CN100457130C - 一种可供注射给药的精制蒺藜皂苷,其制备方法及注射剂 - Google Patents
一种可供注射给药的精制蒺藜皂苷,其制备方法及注射剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种可供注射给药的精制蒺藜皂苷及其制备方法,取蒺藜总皂苷,加乙醇回流提取,放冷,滤过,加入植物甾醇或胆固醇的乙醇溶液,回流反应,减压回收乙醇,加水,冷藏,滤过,滤液加活性炭,搅拌,热滤,滤液减压浓缩,搅拌下加入丙酮,密闭静置,倾除溶液,残留物在≤80℃减压干燥,粉碎,即得精制蒺藜皂苷。本发明还提供了精制蒺藜皂苷制成冻干粉针剂,消除了蒺藜总皂苷的溶血作用,使之可供静脉点滴给药,更好地满足临床需要,用于防治缺血性心、脑血管疾病。
Description
发明领域
本发明公开一种可供注射给药的精制蒺藜皂苷及其制备方法,同时还提供了应用可供注射给药的精制蒺藜皂苷制成冻干粉针剂,用于防治缺血性心、脑血管疾病,属于中药有效部位成分的提取及应用技术领域。
背景技术
本发明所涉及的蒺藜是指蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的成熟地上部分(以下简称:蒺藜草),蒺藜植物的果实为常用传统中药“蒺藜”。基于蒺藜草与中药材蒺藜(果实)含有极其相似的甾体皂苷类有效成分,本发明者此前自蒺藜草提取甾体皂苷组分制成“心脑舒通”胶囊和片剂,由原洮南市第一制药厂生产,应用于防治胸痹和中风等缺血性心、脑血管疾病。
至今,国内外尚未见有关蒺藜皂苷注射给药制剂的研究报道或产品。
口服蒺藜总皂苷组合物的制造方法,国外报道均系采用有机溶剂提取分离。此前,本发明者曾研制了水提取树脂分离工艺,已纳入发明专利(洮南市第一制药厂,专利公开号CN 1039595A)并应用至今。但蒺藜总皂苷具有显著血溶性,不能直接制备静脉滴注制剂。因此,本发明进行了注射用蒺藜皂苷制剂的研究。
发明内容:
本发明提供了一种可供注射给药的精制蒺藜皂苷及其制剂(注射用蒺藜皂苷冻干粉针),消除了蒺藜总皂苷的溶血作用,使之可供静脉点滴给药,以丰富该类药物的给药途径,更好地满足临床需要,用于防治缺血性心、脑血管疾病。
本发明还公开了一种可供注射给药的精制蒺藜皂苷的制备方法,适用于工业化生产。
本发明还提供了一种由精制蒺藜皂苷制备的注射剂。
本发明的技术解决方案包括以下制备步骤
1、自蒺藜草提取蒺藜总皂苷
取蒺藜草切断,加水行外循环动态浸煮,滤过,减压浓缩,加乙醇沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,通过吸附树脂(D-101或NK)柱净化,净化液减压回收乙醇,浓缩,喷雾干燥,即得。
2、由蒺藜总皂苷制备可供注射用的精制蒺藜皂苷
取步骤1制得的蒺藜总皂苷,加30~50倍乙醇回流提取30~60分钟,放冷,滤过,加入2~6%甾醇(甾醇选自混合植物甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、胆固醇等甾醇)的乙醇溶液,回流反应30~60分钟,减压回收乙醇,加水至投料量的10~20倍,搅匀,冷藏过夜,滤过,滤液加0.3%活性炭,搅拌,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.00~1.10(60℃),再进一步浓缩至相对密度1.18~1.20(60℃)。搅拌下加入2~5倍量丙酮,密闭静置,倾除溶液,残留物在80℃减压干燥,粉碎,即得精制蒺藜皂苷。总皂苷含量不少於80%,其中呋甾皂苷约占90%,按照部颁《中药注射剂安全试验法》的溶血试验方法检验,溶血检查符合规定。
3、注射用蒺藜皂苷粉针剂的制备
取上述精制蒺藜皂苷50g,加0.8~1.5倍右旋糖苷-20或右旋糖苷-40或甘露醇等适宜成型剂,加水至2000ml使溶解,用除菌滤膜滤过,分装,冷冻干燥,密塞,压盖,制成每支含药物50mg的冻干粉针剂。
本发明的积极效果在于:利用蒺藜皂苷组合物制成具有良好稳定性的注射给药剂型,消除了蒺藜总皂苷的溶血作用,可供静脉滴注给药,提高蒺藜总皂苷含量达80%以上,降低有害杂质限量,具有剂型新颖,起效快,生物利用度高等特点,进一步丰富了该类药物的给药途径,更好地适用临床需要。
有关防治缺血性心、脑血管疾病的药效药理试验研究
一,注射用蒺藜皂苷对实验性心肌梗塞犬的影响
