CN109298148A - 一种评估促神经再生药物效价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种评估促神经再生药物效价的方法，具体包括制备实验组药液，取一定量实验中药依次磨粉、加水混合、加热蒸干灭菌得到灭菌混合物，随后将灭菌混合物用乙醇混合物在减压条件下进行回流提取，再进行超声波提取后得到提取液，将提取液过滤得到对应中药的澄清提取液，本发明可有效的获取各种中药材的促神经再生药物效价，整体得出了相对较好的评价标准，整体为后续的实际药物效价判定提供了较好的实践基础。

Description

一种评估促神经再生药物效价的方法

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种评估促神经再生药物效价的方法。

背景技术

日本三角涡虫(Lugesia japonica Ichikawa et kawakatsu)属扁形动物门(Platyhel minthes)涡虫纲(Turbellaria)三肠目(Tricladida)三角涡虫属(Dugesia)，具有极强的再生能力，涡虫的可再生现象已经被用于药物筛选，其眼点再生更是对促神经恢复类药物筛选的最佳模型。目前市场上促神经恢复药物大多数为西药，而相关研究表明部分中草药也对神经的恢复有一定的作用如：红花(为菊科植物红花的干燥花)，被广泛应用于神经镇静、活血通经等，相关研究表明红花注射液可促进大鼠周围神经再生。当归主要成分为阿魏酸、藁内本酯、马鞭草烯酮、多糖及铜、锌、锰等微量元素，具有降低血小板聚集、改善血液循环以及抗血栓形成、清除自由基、降低脂质过氧化、保护线粒体的作用，研究表明，归提取液能够显著升高成年人视网膜神经细胞的膜电位并使其兴奋性呈波动性变化。骨碎补为骨科常用中药，化学成分主要为黄酮、三萜、酚酸及其苷类等，具有良好的促进骨折愈合等作用。赤芍具有多种药理作用，如保肝作用、抗肿瘤、对神经系统和心脏的保护作用、抗凝、抗血栓、抗氧化、抗内毒素等。川续断中的化学成分主要包括三萜及其苷类化合物、环烯醚萜苷类化合物、生物碱类化合物和挥发油类化合物等，现代研究表明主要有抗骨质疏松、促进骨损伤愈合等药理作用，研究表明续断在促进大鼠骨折愈合过程中的肽神经表达有促进作用。三七具有“止血、散血、定痛”作用。研究表明三七可以加速Aβ蛋白的降解，从而改善AD患病模型的学习记忆能力。研究工作表明血竭能调制三叉神经节和背根神经节细胞膜上电压门控型钠电流，部分地阐明了血竭镇痛效应的机制。自然铜为硫化物类矿物黄铁矿族黄铁矿味辛、性平，专入骨，能入血行血，有疗折伤、散血止痛、续筋接骨之功。白芷的主要成分之一香豆素类化合物对冠状动脉血管具有扩张作用和对钙离子拮抗作用，因此可以用于高血压疾病。赵万红等通过对复方白芷胶囊活血化瘀的作用进行研究后表明复方白芷胶囊具有显著的活血化瘀作用，可以用于预防高血压的并发症及心脑血管意外。川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎，始载于《神农本草经》。其性温，味辛、微苦；具有活血行气、祛风止痛的功效。研究表明川芎挥发油能促进体外培养的大脑皮层神经细胞存活。但对于中药的作用效果并没有形成固定的评价标准。

发明内容

本发明为克服上述情况不足，旨在提供一种能解决上述问题的技术方案。

一种评估促神经再生药物效价的方法，具体包括以下步骤：

S1、制备实验组药液，取一定量实验中药依次磨粉、加水混合、加热蒸干灭菌得到灭菌混合物，随后将灭菌混合物用乙醇混合物在减压条件下进行回流提取，再进行超声波提取后得到提取液，将提取液过滤得到对应中药的澄清提取液；

S2、挑选若干条9-10mm长的健康涡虫，分别等分放入至若干个盛有蒸馏水的无菌培养皿中，随后将消毒好的载玻片平稳放在冰盒上，依次对所有涡虫从耳突后进行切割，把去头部分放回培养皿，随后在培养皿中加入对应中药的澄清提取液作为实验组，在培养皿中加入促神经再生西药作为阳性对照组，在培养皿中加入蒸馏水作为阴性对照组；

S3、将实验组、阳性对照组以及阴性对照组样本均放置在恒温箱中培养，并且每天更换对应的培养液，并在数码体视显微镜下观察眼点再生情况并拍照记录数据。

作为本发明进一步的方案：所述中药包括红花、当归、骨碎补、赤芍、续断、三七、血竭、自然铜、白芷、川穹。

作为本发明进一步的方案：所述西药采用神经节苷脂。

本发明的有益效果：本发明可有效的获取各种中药材的促神经再生药物效价，整体得出了相对较好的评价标准，整体为后续的实际药物效价判定提供了较好的实践基础。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是各处理组眼点随时间的变化；

