额叶WB检测结果
表16前额叶WB检测结果(除MMP-9n＝5外，其余指标n＝6)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表16所示：与正常相比，模型组小鼠前额叶内TGF-β3、p-pMAPK、MMP-9蛋白的表达显著提高(p<0.01)。相较于模型组，西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大、中药中、中药小组小鼠的TGF-β3、p-pMAPK、MMP-蛋白的表达显著降低(p<0.01)。模型组小鼠前额叶内p-CREB、Claudin-11蛋白的表达，相较于正常组显著降低(p<0.01)。而相较于模型组，西药组、中药大、中、小剂量组p-CREB、Claudin-11蛋白的表达均有一定程度降低，而西药组和中药中剂量组p-CREB、Claudin-11蛋白的表达呈显著上升(p<0.01)。
2.4.2杏仁核WB检测结果
表17杏仁核WB检测结果(n＝6)
注：#P<0.05，##P<0.01与正常组相比；*P<0.05，**P<0.01与模型组相比
如表17所示：与正常相比，模型组小鼠杏仁核内TGF-β3、p-pMAPK、MMP-9蛋白的表达显著提高(p<0.01)。相较于模型组，西药组(盐酸丁螺环酮)、中药大、中药中、中药小组小鼠的TGF-β3、p-pMAPK、MMP-蛋白的表达显著降低(p<0.01)。模型组小鼠杏仁核内p-CREB、Claudin-11蛋白的表达，相较于正常组显著降低(p<0.01)。而相较于模型组，西药组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组p-CREB、Claudin-11蛋白的表达均有一定程度降低，而西药组和中药中剂量组p-CREB、Claudin-11蛋白的表达的表达呈显著上升(p<0.01)，中药小剂量组p-CREB蛋白的表达降低具有统计学意义(p<0.05)。
3.讨论
本实验中运用慢性不可预测温和应激(CUMS)方法制造焦虑、抑郁模型。在实验中，模型组表现为高价十字迷宫进入开放臂次数减少，旷场运动中运动距离和中心区域运动时间减少，糖水偏好比降低，后四分钟不动时间增加。而丹琥宁神方组能够有效提高小鼠在高价十字迷宫中的开放臂进入次数百分比；提高旷场运动中的运动距离和中心区域运动时间；提高糖水偏好率；减少强迫游泳中后四分钟不动时间。在行为学层面看，丹琥宁神方确实可以有效改善小鼠的焦虑抑郁行为。在电镜中，模型组小鼠胼胝体区域髓鞘疏松，而丹琥宁神方大、中剂量组胼胝体区域髓鞘密度及厚度明显高于模型组，说明在形态学方面，丹琥宁神方参与改善焦虑抑郁模型小鼠脑白质中髓鞘的修复。在ELISA检测发现，模型组小鼠血液中5-THGABA浓度相较正常组小鼠显著降低，而丹琥宁神方可有效能更加小鼠血液中5-TH和GABA的浓度，表明丹琥宁神方可以通过上调小鼠血液中5-TH和GABA的浓度，改善小鼠的焦虑抑郁表型。在WB检测结果显示，模型组小鼠相较于正常组小鼠，前额叶和杏仁核内p-CREB、Claudin-11蛋白表达下将，而TGF-β3、p-p38MAPK、MMP-9显著下降。可见，丹琥宁神方可以通过增加血液中5-TH和GABA浓度，上调CREB/Claudin-11通路，下调TGF-β3/p38MAPK/MMP-9通路，改善CUMS小鼠的焦虑症状。
综上所述，本研究主要从神经白质髓鞘可塑性的角度探讨了丹琥宁神方改善焦虑抑郁的作用机制，显示丹琥宁神方可能通过抑制TGF-β3/p38MAPK/MMP-9信号通路，上调CREB蛋白的表达，提高claudin-11蛋白的表达，促进前额叶皮层－杏仁核神经环路髓鞘再生及修复，增加神经核团间信息整合能力，从而改善CUMS小鼠焦虑抑郁表型。本实验证明了髓鞘的病理性改变，确实参与了焦虑抑郁的发病过程。我们的实验也从础研究方面再次证明了丹琥宁神方的良好作用，该方确实可以通过改善脑白质中髓鞘的修复能力，有效缓解焦虑抑郁小鼠的症状。
典型病例
典型病例(1)
【基本信息】石某，女，54岁，广泛性焦虑症病史6年余。
【主诉】情绪紧张伴失眠6年余
【现病史】患者自诉6年前因家庭琐事出现情绪不佳，未能得到及时纾解，情绪逐渐焦躁不安，易怒，伴有明显的紧张、焦虑感，无法集中注意力工作，对以前的兴趣爱好失去兴趣。刻下：情绪紧张，担忧，焦躁不安，急躁易怒，睡眠差，入睡困难，每晚睡眠时间不足4小时，不规律服用安眠药辅助睡眠，早醒，心神不宁，坐立不安，经常来回踱步，抖腿，胸闷，二便可。舌红少苔，脉弦细。
【辅助检查】GAD临床诊断标准(DSM-5)：诊断成立；GAD-7：13分(中度GAD)；HAMA-14：32分(严重焦虑)。血常规、肝肾功能、尿常规：未见明显异常。心电图：正常心电图。
【诊断】西医诊断：广泛性焦虑症。中医诊断：郁病-阴虚内热证。
【处方】丹参20g，琥珀粉4g，酸枣仁40g，生地黄30g，知母15g，白术20g，枳壳10g，栀子15g，茯苓20g。7剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
【二诊】入睡困难好转，坐立不安有改善。服药期间未诉明显不良反应。
丹参20g，琥珀粉4g，酸枣仁30g，生地黄20g，知母15g，白术20g，枳壳10g，栀子10g。7剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
【三诊】情绪明显改善，睡眠质量好转。
丹参15g，琥珀粉2g，酸枣仁30g，生地黄20g，知母15g，白术10g，枳壳10g，栀子10g。14剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
【四诊】丹参10g，琥珀粉2g，酸枣仁20g，生地黄10g，知母10g，白术10g，枳壳10g，栀子6g。14剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