1、目的通过结扎犬LAD,观察注射用蒺藜皂苷对∑-ST、N-ST、MIS和心肌三酶的影响。为证明注射用蒺藜皂苷的抗心肌缺血作用,提供药理研究的实验依据。
2、实验材料
(1)、实验动物 健康成年杂种犬,体重12-21kg,雌雄兼用,由白求恩医科大学实验动物部提供。
(2)、实验药品 注射用蒺藜皂苷由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供,批号:990901;血塞通注射液,由云南植物药液有限公司生产,批号:990803-12。
3、实验方法
杂种犬30只,随机分为5组,每组6只,以戊巴比妥30mg/kg iv麻醉。造成心肌梗塞,用多点湿布式吸附法标测EECG,标测点24个,分正常区(对照点),梗塞边缘区和梗塞中心区,股静脉插管以备给药。记录各点EECG,同时自股静脉取血,测AST,CPK和LDH值,作为给药前值,结扎冠状动脉15分钟后,经股静脉给药,对照组给予等容量生理盐水,阳性药物对照组给予血塞通注射液12.52ml/kg,注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg,12.52mg/kg,25mg/kg三个剂量组,记录:给药前、结扎成功后、给药后EECG,以ST段升高总mV数表示∑-ST,以ST段升高>2mV的导联数为N-ST。记录360分后,第二次取血测心肌三酶。最后,取下心脏,称全心重,沿冠状沟剪去大血管根部和心房,称左心室重。将左心室均匀地横断切成5片,置于硝基四氮唑兰(N-BT)染液中,在37℃恒温水浴箱中染色15分钟。用落点求积法(36点/cm2)测量每片心肌双侧梗塞区(N-BT非染色区)与非梗塞区(N-BT染色区),每片心肌称重,计算每片心肌面积,心室总面积和梗塞区的总面积,计算梗塞区与心室及心脏重量百分比。
4、实验结果
(1)、对EECG的影响
对缺血程度的影响(∑-ST)
血塞通注射液对照组对缺血程度(∑-ST),在20-180分钟作用明显(P<0.05),变化百分率在20-210分钟作用明显(P<0.01);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg在45-180分钟作用明显(P<0.05),变化百分率在45分钟作用明显(P<0.05);12.52mg/kg实测值在30-180分钟作用明显(P<0.05);25mg/Kg在20-210分钟作用明显(P<0.01),变化百分率在20-210分钟作用明显(P<0.05)。见表1。
对缺血范围(N-ST)的影响
血塞通注射液对照组对缺血范围(N-ST),变化百分率在20-180分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg变化百分率在30-180分钟作用明显(P<0.05);12.52mg/kg实测值在30-180分钟作用明显(P<0.05);25mg/Kg实测值在30-60分钟作用明显(P<0.05),变化百分率在20-180分钟作用明显(P<0.05)。见表2。
(2)、对MIS的影响
阳性药组,小剂量组,中剂量组,大剂量组均可明显减少梗塞/全心及梗塞/左心面积(P<0.05)。见表3。
(3)、对心肌三酶(AST,CPK,LDH)的影响
血塞通注射液对照组,注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg,25mg/Kg可明显降低血清AST的含量(P<0.01),变化百分率降低明显(P<0.05)。见表4。
血塞通注射液对照组,注射用蒺藜皂苷25mg/Kg变化百分率可明显降低血清CPK的含量(P<0.05)。见表5。
各个剂量组对血清中的LDH的含量,与盐水对照组比较无显著性差异。见表6。
5、结论
本试验采用结扎犬冠状动脉前降支(LAD)造成急性心肌梗塞模型。用心外膜电图(EECG)标测心肌缺血程度(∑-ST)和心肌缺血范围(N-ST);以定量组织学法(N-BT染色法)测定心肌梗塞范围(MIS);股静脉取血测心肌三酶:谷草转氨酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)的变化。实验结果表明,注射用蒺藜皂苷各剂量组,经静脉给药,均可降低∑-ST,减少N-ST,缩小MIS,各组还可降低血清LDH、AST和CPK的含量,与盐水对照组比较有显著性差异。
