CN103989941A - 一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物组合物及其制备方法和用途。针对目前缺血性脑血管病的化学治疗药物肝毒性较大，本发明提供一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物组合物，其由如下原料制备而成：木通15份、党参6份、石榴皮10份、文冠果壳10份、浙贝母10份、黄精20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、防己15份、牛蒡子7份、葛根10份、甘草10份。该药物组合物可促进缺血性脑卒中后神经再生，从而用于治疗或预防脑缺血或脑梗死。

Description

一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

   本发明涉及一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物组合物，属于医药领域。 

背景技术

缺血性脑血管病（ICVD）约占全部脑血管病的80%，具有发病率、致残率、治病率高的特点，已经成为严重胃寒人类健康的疾病之一。缺血性脑血管病是脑血管病中最主要的病种之一，是局部血液循环所提供的氧及其他营养物质与神经元代谢需求之间的骤然供需不平衡，最终导致缺血中央区的神经元受损的一类疾病。短暂性脑缺血发作简称TIA，也称一过性脑缺血发作或小中风，它是由于负责供应脑部血液的动脉血管短时间内供血不足，引起相应动脉负责供血的脑组织发生暂时性功能障碍。此病的主要临床症状常常表现为突然发作的头晕、眼花、眩晕、耳鸣、走路不稳，严重时意识模糊、双目失明或复视、单侧或双侧肢体无力与感觉异常、莫名其妙地摔倒、说话不流利等。能够引发短暂性脑缺血发作的原因颇多，诸如高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病是最主要和最常见的原因，而过度用脑，情绪激动，寒冷，劳累则可促其发生。 

　  短暂性脑缺血发作每次犯病的时间持续不久，通常是数秒钟、数分钟或数小时不等，最长不超过24小时，因此容易被人忽视。实际上，短暂性脑缺血是脑血管病的先兆或危险信号，如不及时治疗极易恶化发展成为严重脑血管病从而威胁病人生命。据统计，约有25%～40%短暂性脑缺血患者在5年内将产生严重的脑梗塞。因此，对短暂性脑缺血发作应当进行积极治疗，降低血液粘稠度，调整血液的高凝状态，控制和维持血压在正常范围内，终止和减少短暂性脑缺血发作，预防或推迟脑梗塞的发生。 

脑梗塞是由于脑动脉粥样硬化，血管内膜损伤使脑动脉管腔狭窄，进而因多种因素使局部血栓形成，使动脉狭窄加重或完全闭塞，导致脑组织缺血、缺氧、坏死，引起神经功能障碍的一种脑血管病。脑缺血和脑梗塞具有十分密切的联系，能够实现对脑缺血的治疗就会进一步延缓或者预防脑梗塞的发生和发展。 

脑保护药物是目前神经学界研究的热点,各种药物处于不同研究阶段,但目前还没有一种药物可以对大脑保护取得公认的确切疗效。目前医学上对于脑缺血或脑梗塞的治疗尚没有特效药物，一般临床上建议是控制血压,清淡饮食,并可以服用扩血管药和活血化淤的药或者营养脑细胞的药物改善。但临床实践表明，上述药物的治疗效果并不能令人满意，而这些药物高昂的花费通常让患者苦不堪言。 

中医药在用于缺血性脑卒中后神经再生方面积累大量的中医理论和临床实践。中医认为，缺血性脑血管病是脑血管意外之一，属于中医的“中风病”，“中风病”为“风、痨、臌、胀”四大难症之首，是仅次于心血管疾病与癌症而位居第三位的威胁人类生命的疾病，老年人易发，并有逐渐年轻化的趋势。缺血型中风病发作前绝大多数病人有先兆，中医称“中风先兆”。病人多有高血脂、高血糖、高粘血症、颈椎病等。主要病理变化是在脑动脉硬化、高脂血症、高粘血症的基础上，血流粘稠而缓慢，或者加上其它因素压迫脑血管，由粘、缓、窄的共同作用，使血管内形成小血栓或血管壁形成了附壁血栓，部分阻塞或者暂短的阻塞了脑血流，造成脑组织的短时缺血、缺氧，病人表现为一过性的头晕目眩、口角流涎、手臂麻木、下肢发软等症状。在“中风先兆”期及时进行防治，可预防中风病发生或者减轻患者的中风病症状，从而降低发病率、致残率及死亡率。传统医药治疗脑梗塞在昔日曾挽救了不少患者的生命，随着西方医学的发展，尽管传统医药倍受冷遇，但一些单方和提纯制剂目前仍广泛应用于临床，如丹参、银杏、川芎、葛根、灯盏花等中药制剂。中华医学会神经病学分会于1998年建议活血化淤的中药可用于急性缺血性脑卒中的治疗，但需要更多高质量的证据应证。目前国外指南中尚无有关中医中药治疗缺血性脑卒中的建议。 

