CN110269874A

CN110269874A - 一种促神经再生药物

Info

Publication number: CN110269874A
Application number: CN201910712120.7A
Authority: CN
Inventors: 韩亚鹏; 张小霞; 周天林; 许姝娟; 柳鹏飞; 史红全; 王才军; 张红艳; 马娟; 李星; 颉鹏霞; 史科进
Original assignee: Longdong University
Current assignee: Longdong University
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2019-09-24

Abstract

本发明公开了一种促神经再生药物，该药物内含有白芷溶液，所述白芷溶液的浓度为0.22mg/ml～0.48mg/ml。本发明筛选出了一种新型促神经再生药物‑白芷，其有较强的促神经再生功能。

Description

一种促神经再生药物

技术领域

本发明涉及中药制剂领域，具体涉及一种促神经再生药物。

背景技术

随着经济的发展，人们受伤后的恢复常常被一些并发症所缠绕着，周围神经损伤就是目前临床上常见的创伤并发症之一，促进周围神经损伤后的再生并恢复其功能已成为研究的热门话题。因受伤害的方式不同，神经损伤的程度各异，因此，往往需要外科手术进行修复，根据损伤情况不同，有许多修复方法，如神经外模缝合、自体神经移植、或异体移植等，顾名思义，自体神经移植就是取自身的材料，而异体移植最好是取用完全相同的同胞供体，其次是完全吻合的无关供体，但目前无论在亲缘还是骨髓库里边，都很难找到。但细胞移植的再生医学，为供体的再生带来了希望，其中获得足量均一的供体细胞用于移植治疗和促再生药物的发现，成为该领域的核心内容，并成为医学上亟待突破的国际前沿研究领域。外科修复往往很难达到理想的恢复效果，神经再生过程是个涉及多因素多环节的复杂过程，需要结合其他方式进行综合治疗，中药因副作用小，作用靶点多，很好地契合了神经再生过程中多因子，多因素联合作用的生物特点，大量研究表明，中药对周围神经损伤的治疗效果良好。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种促神经再生药物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种促神经再生药物，该药物内含有白芷。

进一步地，该药物内含有白芷溶液，所述白芷溶液的浓度为0.22mg/ml～0.48mg/ml。所述白芷溶液通过以下步骤制备所得：

取一定量白芷磨粉、加水混合、加热蒸干灭菌得到灭菌混合物，随后将灭菌混合物用乙醇混合物在真空度为-0.07～-0.08 MPa下，60～65℃回流提取10min，再进行超声波（超声功率为40KHz）提取后得到提取液，将提取液过滤，即得。

进一步地，所述白芷溶液的浓度为0.30mg/ml。

本发明筛选出了一种新型促神经再生药物-白芷，其有较强的促神经再生功能。

附图说明

图1为白芷溶液随时间涡虫头部再生情况。

图2为白芷溶液、神经节苷脂钠注射液随时间涡虫头部再生情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实验例

(一)试验动物和试剂

本试验所用日本三角涡虫采自甘肃兰州市五泉山山泉。日本三角涡虫在实验室玻璃缸中喂养，在此期间，它们每隔4天用猪肝或蛋黄喂食一次，其间每喂食 2h后，把未吃完蛋黄挑出，换隔夜自来水，试验前 3d 停止喂食，试验温度为(20 ± 1) ℃。实验用水为隔夜自来水。

表1 药品名称、药品规格、生产地

(二)试验方法

1.预试验

首先，配置不同浓度梯度的实验试液，经过多次试验，得出处理 24h、48h 白芷溶液中日本三角涡虫 100% 致死的最低浓度 b和 0 致死的最高浓度 a，记24h为a1、b1, 48h为a2、b2，分别为a1=2.00mg/ml、b1=4.50mg/ml、a2=1.50mg/ml、b2=4.00mg/ml。