二、注射用蒺藜皂苷对麻醉开胸犬血流动力学及心肌缺血的影响
1、目的通过观察注射用蒺藜皂苷对麻醉开胸犬血流动力学及心肌耗氧量的影响,探讨其对心血管系统的药理效应,为临床治疗心血管疾病提供理论依据。
2、实验材料
(1)实验动物 健康成年杂种犬,体重12-20kg,雌雄兼用,由白求恩医科大学实验动物部提供。
(2)实验药品 注射用蒺藜皂苷由吉林敖东洮南药业股份有限公司,批号:990901;血塞通注射液,由云南植物药液有限公司生产,批号:990803-12。
3、实验方法
杂种犬30只,分为5组,每组6只。对照组给予等容量生理盐水,阳性药组给予血塞通注射液12.52mg/kg,实验组分为注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg、12.52mg/kg、25mg/kg三个剂量组,均采用静脉滴注。记录给药前及药后1、3、5、10、20、30、45、60、90、120分钟诸指标。于给药前及药后5、20、30、60、120分钟取动脉、静脉血,以血氧仪测定血氧含量。并根据公式,计算二级指标:平均动脉压、心脏指数、心搏指数、左室作功指数、总外周阻力、冠脉阻力、心肌耗氧量、心肌耗氧指数、心肌氧摄取率、心肌血流量等。实验数据实测值和变化百分率值与对照组比较,进行组间t检验分析。
4、实验结果
(1)对心率、血压的影响
注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg给药后逐渐减慢心率,变化百分率在20-90分钟作用显著(P<0.05);其他各组对心率影响不明显,见表7。
注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg给药后逐渐降低血压,变化百分率在10-45分钟作用明显(P<0.01),大剂量组25mg/kg变化百分率在30-45分钟作用有统计学差异(P<0.05),其它各组药物对血压无明显改变。见表8。
(2)对左室内压、左室舒末压及左室作功的影响
注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg对左心室内压变化百分率在10-60作用明显(P<0.05),给药25mg/Kg组,变化百分率在60分钟时作用明显(P<0.05),其他各组无明显作用。见表9。各剂量组对左室舒末压无明显作用。见表10。注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg对左室作功变化百分率在30-45作用明显(P<0.05)。其它各组药物均无明显作用。见表11。
(3)对左室内压最大变化速率和总外周阻力的影响
各剂量组对左室内压最大变化速率均无明显作用。见表12、表13。血塞通注射液对照组变化百分率对总外周阻力在20-60分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg对总外周阻力变化百分率在10-45分钟作用明显(P<0.05)25mg/Kg变化百分率在3-10分钟时作用明显(P<0.05),实测值在5-45分钟作用明显(P<0.05),其他各组无明显作用。见表14。
(4)对心输出量、心肌血流量和冠脉阻力的影响
血塞通注射液对照组对心输出量变化百分率在10-45分钟作用明显(P<0.05)。注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg变化百分率在5-20分钟作用明显(P<0.05);其他各组无明显作用。见表15。
血塞通注射液对照组对心肌血流量变化百分率在5-45分钟作用明显(P<0.05),注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg变化百分率在5-20分钟作用明显(P<0.01);25mg/Kg变化百分率在10-45分钟作用明显(P<0.01);其他各组无明显作用。见表16。
血塞通注射液对照组对冠脉阻力变化百分率在5-45分钟作用明显(P<0.05),实测值对冠脉阻力在20-45分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg变化百分率在5-30分钟作用明显(P<0.01);25mg/Kg变化百分率在3-45分钟作用明显(P<0.01);其他各组无明显作用。见表17。
