CN112876546A - 一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体的说是一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法及使用方法。本发明采用的技术方案为：一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法及使用方法，其包括下列步骤：1）致病菌培养基制备及2）免疫因子制备。使用时，以拌料方式或直接撒播的方式对动物进行免疫操作。本发明的有效成分大部分是简单的培养基成分，部分组分源自养殖场环境，不会对养殖生物和环境产生影响，无毒无害，安全环保，而且价格低廉，简单可行，可以实现规模化生产。

Description

一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法及使用 方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体的说是一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法及使用方法。
背景技术
水产养殖养殖业是我国重要的农业活动之一，能够为广大国民提供优质的食粮，为工业发展提供大量原料，同时能够大量弥补海洋捕捞，有利于维持环境生态平衡。然而，近几年致病菌病害成为水产养殖快速发展的瓶颈之一。目前，因微生物引发的病害涉及几乎全部养殖品种，仅2017年，微生物病害导致的经济损失就高达360亿。其中，弧菌病已经成为水产养殖业病害的最主要拦路虎，甚至达到“谈弧色变”的程度。致病菌在水产养殖中是一直存在的，一般情况下致病菌浓度相对较低，不会对养殖生物产生致死性感染，然后当环境出现异常利于致病菌大量繁殖，或者养殖生物出现亚健康状态时，致病菌就会大量繁殖，污染水体，感染养殖生物，并导致其生长迟缓乃至大量死亡。
如何防治弧菌病害，一直是水产研究的重点。目前采用较多的方法是抗生素疗法，但后期由于抗生素的广泛使用、滥用和过度使用，耐药细菌菌株（包括多耐药菌株）大量出现与流行，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。尤其，“超级病菌”频繁出现，它们几乎对所有的抗生素都不敏感。此外，较为可行的方法就是疫苗免疫，但此类免疫的实际应用面相对较窄，一般只针对个别致病菌，例如大型生物的鸡瘟、兔瘟等；而且，疫苗的获得周期较长，一般需要几月乃至几年的时间，不能解决水产动物的快速死亡问题；此外，疫苗需要人工注射免疫，对于鲍、虾、蟹、蛤等小体积的养殖生物并不适用。因此，在水产领域依靠抗生素和疫苗进行抗病性免疫基本不可行。在此背景下，如何有效快速的让水产养殖动物产生免疫能力，将成为病害发生时养殖是否成功的关键。
发明内容
针对目前水产养殖动物致病的技术问题，本发明的目的之一是提供一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法；本发明的目的之二是提供一种该免疫因子的使用方法。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其包括下列步骤：
1）致病菌培养基制备
在溶剂中加入终浓度为4g/L的蛋白胨、1g/L酵母膏或酵母浸粉以及1g/L醋酸钠，混匀至溶解后灭菌处理形成致病菌培养基；
2）免疫因子制备
提取发病组织，放置于步骤1）所制备的致病菌培养基中，添加比例为1-5%（w/v）；然后将培养基置于28℃条件下培养至培养基中的OD600值为1-1.5结束培养，然后对培养基进行灭菌处理，冷却后保存在4℃条件下形成免疫因子。
进一步的，所述步骤1）中在灭菌处理之前对致病菌培养基的pH值调整为7.8。
进一步的，当确认病原微生物为弧菌，步骤1）中还需要在溶剂中添加终浓度为3g/L的牛胆酸钠、5g/L的牛胆粉、10g/L的硫代硫酸钠和1g/L的柠檬酸铁，将pH调节至8.6。
进一步的，所述步骤1）中的灭菌处理是121℃高压灭菌18 min，或110℃高压灭菌25 min，亦或煮沸30 min。
进一步的，所述步骤1）中的溶剂为养殖环境中的海水或淡水。