发明内容

针对目前医学实践中缺少脑缺血或脑梗塞显效治疗药物、且药物价格高昂的现有技术不足，本发明提供一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物。该药物以药物组合物为主要活性成分，其用于缺血性脑卒中后神经再生时，疗效显著，成本低廉，具有良好的医学应用前景。 

针对目前缺血性脑血管病临床治疗药物的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于缺血性脑卒中后神经再生的药物组合物，该药物组合物在治疗急性缺血性脑血管病、慢性缺血性脑血管病以及过敏性缺血性脑血管病方面具有很好的治疗效果。本发明所述的药物组合物，按照重量组分计，包括如下组分：木通15份、党参6份、石榴皮10份、文冠果壳10份、浙贝母10份、黄精20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、防己15份、牛蒡子7份、葛根10份、甘草10份。 

作为中药方剂，上述药物组合物的配方可具体为：木通15克、党参6克、石榴皮10克、文冠果壳10克、浙贝母10克、黄精20克，丹参20克、肿节风10克、川芎5克、青葙子8克、防己15克、牛蒡子7克、葛根10克、甘草10克。 

另外，本发明的药物组合物所采用的原料中，木通选择木通科植物白木通或三叶木通的干燥木质茎；石榴皮选择石榴科植物石榴Punica granatum L. 的干燥果皮；文冠果壳选择无患子科文官果属植物文冠果Xanthoceras sorbifolia Bunge的干燥果壳；肿节风选择金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra （Thunb.）Nakai的干燥全株；青葙子选择苋科植物青葙Celosia argentea L. 的干燥成熟种子；防己选择防己科植物粉防己Stephania tetrandra S. Moore的干燥根；其他药材按照中国药典的来源选取中药材。 

制备本发明药物组合物的方法如下：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的5-15倍的水，浸泡10-60分钟，煎煮1-4次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.05-1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为60-90%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇，浓缩，即得。本发明上述药物组合物可以进一步制备成临床上常用的药物制剂，优选为合剂、片剂、胶囊剂。 

本发明实施例7药物组合物对脑缺血模型大鼠海马一氧化氮和一氧化氮合酶的影响实验中，药物组合物各治疗组的NO和NOS水平均极显著低于模型组的NO和NOS水平，且明显低于阳性对照药尼莫地平治疗组的NO和NOS水平，提示药物组合物可以显著降低大鼠海马中的过氧化物，对大脑海马神经元具有明显的保护作用。本发明实施例8中药物组合物对脑缺血及其引发的脑梗塞治疗结果显示，药物组合物不仅可以显著降低大鼠脑缺血模型的血清MDA含量，减少自由基对大鼠脑的损伤，而且可以减小脑缺血大鼠的脑梗塞面积，可见药物组合物对缺血性脑损伤疾病特别是脑缺血以及脑缺血引发的脑梗塞具有显著的治疗效果，且这种治疗效果具有剂量依赖性。各给药组大鼠的海马锥体细胞的显微镜下照片显示模型组大鼠海马锥体细胞细胞核皱缩，染色深，细胞碎片多，应用药物组合物治疗后药物组合物组对脑缺血后损伤的神经元具有保护作用，其中中药高剂量组的神经元细胞的细胞形态和数量与模型组具有十分显著的差异。本发明实施例8发现应用本发明药物组合物干预7 d 后, 其缺血BrdU+ 阳性细胞明显增加, 说明可促进内源性神经干细胞的激活、分化、增殖, 有利于缺血性损伤的神经细胞修复。该实施例还证实,本发明药物组合物能够激活内源性神经干细胞, 增加缺血区新生血管, 改善缺血区脑供血, 促进神经功能恢复。具体如下：与缺血性脑卒中组相比，阳性药物和本发明药物组合物均可以显著升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量，其中本发明药物组合物在升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量方面与阳性药物组相比具有显著性或极限著性的差异，本发明药物组合物对于神经干细胞的再生和脑微血管的生成体现出明显的剂量依赖性。 