(5)对心脏指数、心搏指数和心搏出量的影响
血塞通注射液对照组对心脏指数在10-45分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷12.52mg/kg变化百分率在5-20分钟作用明显(P<0.05);其他各组无明显作用。见表18。
血塞通注射液对照组对心搏指数变化百分率在5-60分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg变化百分率在5-20分钟作用明显(P<0.01);12.52mg/kg变化百分率在5-30分钟作用明显(P<0.01);25mg/Kg变化百分率在5-10分钟作用明显(P<0.05);实测值在5-30分钟作用明显(P<0.05)其他各组无明显作用。见表19。
血塞通注射液对照组对心搏出量变化百分率在5-60分钟作用明显(P<0.05阳性药组实测值对心搏出量,在10-90分钟作用明显(P<0.05,P<0.01,P<0.001);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg变化百分率在5-20分钟作用明显(P<0.01);12.52mg/kg变化百分率在5-30分钟作用明显(P<0.01);25mg/Kg变化百分率在5-10分钟作用明显(P<0.05)其他各组无明显作用。见表20。
(6)对心肌耗氧量、心肌耗氧指数及心肌氧摄取率的影响
对心肌耗氧量的作用
血塞通注射液对照组对心肌耗氧量在20-60分钟作用明显(P<0.01);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg变化百分率在5-30分钟作用明显(P<0.01);实测值在30分钟作用明显(P<0.05),12.52mg/kg变化百分率在20-30分钟作用明显(P<0.01);实测值在30-60分钟作用明显(P<0.05),25mg/Kg变化百分率在5-60分钟作用明显(P<0.01),实测值在60分钟作用明显(P<0.05),其他各组无明显作用。见表21。
对心肌耗氧指数的作用
血塞通注射液对照组对心肌耗氧指数变化百分率在60分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg变化百分率在30分钟作用明显(P<0.01);实测值在30分钟作用明显(P<0.05),12.52mg/kg变化百分率在20-30分钟作用明显(P<0.01);25mg/Kg变化百分率在20-30分钟作用明显(P<0.05),其他各组无明显作用。见表22。
对心肌氧摄取率的作用
血塞通注射液对照组对心肌氧摄取率变化百分率在5-60分钟作用明显(P<0.01);实测值在60分钟作用明显(P<0.05);注射用蒺藜皂苷6.26mg/kg变化百分率在5-30分钟作用明显(P<0.01);12.52mg/kg变化百分率在5-30分钟作用明显(P<0.001);25mg/Kg变化百分率在5-60分钟作用明显(P<0.001),实测值在20-60分钟作用明显(P<0.05),其他各组无明显作用。见表23。
5、结论
本实验观察了注射用蒺藜皂苷对正常麻醉开胸犬血流动力学及心肌耗氧量等作用。实验结果表明,注射用蒺藜皂苷可明显增加冠脉血流量、心肌血流量、心脏指数、心搏指数、心输出量和心搏出量。降低血压、冠脉阻力、总外周阻力、减慢心率、减少心肌耗氧量、耗氧指数和氧摄取率。注射用蒺藜皂苷这些作用,与直接扩张冠脉有关、使之冠脉血流量、心肌血流量增加。左室作功降低,可减少心肌能量和氧消耗,使氧摄取率降低。心输出量、心搏指数增多、直接反映心脏泵血功能的提高,可能与外周阻力降低,外周血管扩张有关。提示注射用蒺藜皂苷可改善心血管系统功能,调节心脏供血供氧平衡,对防治心血管疾病,如冠心病、心肌缺血等常见病有重要意义。
三、注射用蒺藜皂苷防治缺血性心、脑血管疾病的其他药效学试验
1、目的通过动物试验,观察注射用蒺藜皂苷对心、脑缺血的保护作用,为临床应用提供实验室依据。
2、试验材料
(1)动物:昆明种小鼠,雌雄兼用,体重18-22g;Wistar大鼠雌雄各半,体重195-318g,251-382g。上述动物由白求恩医科大学实验动物部提供。质量合格证号分别为:医动字第10-5107号,医动字第10-5110号。