白芷对日本三角涡虫的半数致死浓度

急性毒理实验，周期为 24h 和 48h。参照预试验中所得的100%致死和0致死的浓度范围，将毒性试验浓度梯度设定为相等的对数间隔。24h 试验，浓度梯度分别为 2.00、2.35、2.76、3.25、3.82、4.50mg/ml；48h试验，浓度梯度分别为1.50、1.83、2.23、2.71、3.30、4.02mg/ml。并分别设以对照。每组5条日本三角涡虫，各设三个平行。试验开始时，将配置好的不同浓度梯度的白芷溶液各取25mL加入（直径9或12cm）培养皿中，并在表面用笔做好标记待用，然后用毛笔尖挑取体长大小相近日本三角涡虫放在载玻片上，静止片刻，待涡虫身体伸直，迅速用消毒刀片紧贴耳突后切去头部，再将切过头的涡虫移到培养皿中，实验中，每个培养皿中放 5条涡虫，随机分配，每个浓度设置三个重复。毒理实验在恒温 (20± 1) ℃下进行，期间不喂食，每24h换一次溶液，每6h在体视显微镜镜下观察并记录日本三角涡虫的体形变化和存活数，以日本三角涡虫不蠕动记为死亡，同时观察涡虫形态变化和运动改变等中毒情况，根据 BL -420S 生物机能实验系统计算 24h、48h 的 LC50值。

白芷对日本三角涡虫促神经再生试验

通过公式［SC =24h LC50× 0.3 ÷ (24hLC50 ÷48hLC50)³］，计算出白芷的安全浓度为0.22mg/ml, 参照白芷的安全浓度值，设置 4个浓度组和 1 个对照组，白芷的浓度分别为0.22、0.30、0.40、0.48mg/ml。每个浓度设定 3个重复，每个重复 5 条日本三角涡虫。

再生实验开始时，将切过头的涡虫移到培养皿中，实验中，每个培养皿中放 5条涡虫，随机分配，然后进行再生观察,再生实验于恒温 (20±1) ℃下进行，再生期间不喂食，每隔24h换一次溶液。术后 50h 开始，每隔 6h于体视显微镜下进行 1 次日本三角涡虫眼点再生观察并记录，以两眼点重新出现作为再生完成的标志。为了优化观察效果，将完成眼点再生的涡虫从培养皿取出并另外饲养。

同一浓度下白芷和神经节苷脂对日本三角涡虫促神经再生对比试验

该实验选取神经节苷脂为阳性对照，清水为阴性对照，参照白芷对三角涡虫的再生影响实验结果，筛选出0.30mg/ml白芷溶液促进效果最强，所以本实验所用白芷浓度为0.30mg/ml，神经节苷脂溶液浓度为0.30mg/ml，和一个清水对照组，各设置三个平行，每个平行5条涡虫。

实验开始时，将术后的三角涡虫随机分配到不同的培养皿中，对比实验在恒温(20±1) ℃下进行，期间不喂食，每隔24h换一次溶液，进行再生观察，其中，白芷溶液中的涡虫在50h以后每隔5小时在体视显微镜下观察一次，神经节苷脂溶液在45h以后每隔2小时在体视显微镜下观察一次，对日本三角涡虫眼点再生观察并记录。

数据处理

该实验中，白芷对日本三角涡虫的急性毒性实验数据运用BL－420S 生物机能实验系统进行分析，白芷和神经节苷脂对涡虫再生的影响通过统计学分析应用SPSS 17.0.软件和EXCEL软件进行数据统计分析，将几次重复的实验结果进行单因素线性统计分析，表示为平均值±标准偏差，对变量进行t检验，P<0.05时具有统计学意义。

结果与分析

(一)白芷溶液对日本三角涡虫的急性毒理作用

1.不同的白芷溶液对日本三角涡虫的半数致死

通过急性毒性试验结果 (详见表2) 表明，白芷溶液对日本三角涡虫的 24h、48h LC50分别为 3.50、2.06mg/ml，白芷对日本三角涡虫的安全浓度为 0.22mg/ml。

表2 白芷溶液对日本三角涡虫的急性毒性

2.白芷溶液中日本三角涡虫的中毒情况

对照组涡虫在水中呈完全伸展状，背面朝上腹部紧贴培养皿底面，可自由爬行，部分贴壁，表现为正常状态。白芷处理的涡虫，在不同浓度的溶液和不同的时间段会表现出不同的中毒情况，主要表现为运动的改变和身体形态的变化，甚至解体死亡。

运动状态的改变

主要表现为身体做无规则的运动和禁止不动。处理早期发现，低浓度处理组与对照组的运动行为无显著差异；高浓度处理组表现出明显的不适，身体发生卷曲和扩张，并进行不规则运动，后边变的平静或停滞，并且部分涡虫会完全不动。在后期阶段，各处理组随着时间的推移，不规则运动的涡虫数量将逐渐减少，非移动的涡虫数量在逐渐增加。