因此，本发明请求保护药物组合物用于用于缺血性脑卒中后神经再生的用途，由于现代动物福利的提高和饮食的复杂性，动物患脑血管疾病机率也明显增加。本发明所述的用途治疗对象可以为人或者动物，所述动物优选为哺乳动物。本发明所述的药物用途中，药物组合物用于缺血性脑卒中后神经再生时可以根据病情和药物性质选择合适的给药途径，优选为口服给药，用于治疗或预防脑缺血或脑梗塞的给药剂型可以为本发明上述所述的药物制剂，如合剂、片剂、胶囊剂。 

本发明所述的药物组合物用于缺血性脑卒中后神经再生时具有以下优势： 

（1）本发明药物组合物对脑缺血或脑梗塞治疗和预防效果确切，不仅可以为脑缺血或脑梗塞的治疗提供一种新的用药选择，而且其治疗效果优于阳性药物尼莫地平，适宜推广使用。

（2）本发明药物组合物可促进内源性神经干细胞的激活、分化、增殖, 有利于缺血性损伤的神经细胞修复。另外，本发明药物组合物能够激活内源性神经干细胞, 增加缺血区新生血管, 改善缺血区脑供血, 促进神经功能恢复。 

（3）本发明所述药物组合物起效剂量低，并可以制备成不同的给药剂型和给药剂量，可以根据患者疾病的严重程度选用合适的给药方案，从而可以大大提高患者的用药依从性，提高药物使用的长期效果。 

  

具体实施方式

    以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明所述的药物组合物进行适当改进、替换功效相同的组分，对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围之内。 

实施例1 中药合剂的制备

处方：木通15克、党参6克、石榴皮10克、文冠果壳10克、浙贝母10克、黄精20克，丹参20克、肿节风10克、川芎5克、青葙子8克、防己15克、牛蒡子7克、葛根10克、甘草10克。

制备方法：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的5倍的水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.1的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为75%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇浓缩，加水至1000ml，搅匀，分装，流通蒸汽灭菌35min，即得合剂。 

实施例2  中药片剂的制备

处方：木通150克、党参60克、石榴皮100克、文冠果壳100克、浙贝母100克、黄精200克，丹参200克、肿节风100克、川芎50克、青葙子80克、防己150克、牛蒡子70克、葛根100克、甘草100克。

制备方法：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的10倍的水，浸泡60分钟，煎煮1次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为80%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇，浓缩，真空干燥、制粒，压片即得。 

实施例3  中药细粉的制备

处方：木通1.5kg、党参0.6kg、石榴皮1.0kg、文冠果壳1.0kg、浙贝母1.0kg、黄精2.0kg，丹参2.0kg、肿节风1.0kg、川芎0.5kg、青葙子0.8kg、防己1.5kg、牛蒡子0.7kg、葛根1.0kg、甘草1.0kg。

制备方法：取上述重量组分的各药材，加药材总重量的8倍的水，浸泡45分钟，煎煮4次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.2的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为90%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇，浓缩，真空干燥后粉碎即可得到中药提取物细粉，用于下述实施例4-9中片剂、胶囊剂的制备，以及用于动物试验。 

实施例4 中药片剂的制备

    中药细粉             50g

    淀粉                 25g

    糊精                 35g

    低取代羟丙基纤维素   5g

    60%乙醇              适量

    硬脂酸镁             1g

   制备工艺：称取处方量的中药细粉、淀粉、糊精和低取代羟丙基纤维素混合均匀。另取适宜量的60%乙醇，加入于混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。