(2)药物:注射用蒺藜皂苷,浅黄色塞状块,每一支内含药50mg由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供,批号为990901,用时以生理盐水溶液配成所需浓度,供腹腔或静脉注射给药。试验所用阳性药血塞通由云南植物药业有限公司生产,批号:990201-2;5′-腺苷二磷酸-钠盐(ADP-NA)由中国科学院上海生物化学研究所出品,批号:9507152;盐酸肾上腺素(Adr)注射液由上海禾丰制药有限公司生产,批号:980801;烟酸由青岛鸿雁制药厂出品,批号:980317;胆固醇由上海新兴化工试剂研究所提供,批号:970818;丙基硫氧嘧啶由上海集成药厂生产,批号:20000101;红四氮唑(TTC)购自上海化学试剂总厂,批号970219。
(3)仪器:LBY-S5血栓形成仪由北京普利生精密仪器研究中心制造;LBY-NJ2全自动四通道血小板凝聚仪由普利生集团制造;LBY-N6A自清洗旋转式粘度计由北京普利生出品;XTT立体显微镜由上海勤奋仪器厂产;ES-60J电子分析天平由沈阳龙腾电子称量仪器有限公司;Celeron 333兼容机。
3、试验方法与结果
(1)大鼠大脑中动脉阻断模型的影响取40只大鼠,雌雄各半,体重251-382g。随机分为五组,每组八只,各组给药方式均为腹腔注射:缺血模型组给予同体积生理盐水,阳性对照组给予血塞通20.8mg/kg,给药组分三个剂量分别为:10.4、20.8、31.2mg/kg。连续给药七天,每天一次,末次给药后腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉后,仰卧位固定,在大鼠右外耳道与眼外眦连线中点处垂直切开皮肤约2cm,然后在体视显微镜下沿颞肌中线,依次切断颞肌和咬肌,暴露出颧弓,用咬骨钳除去颧弓,暴露颞前窝,然后在颧骨和鳞状骨前联合的前下方约2mm处钻孔,开一直径约2mm的小颅窗,此时可见一条较直且少分支的小血管,即为大脑中动脉(MCA),以细针挑起,电凝阻断嗅束内1mm至大脑下静脉之间的一段大脑中动脉。然后逐层缝合肌肉和皮肤。单笼饲养。术后30min给药一次。术后24小时观察动物一般行为状态,然后断头取脑,分离去除嗅球,小脑和低位脑干后,保留大脑部位,沿冠状线等分切四刀,切成五片脑组织切片,然后迅速将其置入5ml含有4%TTC及1mol/lK2 HPO40.1ml溶液中,避光条件下,37℃温孵30min,经染色后,正常脑组织呈玫瑰红色,而已梗塞组织呈白色,用透明玻璃纸包裹后,以扫描仪描记标本的肉眼形态学变化,根据图像分析法,计算出梗塞区域面积占大脑半球面积的百分比。
结果可见,蒺藜皂苷低、中、高三个剂量组和血塞通阳性对照组动物与缺血模型组相比,脑梗塞面积显著下降,有明显统计学意义(P<0.05、P<0.01、P<0.01和P<0.01),将TTC染色的脑片置10%福尔马林中固定7天以上,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察镜下病理组织学变化。结果见病理报告。
病理结果表明:模型组大脑皮层神经细胞有较明显的缺血坏死改变表现为细胞体积缩小,呈三角形,尼氏体消失,胞浆红染,胞核浓缩深染,此种改变尤以锥体细胞层及海马回神经元较显著。血塞通给药组大脑皮层、海马回仅见少数神经细胞呈缺血坏死改变。蒺藜皂苷三个剂量给药组均不同程度表现出少量神经细胞呈缺血改变,其病变明显轻于模型组,其中大剂量组最明显。
(2)对血淤模型大鼠血液粘度等的影响
对血液流变学的影响
取40只大鼠,雌雄各半,随机分为五组,每组八只:血淤模型组,血塞通20.8mg/kg阳性对照药组,给药组分为三个剂量分别为:10.4mg/kg,20.8mg/kg,31.2mg/kg,每天腹腔注射给药一次,连续七天,末次给药后,造血淤模型方法是:皮下注射0.1%的Adr0.09ml/kg体重,共两次,间隔四小时,并在此间将大鼠浸入冰水中5min,继之禁食不禁水,次晨动物腹腔注射水合氯醛350mg/kg麻醉,腹主动脉取血,置血液血浆粘度计上测定全血比粘度(高切值、中切值、低切值),血浆比粘度。
可见蒺藜皂苷中、高剂量组和血塞通阳性对照组可明显抑制血液流变学的异常变化,降低全血粘度(P<0.01、P<0.01和P<0.05),高剂量组也可降低血浆粘度(P<0.05)。其他各组有降低血浆粘度的趋势,但无明显统计学意义。