具体实施方式

对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下结合实施例进一步对本技术方案进行描述。

1材料与方法

1.1 实验材料

10组不同中药(实验组)、一种西药(阳性对照)及自来水(阴性对照)对涡虫眼点再生影响的统计数据。

1.2 评价过程

原始数据整理；分析统计学意义；比较差异显著性；创建评价标准；评价数据。

1.3 评价方法

根据拟合方程的截距定义效价

2结果与分析

2.1 实验结果初步统计

12组数据的均值±标准差(表1)。

表1. 12组数据的均值±标准差

Table 1.The Mean standard deviation of 12 groups of data

如表1所示，平均值±标准差反映了处理组中各个数据之间的变异程度，据此可以真实的反映总体参数。

从图1中可以很直观的看出各组药效的对比结果白芷＞阳性对照＞三七＞骨碎补＞阴性对照＞当归＞红花＞续断＞赤芍＞自然铜。

1.4 多重比较差异显著性分析结果

实验中各处理平均数之间存在显著或极显著差异，但并不意味着每两个处理平均数间的差异都显著或极显著，也不能具体说明哪些处理平均数间差异不显著。因有必要进行两两平均数间的比较，以具体判断两两处理平均数间的差异显著性。

1.4.1 多重比较差异显著性分析

表2.阴性对照多重比较差异显著性分析分析

Table 2.The analysis on the significance of multiple comparativedifferences in negative control

表3.阳性对照多重比较差异显著性分析分析

Table 3.The analysis on the significance of multiple comparativedifferences in positive control

如表2、表3，在本次实验中，除当归、骨碎补，赤芍、续断，三七、血竭这三组数据两两比较差性不显著(p＞0.05)外(以相同字母标出)，其余各组两两比较差异性均达到显著水平(p＜0.05)。

1.4.2 眼点随时间变化的拟合方程

表4.眼点随时间变化的拟合方程

Table 4.The fitting equation for the change of eye point with time

对表1的数据进行进一步整理得出各组药物作用于涡虫的拟合方程(见表4)，此表中，k值代表了处理组全部眼点恢复所需要的时间，截距代表了处理组涡虫第一个眼点出现的时间。k值越大，则处理组涡虫眼点全部恢复所需要的时间越长；截距越大，则处理组涡虫第一个眼点再生所需的时间越长。

1.4.3 效果评价标准表

表5.效果评价标准表

Table 5.The standard table of Effect evaluation

如表5，首先将表4中的截距与神经节苷脂函数的截距之差(第一个眼点出现的平均时间)的十分之一(7.21)设定为一个单位效价，然后依次用其它实验组函数截距与阴性对照函数截距之差除以已设定的一个单位效价的得数作为各个实验组的截距效价，表示该实验组药物对涡虫促神经再生的初始效价。

3讨论

根据图1求出每组药物作用于涡虫眼之后眼点数目随时间关系的拟合方程(见表4)，根据图1来看，每条直线的斜率(k)都不相同，而k的大小表面上造成了实验组涡虫眼点再生时间的增大，实际上决定了实验组涡虫眼点恢复时间的离散程度，即k越大，实验组涡虫眼点全部恢复时间越长，因此可以将k值作为实验组药物涡虫促神经再生的群体效价。

从斜率看，所有药物到最后都会对涡虫的再生有一个促再生消失点。如果超过这个时间点，促再生作用便会消失，表现出抑制作用，例如红花和川芎就是很典型的代表。也就是说促再生药物的促进再生作用有一个时间范围，不同药物之间促再生的范围也不同。

斜率都是正值说明中草药对涡虫的促再生作用有消减效应。可能是药物的促进作用会加强涡虫机体能量的消耗从而出现的状态。有待进一步实验研究验证。

4结论

根据本次采用的评价体系来判定，以初始效价为判定标准。神经节苷脂的效价为10、红花的效价为9.25、当归的效价为8.25、骨碎补的效价为6.03、赤芍的效价为-3.29、续断的效价为-5.67、三七的效价为12.14、血竭的效价为11.80、自然铜的效价为-8.91、白芷的效价为21.13、川芎的效价为7.96。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (3)

1.一种评估促神经再生药物效价的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、制备实验组药液，取一定量实验中药依次磨粉、加水混合、加热蒸干灭菌得到灭菌混合物，随后将灭菌混合物用乙醇混合物在减压条件下进行回流提取，再进行超声波提取后得到提取液，将提取液过滤得到对应中药的澄清提取液；

S2、挑选若干条9-10mm长的健康涡虫，分别等分放入至若干个盛有蒸馏水的无菌培养皿中，随后将消毒好的载玻片平稳放在冰盒上，依次对所有涡虫从耳突后进行切割，把去头部分放回培养皿，随后在培养皿中加入对应中药的澄清提取液作为实验组，在培养皿中加入促神经再生西药作为阳性对照组，在培养皿中加入蒸馏水作为阴性对照组；

S3、将实验组、阳性对照组以及阴性对照组样本均放置在恒温箱中培养，并且每天更换对应的培养液，并在数码体视显微镜下观察眼点再生情况并拍照记录数据。

2.根据权利要求1所述的评估促神经再生药物效价的方法，其特征在于，所述中药包括红花、当归、骨碎补、赤芍、续断、三七、血竭、自然铜、白芷、川穹。

3.根据权利要求1所述的评估促神经再生药物效价的方法，其特征在于，所述西药采用神经节苷脂。