实施例5 中药片剂的制备

       中药细粉      25g

       微晶纤维素    180g

       羟丙基纤维素  15g

       8%淀粉浆      适量

       硬脂酸镁      1.5g

   制备工艺：称取处方量的中药细粉、微晶纤维素和羟丙基纤维素混合均匀。另取适宜量的8%淀粉浆溶液，加入混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。

实施例6 中药胶囊剂的制备

    中药细粉             25g

    可压性淀粉           40g

    乳糖                 30g

    低取代羟丙基纤维素   5g

    60%乙醇              适量

   制备工艺：将处方中的各辅料过100目筛，称取中药细粉与可压性淀粉、乳糖和低取代羟丙基纤维素混合均匀后，加入60%乙醇溶液制软材，18目筛制颗粒，于60℃干燥，16目筛整粒，装填胶囊，即得。

实施例7 中药对脑缺血模型大鼠海马一氧化氮和一氧化氮合酶的影响

本试验中发明人采用尼莫地平作为阳性对照药物，它是一种Ca²⁺通道阻滞剂，通过有效地阻止Ca2+进入细胞内、抑制平滑肌收缩，达到解除血管痉挛之目的。

SPF级健康雄性SD大鼠50只，体重250～300g。造模6周后，大鼠随机分为5组，正常对照组、模型组、尼莫地平组、中药高剂量组(高剂量组)和中药低剂量组(低剂量组)，每组10只。造模后第7周正常对照组和模型组大鼠分别给予等体积的溶媒灌胃，尼莫地平组大鼠给予30mg/(kg·d)，中药高剂量组大鼠给药剂量100mg/(kg·d)，中药中剂量组给药剂量50 mg/(kg·d)，中药低剂量组大鼠给药剂量为10mg/(kg·d)，连续给药3周。 

中药样品按实施例3制备工艺制备，处方为：木通15份、党参6份、石榴皮10份、文冠果壳10份、浙贝母10份、黄精20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、防己15份、牛蒡子7份、葛根10份、甘草10份。 

尼莫地平：购自山西亚宝药业集团股份有限公司，批号90602； 

NO、NOS试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号20091210；

一抗nNOS、iNOS、eNOS和t3肌动蛋白抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号s-0156R；羊抗兔Ig-G：北京鼎国生物技术有限公司，批号0090915。

脑缺血大鼠模型的制备：大鼠术前禁食12 h、禁水4 h，用10％水合氯醛(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧固定于木制手术台上。颈前部备皮，酒精、碘酒消毒后，沿腹侧颈正中切开，依次钝性分离皮下脂肪、胸骨舌骨肌和胸锁乳头肌，再分别分离暴露左、右侧颈总动脉及气管，于近心端和远心端双重结扎后从中间剪断，然后逐层缝合肌肉、皮肤。正常对照组大鼠同法行颈前皮肤切开，分离皮下脂肪。 

造模后第10周，各组大鼠断头取脑，去除嗅球、小脑，取出大脑海马称重，加入9倍冷生理盐水，电动匀浆机研磨，制成10％匀浆液，3000 r/min，离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书测定NO含量和NOS活性。 

各组大鼠新鲜脑组织海马抽提蛋白后取等量的蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭30 min，nNOS、iNOS、eNOS和t3肌动蛋白一抗500倍稀释于封闭液中，4℃反应过夜后室温孵育2 h。充分漂洗后辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG 1500倍稀释于封闭液中，室温孵育1 h。将膜置于DAB显色液中，显影、定影、曝光。利用Quantity one软件分析条带的灰度值。 

    （1）各组大鼠海马NO含量和NOS活性的比较 

如表1所示，与正常对照组比较，模型组大鼠海马NO含量和NOS活性明显升高（P<0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和中药各剂量组大鼠海马NO含量和NOS活性明显降低(P<0.05)；与阳性对照药尼莫地平相比，中药各剂量组大鼠海马NO含量和NOS活性均显著降低(P<0.05)，其中中药高剂量组与尼莫地平治疗组相比具有极显著差异（P<0.01）。