身体形态的变化

白芷处理组涡虫的主要身体形态变化包括身体扭曲、身体收缩、身体呈C型、身体变形、身体褪色、术口处溃烂、吐咽、解体死亡等。处理不久就可以明显观察到涡虫身体出现褪色现象，浓度越高褪色越严重，处理时间越长身体颜色越浅。处理早期，低浓度的涡虫表现出扭曲、身体收缩、身体呈C型、等状态，也有术口处吐出白色絮状物质的现象，但较少。高浓度处理的则会马上出现身体收缩、身体呈C型、身体变形、术口处溃烂、吐烟、解体成白色絮状物质而死亡等；处理后期，在体视显微镜下观察未死亡的涡虫发现，切口处形成白色“三角形”凸起，即涡虫头部的雏形，然后涡虫头部再慢慢长出两个小的黑色斑点，即为眼点。

二)白芷对日本三角涡虫再生的影响

从表3可以看出，对照组涡虫眼点完成再生时间大于实验组，说明不同浓度的白芷溶液对蜗虫的再生有一定的促进作用，不同浓度的白芷溶液对蜗虫的再生时间有显著影响（P＜0.05），同浓度下对不同涡虫的再生时间没有显著影响（P＞0.05），当浓度在0.22mg/ml～0.30mg/ml之间时，随着浓度的增大，涡虫的再生速度与浓度呈正相关，当浓度在0.30mg/ml～0.48mg/ml之间时，随着浓度的增大，涡虫的再生速度与浓度呈负相关，并且0.30mg/ml的溶液在术后50h率先开始再生，68h后完成再生，再生起始和完成时间均小于其他浓度处理组和对照组，所以0.30mg/ml的白芷溶液对涡虫的再生促进作用最强（见图1）。

表 3 白芷对日本三角涡虫再生的影响

(三)同一浓度下白芷和神经节苷脂对日本三角涡虫再生对比实验

由表4可以看出，相同浓度的白芷溶液、神经节苷脂钠注射液对蜗虫的再生完成时间均小于对照组，表明白芷和神经节苷脂都促进了涡虫的再生，且促进作用显著（P＜0.05），然而，神经节苷脂的促进效果比白芷更突出一点。涡虫在去头处理45h以内没有再生出现，神经节苷脂处理组45h后开始了再生，在55h时完成了再生；白芷处理组在50h后开始了再生，65h后完成了再生，对于对照组而言，处理组均有较明显的促再生效果（见图2）。

表 4 同一浓度下白芷和神经节苷脂对日本三角涡虫再生对比

(一)白芷对日本三角涡虫的急性毒理

作为一种哨兵物种，淡水涡虫对生态系统中的有毒污染物非常敏感，因此用涡虫作为实验动物对化学物质生物毒性进行评价的研究有很多报道。急性毒性实验不仅是确定有毒化学物质毒性高低的主要技术方法，也是进行慢性毒性实验的基础和前提，而获得该化学毒物对实验动物的LD₅₀/LC₅₀则是急性毒理实验的主要任务。LC₅₀是导致一组实验动物死亡一半的浓度，并且通常用于指示和比较急性毒理的程度。LC₅₀数值越小，外源化学物质毒性越大， LC₅₀值越高，毒性越低。参照Hodges和Sterner的急性毒性分级标准，我们确定白芷的毒性则基本可忽略不计（1000mg/L＜LC₅₀＜10000mg/L）。白芷急性毒理学实验中，白芷对日本三角涡虫的LC₅₀值与其他一些水生生物如淡水螺（Physa acuta）、大型溞（Daphniamagna）、斑马鱼(Dania rerio)的LC₅₀值相比略高。由此可以推断出，日本三角涡虫对白芷的抗药性高于其他水生生物，这可能与其强大的再生能力有关。

通过对涡虫中毒症状的观察，可以看出由白芷处理的涡虫运动状态的的变化显示出对时间和浓度的依赖性，这与有机磷杀虫剂对三角涡虫毒性作用是一致的。推测涡虫运动发生不规则变化可能是由于白芷溶液引起涡虫神经中毒所致。

二)白芷对日本三角涡虫再生的影响实验

涡虫头部再生一般分为以下几个过程。当涡虫头部被切后，切口会在短时间内凹陷收缩且色素积聚，之后在切口处长出颜色较浅的新生组织，之后形成白色“三角形”凸起，即涡虫头部的雏形，然后涡虫头部再慢慢长出两个小的黑色斑点，即为眼点，只在身体爬行时明显，最后眼点再生完全，此时涡虫的头也趋于成型。