对血淤大鼠血小板聚集率的影响
按(1)分组及试验方法,腹主动脉采血2.7ml/只,缓慢混匀,离心,分离PRP(富血小板血浆)、PPP(贫血小板血浆),按文献方法测定ADP诱导的血小板最大聚集率。
结果可见,注射用蒺藜皂苷和血塞通可明显抑制血小板聚集,其聚集率与血淤模型组比较明显降低(P<0.05)。
对血淤大鼠凝血时间的影响
取40只大鼠,雌雄各半,随机分为五组:血淤模型组,血塞通20.8mg/kg剂量给药组,药物10.4mg/kg,20.8mg/kg,31.2mg/kg三个剂量给药组,每天腹腔注射一次,连续给药七天,同上述方法造血淤模型,处置后停食,次晨将动物麻醉,腹主动脉取血,以玻片法观察动物的凝血时间。
结果可见,注射用蒺藜皂苷中、高剂量组和血塞通阳性对照组均可延长血淤动物的凝血时间,与血淤模型组相比有明显统计学意义(P<0.05)。
(3)注射用蒺藜皂苷抗血栓作用
注射用蒺藜皂苷对大鼠体内抗血栓形成的影响
取50只大鼠,雌雄各半,随机分为五组,每组十只,各组给药方式均为腹腔注射。溶媒对照组,给予等体积药用生理盐水;阳性对照组给予血塞通20.8mg/kg体重;蒺藜皂苷给药组分三个剂量,分别为:10.4mg/kg、20.8mg/kg、31.2mg/kg,每天给药一次,连续七天,末次给药10min,动物腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉,仰卧位固定并分离出右侧颈总动脉和左侧颈外静脉,在聚乙烯管的中段放入一根长5cm的4号手术丝线。将肝素生理盐水溶液(50u/ml)充满聚乙烯管腔。当管的一端插入左颈外静脉后,另一端准确地注入肝素(50u/kg)抗凝,然后再插入右颈总动脉。血液从右侧颈总动脉流至聚乙烯管内,再返流入左颈外静脉,15min后阻断血流,迅速取出丝线称重,总重量减去线重量即得血栓湿重。
结果可见,血塞通和蒺藜皂苷高、中二个剂量组均可抑制血栓形成,血栓重量与溶媒对照组比较明显降低,(P<0.01、P<0.01和P<0.05);低剂量组也有降低血栓重量的趋势,但无统计学意义。
注射用蒺藜皂苷对体内血栓形成时间的影响
取雄性大鼠40只,体重250~300g,随机分为五组:溶媒对照组,血塞通20.8mg/kg阳性对照组,给药组分为三个剂量分别为:10.4、20.8、31.2mg/kg。每天腹腔注射给药一次,连续七天,于末次给药后30min,测定体内血栓形成时间,腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉。麻醉后,固定于大鼠固定台上,切开颈部皮肤,分离右侧颈总动脉约15mm,将实验性体内血栓形成测定仪的刺激电极及温度传感器探头置于动脉上,用2mA电流刺激血管7min以损伤动脉内皮细胞,当动脉管腔内血栓形成阻断血流,仪器报鸣,此时仪器显示血栓形成时间(OT值)。
结果可见,与溶媒对照组比较,蒺藜皂苷中、高二个剂量组和血塞通阳性对照组均能明显延长血栓形成时间(P<0.05),对大鼠体内血栓形成有显著的抑制作用。低剂量组能延长血栓形成时间,但无统计学意义。
注射用蒺藜皂苷对体外血栓形成的影响
取40只大鼠,同上述方法分组及给药,末次给药后30min,腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉,由下腔静脉取血1.8ml注入硅化胶管中,将胶管两端口对齐形成环状,用硅胶套管固定,装到体外血栓仪上,旋转15min停机,取出血栓,测量血栓长度。用滤纸将血栓水分吸净,称重,得到血栓湿重。将血栓放入烤箱,64℃烤20min,再称其重量,即为血栓干重。
可见,蒺藜皂苷中、高剂量组和血塞通阳性对照均能明显抑制体外血栓形成,缩短血栓长度,降低其干重和湿重,与溶媒对照组比较均有显著差异(P<0.05)。
有关毒性與安全性试验
可供注射用蒺藜皂苷组合物的小鼠静脉注射LD50为402.6mg/kg,腹腔注射给药的LD50为736.7。应用大鼠和犬二种动物,依次行腹腔注射和静脉滴注,连续给药八周。结果示出,相应推荐的临床给药剂量均未见毒性反应。动物安全性试验未见过敏反应、溶血反应及血管刺激性。
附表1-23
表1.注射用蒺藜皂苷对心肌梗塞犬缺血程度的影响(∑-ST,Mv)(X±s,n=5)
续表1.