                表1 各给药组大鼠海马NO含量和NOS活性比较 

组别	样本量（n）	NO（μmol/g）	NOS（U/mg）
				正常对照组	10	2.42±0.98	1.25±0.34
模型组	10	5.68±0.89**	3.54±0.42**
				尼莫地平组	10	4.78±1.02￥	2.58±0.51￥
中药高剂量组	10	2.65±0.85￥￥##	1.56±0.40￥￥##
				中药中剂量组	10	3.05±0.74￥￥#	1.86±0.46￥￥#
中药低剂量组	10	3.24±0.94￥￥#	2.14±0.43￥￥#

        与正常对照组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^￥P＜0.05，^￥￥P＜0.01；

与尼莫地平组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

    （2）各组大鼠海马3种NOS亚型表达的比较 

与表2所示，与正常对照组比较，模型组大鼠海马nNOS和iNOS表达明显升高，eNOS表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和高剂最组大鼠海马nNOS和iNOS表达明显降低，eNOS表达明显升高(P<0.05)；与阳性对照药尼莫地平相比，中药各剂量组大鼠海马nNOS和iNOS表达明显降低，eNOS表达明显升高 (P<0.05)，其中中药高剂量组与尼莫地平治疗组相比具有极显著差异（P<0.01）。

表2 各给药组大鼠海马NOS 3种亚型表达的比较 

组别	样本量（n）	nNOS（mol/g）	iNOS（U/mg）	eNOS
					正常对照组	10	0.42±0.14	1.05±0.34	1.85±0.27
模型组	10	1.35±0.34**	3.24±0.41**	0.95±0.36**
					尼莫地平组	10	0.89±0.22￥	2.38±0.51￥	1.16±0.31￥
中药高剂量组	10	0.55±0.15￥￥##	1.56±0.40￥￥##	1.65±0.18￥￥##
					中药中剂量组	10	0.62±0.27￥￥#	1.86±0.46￥￥#	1.48±0.15￥￥#
中药低剂量组	10	0.75±0.24￥#	2.14±0.43￥#	1.34±0.24￥#

与正常对照组相比，^**P＜0.01；与模型组相比，^￥P＜0.05，^￥￥P＜0.01；

与尼莫地平组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

实施例8 中药对脑缺血及其引发的脑梗塞的治疗作用

1.实验材料

本实验中所采用的实验动物为雄性SD大鼠，体重为250—300g，室温下12h昼夜节律下饲养,自由饮食。本实验中的供试品中药的制备方法及处方同实施例7；对照品为纯水。

本实验使用的相关材料及试剂如下：MDA试剂盒（购自上海史瑞可生物科技有限公司） ，20%水合氯醛、碘伏、焦油紫、双氧水、酒精、二甲苯、4%多聚甲醛 、生理盐水均为实验室常用试剂。本实验主要仪器与设备：大鼠头部固定器、电凝器、721型可见分光光度计、病理组织漂烘处理仪、石蜡切片机、显微镜数码相机均为药理实验室常用仪器。 

．实验方法

2.1 动物分组：将实验动物随机分为4组：模型组，假手术组，中药高剂量组（100 mg/kg），中药低剂量组（10 mg/kg），每组10只。

2.2 大鼠脑缺血模型的建立：实验动物以20%水合氯醛（300-350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第二天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，缺血15分钟后放开动脉夹再灌。缺血时保持其直肠温度在36.5-37.5℃之间。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。大鼠脑缺血模型鉴定标准如下：缺血前大鼠处于完全清醒状态，其生命体征正常。缺血后30-60秒内大鼠即失去知觉和活动能力，翻正反射消失，呈现角弓反张，同时痛觉消失，双侧瞳孔散大，对强光刺激闭睑反射消失,眼球颜色灰白（正常为鲜红色）。假手术组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。本实验中采用该方法制备的大鼠脑缺血模型造模成功率达94.5%。 

2.3 给药途径与时间：中药高剂量组（100 mg/kg）和低剂量组（10 mg/kg）均在缺血/再灌后第8小时按指定的剂量给药一次，首次给药16小时后以相同剂量再次给药。假手术组和模型组给予相同体积的蒸馏水，给药方案同药物组合物给药组。 

、实验观察及指标测定

3.1 血清MDA含量测定：药物组合物组和模型组最后1次给药8h后处死大鼠，快速心腔内取血，离心取血清，-20℃冻存；采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定；操作方法严格按说明书进行。