在这个实验中，我们发现日本三角涡虫在头被切断后50h开始有涡虫完成再生，在82h之前，每个处理组的涡虫再生数量多余对照组，说明不同浓度的白芷溶液对涡虫的再生有一定的促进作用，且影响显著（P＜0.05），当浓度在0.22mg/ml～0.30mg/ml之间时，随着浓度的增大，涡虫的再生速度与浓度呈正相关，处理浓度越大，再生速率越快，全部完成再生时间越短，当浓度在0.30mg/ml～0.48mg/ml之间时，随着浓度的增加，涡虫的再生速度与浓度呈负相关。因此推测，当浓度大于 0.48mg/ml 时，可能对涡虫的再生速率起抑制作用。所以0.30mg/ml的白芷溶液对涡虫的再生促进作用最强，

关于蜗虫再生期间细胞的来源有两种流行的观点。一种观点认为，一旦涡虫身体的某一部分受到伤害，涡虫体内存在的一种成体未分化细胞（neoblast）就会朝伤口定向迁移，在伤口处堆积形成再生芽基(blastema),进一步补偿分化出缺失的各种组织细胞直到再生的完成；还有一种是Babsch提出的反分化理论。在涡虫再生的过程中，两者协同完成，再生的本质是蛋白质的合成过程。实验证明5-羟色胺是细胞分裂增值的激素之一，当涡虫去头后，5-羟色胺的浓度会先下降，后上升，再下降，但还仍然高于正常值，并且这种催化路线是从激活细胞膜内表面的腺苷酸环化酶开始的。

白芷的药理作用主要有抗炎镇痛、抗病原微生物、抗肿瘤等，其镇痛作用是主要的药理作用。白芷有两种化学成分，一种是香豆素类成分，香豆素（CAD）学名苯并吡喃酮，是顺式邻羟基肉桂酸的内酯，是一类存在于植物界中的香豆素类化合物的母核；另一种是挥发油类成分，挥发油（EOAD）是一类具有挥发性可随水蒸气蒸馏出来的油状液体，学者们通过反应热板法、醋酸扭体法、甲醛致痛法研究EOAD的镇痛作用，由实验结果可以看出，EOAD有一定的镇痛和抗炎作用。通过对白芷镇痛作用机制的研究发现，其EOAD可降低单胺类神经递质含量，在中枢显著升高多巴胺5-羟色胺含量，由此推断，可能在涡虫切口处聚集了大量的EOAD，影响了细胞膜表面的催化路线，合成了大量的5-羟色胺，改变了涡虫体内neoblast细胞的活性，从而影响切割创伤后neoblast细胞向伤口处定向迁移和分化，从而使得涡虫的再生速率增强。

三)同一浓度下白芷和神经节苷脂对日本三角涡虫再生对比实验

大量研究表明，中药对于周围神经的损伤和修复有很大的功效。涡虫具有梯形神经系统，头部有一对脑神经节，由此分出一对腹神经索通向体后，在腹神经索之间有横神经相连，因而构成梯形。当涡虫切除头部后，其头部的神经会受到损伤。本实验选取白芷为脑神经损伤后恢复药物，以促神经再生极强的神经节苷脂为阳性对照，探究白芷的促神经再生效果。实验结果表明，相同浓度的白芷溶液、神经节苷脂钠注射液对涡虫的再生完成时间均小于对照组，表明白芷和神经节苷脂均促进了涡虫的再生，并且作用显著（P＜0.05），神经节苷脂作为上市药物，促进效果比白芷略强，但白芷和对照组相比，仍然有很强促再生作用，所以，白芷也可以作为新型促神经再生药物运用于临床。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims

1.一种促神经再生药物，其特征在于：该药物内含有白芷。

2.如权利要求1所述的一种促神经再生药物，其特征在于：该药物内含有白芷溶液。

3.如权利要求2所述的一种促神经再生药物，其特征在于：所述白芷溶液通过以下步骤制备所得：

取一定量白芷磨粉、加水混合、加热蒸干灭菌得到灭菌混合物，随后将灭菌混合物用乙醇混合物在真空度为-0.07～-0.08 MPa下，60～65℃回流提取10min，再进行超声波提取后得到提取液，将提取液过滤，即得。

4.如权利要求2所述的一种促神经再生药物，其特征在于：所述白芷溶液的浓度为0.22mg/ml～0.48mg/ml。

5.如权利要求2所述的一种促神经再生药物，其特征在于：所述白芷溶液的浓度为0.30mg/ml。

6.如权利要求3所述的一种促神经再生药物，其特征在于：所述超声波提取时，超声功率为40KHz。