续表1.
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001
表2.注射用蒺藜皂苷对心肌梗塞犬缺血范围的影响(N-ST,点)(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表3.注射用蒺藜皂苷对心肌梗塞犬心肌梗塞面积的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表4.注射用蒺藜皂苷对心肌梗塞犬血清中AST(U/L)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表5.注射用蒺藜皂苷对心肌梗塞犬血清中CK(U/L)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表6.注射用蒺藜皂苷对心肌梗塞犬血清中LDH(U/L)的影响(X±s,n=5)
表7 注射用蒺藜皂苷对心率(次/min)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表8 注射用蒺藜皂苷对血压(KPa)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表9 注射用蒺藜皂苷对左心室内压(KPa)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表10 注射用蒺藜皂苷对左室舒张期末压(KPa)的影响(X±s,n=5)
表11 注射用蒺藜皂苷对左室作功(kg。m/min/m2)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05
表12 注射用蒺藜皂苷对+dp/dt(Kpa/S)的影响(X±s,n=5)
表13 注射用蒺藜皂苷对-dp/dt(KPa/S)的影响(X±s,n=5)
表14 注射用蒺藜皂苷对总外周阻力(Kpa/L。min)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表15 注射用蒺藜皂苷对心输出量(L/min)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05
表16.注射用蒺藜皂苷对心肌血流量(ml/100g。min)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表17 注射用蒺藜皂苷对冠脉阻力(Kpa。min)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001
表18 注射用蒺藜皂苷对心脏指数(L/min/m2)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05
表19 注射用蒺藜皂苷对心搏指数(ml/m2/beat)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001
表20.注射用蒺藜皂苷对心搏出量(ml/beat)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001
表21.注射用蒺藜皂苷对麻醉犬心肌耗氧量(ml/100g/min)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表22.注射用蒺藜皂苷对麻醉犬心肌耗氧指数(次/min.KPa)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01
表23.注射用蒺藜皂苷对麻醉犬心肌氧摄取率(%)的影响(X±s,n=5)
与盐水组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001
具体实施方式:
通过以下实施例进一步举例描述本发明,并不以任何方式限制本发明,在不背离本发明的技术解决方案的前提下,对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
取蒺藜总皂苷2.5g,加乙醇90ml,回流提取40分钟,滤过,滤液加β—谷甾醇饱和乙醇溶液6.25ml,回流反应40分钟,回收乙醇,加水至25ml,搅匀,于约4℃静置8小时,滤过,滤液加热至近沸,加活性炭0.1g,密闭维持25分钟,滤过,浓缩至约2.5g,搅拌下加丙酮7.5ml,静置,倾除上清液,残留物挥去丙酮,80℃减压干燥2小时。研匀,得淡黄色粉末1.02g,蒺藜总皂苷含量81.2%,呋甾皂苷含量72.4%,根据《部颁中药注射剂安全试验的溶血试验检验方法》溶血检查符合规定。