紧张情绪明显缓解，焦躁易怒基本能够控制，能较为顺利地处理家庭事务及工作，睡眠改善，每晚睡眠时间大于6小时。不需要服用安眠药。GAD-7：4分(没有GAD)；HAMA-14：9分(可能有焦虑)。
典型病例(2)
【基本信息】牛某，男，31岁，广泛性焦虑症病史12年余。
【主诉】情绪紧张伴失眠12年余
【现病史】患者自诉12年前因学业压力大出现情绪不佳，伴有明显的紧张、焦虑感，成绩明显下滑，患者未予重视及治疗。3月前患者因亲人去世，悲痛难忍，情绪低落，紧张担忧明显加重，整晚难以入睡。刻下：情绪紧张，担忧，对社交感到不适，喜欢独处，脾气急躁，容易被激怒，对自己的病情存在过度担忧，睡眠差，入睡困难，早醒，视物模糊，心悸，胸闷，喜叹息，腹胀，餐后加重，二便可。舌红少苔，脉弦细。
【辅助检查】：GAD临床诊断标准(DSM-5)：诊断成立；GAD-7：12分(中度GAD)；HAMA-14：32分(严重焦虑)。血常规、肝肾功能、尿常规：未见明显异常。心电图：正常心电图。
【诊断】西医诊断：广泛性焦虑症。中医诊断：郁病-阴虚内热证。
【处方】
丹参20g，琥珀粉3g(分冲)，酸枣仁40g，生地黄30g，知母15g，白术20g，枳壳10g，栀子15g。7剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
【二诊】入睡困难、早醒改善，心悸，胸闷有改善。服药期间未诉明显不良反应。
丹参20g，琥珀粉3g(分冲)，酸枣仁30g，生地黄20g，知母15g，白术20g，枳壳10g，栀子10g。14剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
【三诊】情绪紧张明显改善。
丹参10g，琥珀粉3g(分冲)，酸枣仁20g，生地黄20g，知母15g，白术10g，枳壳10g，栀子10g。14剂，每日1剂，煎服，早晚饭后服。
【四诊】继续前方治疗两周。
紧张情绪明显缓解，睡眠改善，能主动控制不良情绪，渐渐从悲伤中走出来。GAD-7：4分(没有GAD)；HAMA-14：10分(可能有焦虑)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：丹参10-40份、琥珀粉1-6份、酸枣仁10-60份、生地黄10-40份、知母5-30份、白术10-30份、枳壳10-30份和栀子3-20份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：丹参15份、琥珀粉3份、酸枣仁15份、生地黄15份、知母10份、白术10份、枳壳10份和栀子6份。
3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：丹参10份、琥珀粉5份、酸枣仁50份、生地黄30份、知母10份、白术10份、枳壳10份和栀子6份。
4.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药制成：丹参20份、琥珀粉2份、酸枣仁20份、生地黄15份、知母20份、白术20份、枳壳20份和栀子15份。
5.权利要求1-4任一所述的改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的中药组合物的制备方法，其特征在于，
(1)按照处方量称取丹参、酸枣仁、生地黄、知母、白术、枳壳和栀子，加水煎煮，过滤，滤液浓缩成浸膏，然后干燥，得干膏粉；
(2)按照处方量称取琥珀粉，与步骤(1)获得的干膏粉混合均匀，即得。
6.一种改善脑情感网络功能及白质结构完整性治疗失眠和焦虑症的药物，其特征在于，包括权利要求1-4任一所述的中药组合物或者权利要求5所述的制备方法制备的中药组合物。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型为煎剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂或口服液。
9.权利要求1-4任一所述的中药组合物或权利要求5所述的制备方法制备的中药组合物在制备治疗失眠和焦虑症的药物中的应用。
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| CN (1) | CN116270880B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101095790A (zh) * | 2007-07-02 | 2008-01-02 | 闫社因 | 一种治疗焦虑症的中药组合物及其制备方法 |
| CN112402554A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-02-26 | 中国中医科学院广安门医院 | 一种治疗脑白质病的中药组合物及其应用 |
-
2023
- 2023-04-23 CN CN202310441253.1A patent/CN116270880B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101095790A (zh) * | 2007-07-02 | 2008-01-02 | 闫社因 | 一种治疗焦虑症的中药组合物及其制备方法 |
| CN112402554A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-02-26 | 中国中医科学院广安门医院 | 一种治疗脑白质病的中药组合物及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 酸枣仁汤治疗广泛性焦虑障碍临床分析;李军艳等;《山东中医药大学学报》;第28卷(第6期);438-439 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116270880A (zh) | 2023-06-23 |
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