3.2 脑梗死体积测量：经TTC染色的脑片，用数码相机拍照,应用高清晰度彩色病理图文报告分析系统测出各区脑梗死面积。根据公式：梗死体积=［左侧半球体积-（右侧半球体积-苍白区体积）］/全脑体积，算出梗死体积百分比。 

3.3 组织学方法：大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后，开左胸暴露心脏，将针头自心尖穿过左心室插入主动脉，先用38℃左右生理盐水约100ml快速灌洗，然后复灌入冰冷的4%的多聚甲醛250－300ml，30分钟内灌完，灌注后的大鼠断头取脑将其直接用4%的多聚甲醛后固定12小时左右。流水冲洗，冲洗时间同固定时间。然后70%（4h）、80% (4h)、90%(4-12h)、95%(2h×2次)、100%(2h×2次)梯度酒精脱水，二甲苯透明（1.5h）、60℃浸蜡（1h×3次）。取出包埋，4℃保存。石蜡切片机切片，厚5mm。45℃温水中贴片于明胶处理过的载玻片上，40℃烘烤过夜。切片经三次二甲苯脱蜡，100%、90%、70%梯度酒精浸水，0.1%焦油紫（Cresyl violet）染色10-20分钟, 按常规方法70%、80%、95%、100%梯度酒精分色，光镜下观察神经元紫色而背景基本无色为止。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片后，光镜观察。在高倍镜下观察神经元细胞的存活与凋亡。有清楚的细胞核，胞体着色良好的计为成活神经元细胞；核皱缩，不成形的为凋亡的神经元细胞。 

实验结果

4.1 血清MDA含量测定结果：如表3所示，模型组MDA含量显著高于假手术组，表明脑缺血造模前后MDA含量具有显著差异。不论是中药高剂量组还是中药低剂量组，其血清MDA含量均与模型组MDA含量存在显著性差异（P<0.05），其中中药高剂量组与模型组存在极显著性差异（P<0.01）。

4.2 脑梗死体积测量结果：如表3所示，假手术组无脑梗死。药物组合物治疗组的脑梗死体积与模型组脑梗死体积相比具有显著性差异（P<0.05），其中中药高剂量组与模型组相比具有极显著性差异（P<0.01）。 

表3 大鼠各给药组间血清MDA含量和脑梗死体积比较 

组别	血清MDA含量	脑梗死体积
			假手术组	2.54±0.28	——
模型组	8.10±0.62	17.96±2.30
			中药高剂量组	4.86±0.60**	14.57±1.91**
中药低剂量组	5.45±0.43*	15.69±2.27*

与模型组比较，^*P<0.05；与模型组比较，^**P<0.01。

本实验的实验结果显示，药物组合物不仅可以显著降低大鼠脑缺血模型的血清MDA含量，减少自由基对大鼠脑的损伤，而且可以减小脑缺血大鼠的脑梗塞面积，可见药物组合物对缺血性脑损伤疾病特别是脑缺血以及脑缺血引发的脑梗塞具有显著的治疗效果，且这种治疗效果具有剂量依赖性。 

实施例 9 本发明药物组合物对对神经干细胞再生和微血管生成的影响

    随机选取40只wista大鼠,体重为200-250g， 用20% 乌拉坦腹腔麻醉仰卧固定, 做颈部正中切口, 分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉, 钳夹颈外动脉和颈总动脉, 于颈内和颈外动脉分支处附近作切口, 将16mm~ 17mm 长尼龙线从切口处沿颈内动脉完全插入至大脑中动脉并结扎颈内动脉, 阻滞右侧大脑供血, 之后逐层缝合让其苏醒, 苏醒后选择向左侧做转圈运动的成功动物模型, 随机再分成四组, 即缺血性卒中组、阳性药物组（复方活脑舒胶囊，吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司）、中药高剂量组和中药低剂量组, 每组10只，药物组合物的制备工艺如本发明实施例7所示。另取10只wista大鼠作为假手术组, 同样20%乌拉坦腹腔麻醉仰卧固定, 做颈部正中切口, 只是分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉后就缝合伤口。