实施例2
取蒺藜总皂苷2.5g,加乙醇100ml,回流提取30分钟,滤过,滤液加豆甾醇饱和乙醇溶液10ml,回流反应40分钟,回收乙醇,加水至37.5ml,搅匀,于约4℃静置10小时,过滤,滤液加热至近沸,加活性炭0.1g,密闭维持25分钟,滤过,浓缩至约2.5g,搅拌下加丙酮7.5ml,静置,倾除上清液,残留物挥去丙酮,80℃减压干燥2小时。研匀,得淡黄色粉末0.98g,蒺藜总皂苷含量80.8%,呋甾皂苷含量73.2%,溶血检查符合规定。
实施例3
取蒺藜总皂苷2.5g,加乙醇120ml,回流提取30分钟,滤过,滤液加混合植物甾醇饱和乙醇溶液7.5ml,回流反应50分钟,回收乙醇,加水至30ml,搅匀,于约4℃静置6小时,滤过,滤液加热至近沸,加活性炭0.1g,密闭维持25分钟,滤过,浓缩至约2.5g,搅拌下加丙酮7.5ml,静置,倾除上清液,残留物挥去丙酮,80℃减压干燥2小时。研匀,得淡黄色粉末0.91g,蒺藜总皂苷含量82.5%,呋甾皂苷含量71.8%,溶血检查符合规定。
实施例4
取蒺藜总皂苷2.5g,加乙醇90ml,回流提取45分钟,滤过,滤液加胆固醇饱和乙醇溶液8ml,回流反应60分钟,回收乙醇,加水至27.5ml,搅匀,于约4℃静置8小时,滤过,滤液加热至近沸,加活性炭0.1g,密闭维持25分钟,滤过,浓缩至约2.5g,搅拌下加丙酮7.5ml,静置,倾除上清液,残留物挥去丙酮,80℃减压干燥2小时。研匀,得淡黄色粉末1.08g,蒺藜总皂苷含量82.0%,呋甾皂苷含量71.8%,溶血检查符合规定。
实施例5
取精制蒺藜皂苷50g,右旋糖苷-20 60g,加水至2000ml使溶解,用除菌滤膜减压滤过,滤液无菌分装,每支灌装2ml,冷冻干燥,密塞,压盖,即得。内容物为浅黄色塞形片状,质地均匀,成型良好。
其它项目符合中华人民共和国药典2000版冻干粉针剂项目有关要求。
实施例6
取精制蒺藜皂苷50g,右旋糖苷-40 50g,加水至2000ml使溶解,用除菌滤膜减压滤过,滤液无菌分装,每支灌装2ml,冷冻干燥,密塞,压盖,即得。内容物为浅黄色塞形片状,质地均匀,成型良好。
其它项目符合中华人民共和国药典2000版冻干粉针剂项目有关要求。
实施例7
取精制蒺藜皂苷50g,甘露醇65g,加水至2000ml使溶解,用除菌滤膜减压滤过,滤液无菌分装,每支灌装2ml,冷冻干燥,密塞,压盖,即得。内容物为浅黄色塞形片状,质地均匀,成型良好。
其它项目符合中华人民共和国药典2000版冻干粉针剂项目有关要求。
Claims (3)
1、一种供静脉滴注给药的精制蒺藜皂苷,其特征在于:
将蒺藜草切断,加水行外循环动态浸煮,滤过,减压浓缩,加乙醇沉淀,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,通过吸附树脂D101或NK柱净化,净化液减压回收乙醇,浓缩,喷雾干燥,得蒺藜总皂苷;
取蒺藜总皂苷,加30~50倍乙醇回流提取30~60分钟,放冷,滤过,加入2~6%甾醇的乙醇溶液,回流反应30~60分钟,减压回收乙醇,加水至投料量的10~20倍,搅匀,冷藏过夜,滤过,滤液加活性炭,搅拌,滤过,滤液减压浓缩至60℃测定的相对密度1.00~1.10,再进一步浓缩至60℃时测定的相对密度1.18~1.20,搅拌下加入2~5倍量丙酮,密闭静置,倾除溶液,残留物减压干燥,粉碎,即得精制蒺藜皂苷;
甾醇选自混合植物甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、胆固醇。
2、根据权利要求1所述精制蒺藜皂苷的制备方法,包括以下步骤:
取蒺藜总皂苷,加30~50倍乙醇回流提取30~60分钟,放冷,滤过,加入2~6%甾醇的乙醇溶液,回流反应30~60分钟,减压回收乙醇,加水至投料量的10~20倍,搅匀,冷藏过夜,滤过,滤液加活性炭,搅拌,滤过,滤液减压浓缩至60℃测定的相对密度1.00~1.10,再进一步浓缩至60℃时测定的相对密度1.18~1.20,搅拌下加入2~5倍量丙酮,密闭静置,倾除溶液,残留物减压干燥,粉碎,即得精制蒺藜皂苷;
甾醇选自混合植物甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、胆固醇。
3、权利要求1所述精制蒺藜皂苷制成的注射用蒺藜皂苷无菌粉末型制剂,是通过以下工艺制得:取精制蒺藜皂苷50g,加0.8~1.5倍赋形剂,加水至2000ml使溶解,用除菌滤膜减压滤过,滤液无菌分装,冷冻干燥,密塞,压盖,即得;
所述的赋形剂选自:右旋糖苷-20、右旋糖苷-40或甘露醇中的一种。
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