     各给药组的给药方案如下所示：假手术组和缺血性卒中组给以0.9% 生理盐水10m l /kg灌胃,阳性药物组（复方活脑舒胶囊组）按60mg/kg给予复方活脑舒胶囊,。本发明中药高剂量组按100mg/kg给予按实施例3制备方法制备得到的中药细粉，中药高剂量组按10mg/kg给予按实施例1制备方法制备得到的药物组合物。各族给药体积10ml，每日灌胃1次, 连续7 d。 

   腹腔注射Brdu及标本收集：各组于第7 d动物腹腔注射BrdU ( 50mg/kg, 连续给药3次, 给药间隔为8 h), 最后一次给予BrdU 腹腔注射6 h后,将动物过量麻醉并使用4% 多聚甲醛灌注取脑留取标本进行BrdU 免疫组化染色标记海马齿状回( dentate gyrus, DG)的新生细胞, CD31标记缺血区周围的微血管。 

     免疫组织化学染色：将注射了BrdU 标记细胞的大鼠同前制作脑切片, 取含海马DG 区域的脑切片行BrdU染色观察原位干细胞的增殖与分化。取含缺血区脑片行CD31染色观察缺血区周围的微血管。切片常规脱蜡、抗原修复后免疫组织化学染色, 显微镜观察, B rdu染色阳性细胞( Brdu+ 细胞)的细胞核中有棕黄色颗粒, CD31染色阳性细胞( CD31+ 细胞)的细胞浆呈棕褐色, 以40×10倍显微镜观察, 每张切片选择5个相邻的非重叠视野计数阳性细胞和总细胞数。 

                  表 4 中药对神经干细胞再生和微血管生成的影响 

组别	BrdU+细胞数（个/mm2）	CD31+细胞数（个/mm2）
			假手术组	2.54±0.28	9.85±0.96
缺血性脑卒中组	8.10±0.62	11.96±1.30
			阳性药物组	12.26±0.98	38.16±2.19*
中药高剂量组	24.86±2.60**#	74.57±3.91**##
			中药低剂量组	18.45±1.43*	55.69±3.27**#

      与缺血性脑卒中组相比， ^*P<0.05，^**P<0.01，与阳性药物组相比，^#P<0.05，^##P<0.01。

本实验发现应用本发明药物组合物干预7 d 后, 其缺血BrdU+ 阳性细胞明显增加, 说明可促进内源性神经干细胞的激活、分化、增殖, 有利于缺血性损伤的神经细胞修复。本研究证实,本发明药物组合物能够激活内源性神经干细胞, 增加缺血区新生血管, 改善缺血区脑供血, 促进神经功能恢复。具体如下：与缺血性脑卒中组相比，阳性药物和本发明药物组合物均可以显著升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量，其中本发明药物组合物在升高BrdU⁺细胞数量和CD31⁺细胞数量方面与阳性药物组相比具有显著性或极限著性的差异，本发明药物组合物对于神经干细胞的再生和脑微血管的生成体现出明显的剂量依赖性。 

Claims (6)

1.一种药物组合物，其特征在于它主要由以下重量份的原料制得：木通15份、党参6份、石榴皮10份、文冠果壳10份、浙贝母10份、黄精20份，丹参20份、肿节风10份、川芎5份、青葙子8份、防己15份、牛蒡子7份、葛根10份、甘草10份。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于它主要由以下重量份的原料制得：木通15克、党参6克、石榴皮10克、文冠果壳10克、浙贝母10克、黄精20克，丹参20克、肿节风10克、川芎5克、青葙子8克、防己15克、牛蒡子7克、葛根10克、甘草10克。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为合剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。

4.一种制备如权利要求1或2所述的药物组合物的方法，其特征在于它包括以下步骤：取各药材，加药材总重量的5-15倍的水，浸泡10-60分钟，煎煮1-4次，每次1-3小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.05-1.25的浸膏，该相对密度是在60摄氏度下的检测结果，加入乙醇至含醇量为60-90%（v/v），静置24小时，取上清液，回收乙醇，浓缩，即得。

5.如权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于缺血性脑卒中后神经再生的药物中的用途。

6.如权利要求1或2所述的药物组合物在制备用于制备治疗或预防脑缺血或脑梗死的药物中的用途。