进一步的，所述步骤2）中的发病组织是在养殖生物中挑选即将死亡但未死亡且病害特征显著的动物的发病组织，在保证组织样品存活的情况下，迅速将组织样本使用无菌海水清洗3遍，然后在无菌环境下切成小块。
进一步的，所述步骤2）中的灭菌处理是将培养基冷冻、煮沸，反复三次，其中每次冷冻时间10-30 min，最后一次煮沸时间大于30 min。
一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的使用方法，将该免疫因子以拌料方式添加在养殖动物饵料中，添加比例为1-5%，保持水体不交流1-2 h，在此过程中如果原养殖活动需通气则应保持通气，然后恢复水体流动，每天进行一次，持续7-14天。
一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的使用方法，将该免疫因子直接撒播到养殖水体中，添加比例为万分之1-5，保持水体不交流1-2 h，在此过程中如果原养殖活动需通气则应保持通气，然后恢复水体流动，每天进行一次，持续7-14天。
本发明具有以下优点：
（1）操作简单可行。本发明将免疫学技术以简单明了的方式应用到养殖活动中，仅借助基础的微生物培养技术，在无特效药、不使用抗生素的情况下能够有效、快速免疫目标动物，实现养殖动物的自我免疫激发，缓解由一种或一类致病弧菌导致的养殖动物死亡。
（2）价格低廉，无毒害。本发明的有效成分大部分是简单的培养基成分，部分组分源自养殖场环境，不会对养殖生物和环境产生影响，无毒无害，安全环保，而且价格低廉。
（3）无抗药性。本发明不同于抗生素添加，仅利用病原微生物的抗原决定簇进行免疫，不会引发病原微生物的变异，不会导致抗药性的产生。
附图说明
附图1 实施例水产养殖动物致病菌快速免疫后的存活率示意图。
附图2实施例水产养殖动物致病菌快速免疫后的摄食率示意图。
附图3实施例水产养殖动物致病菌快速免疫后的体内可培养弧菌示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明提供的免疫因子的具体制备方法及使用方法做详细描述。
在本实施例中以模拟创伤弧菌Vibrio vulnificus导致的稚鲍死亡所制备免疫因子及采用该免疫因子进行免疫过程为例进行说明。
一、场景模拟：取平均规格为3cm左右的稚鲍，放置在流水条件下暂养一个周，流水源自砂滤后海水，每天下午投喂适量新鲜海带；培养创伤弧菌Vibrio vulnificus至对数期，然后按照终浓度为103-5cells/mL的终浓度添加到暂养过后的稚鲍水体中，持续添加3天；约10天后，稚鲍开始陆续出现死亡，此时取濒临死亡鲍，带回实验室待测。
二、致病菌培养基制备：使用稚鲍养殖环境中的海水作为溶剂进行配置，加入终浓度为4g/L的蛋白胨、1g/L的酵母浸粉、1g/L的醋酸钠、3g/L的牛胆酸钠、5g/L的牛胆粉、10g/L的硫代硫酸钠和1g/L的柠檬酸铁，混匀至溶解后，将pH调节至8.6；在配制完成后，121℃高压灭菌18 min，或110℃高压灭菌25 min，亦或煮沸30 min。在本步骤中，如果不能确定致病病原微生物为弧菌，则在溶剂中应基础性加入蛋白胨、酵母浸粉、醋酸钠，添加浓度如上，pH值调低，调整为7.8；当确定为弧菌时，应在加入的基础上加入牛胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸铁，添加浓度如上，并将pH值调整至8.6。上述物质的添加能够激发养殖动物的免疫系统，产生特异性免疫，对由该种或该类的致病菌产生免疫，从而在受到该种或该类致病菌重复感染时维持健康并降低死亡率。
三、免疫因子制备：挑选步骤一所采集的濒临死亡鲍，使用无菌海水将病鲍迅速清洗3遍，并迅速在酒精灯附近切成小块，按照2%（w/v）比例放置于步骤二所制致病菌培养基中，实际比例可控制在1-5%（w/v），然后28℃培养12h以上，至培养基中的OD600值约为1-1.5结束；向培养基中添加终浓度为1mg/mL的溶菌酶，如果条件不允许可以不加，效果略有差异，但不影响免疫结果，冷冻10-30min，后煮沸10-20 min，反复3次，最后一次煮沸时间应大于30min；然后将培养基封口，冷却后保存在4℃条件下制成免疫因子。利用反复冷冻和加热将培养基中富集的培养致病菌裂解，一方面充分杀死致病菌，另一方面将致病菌的抗原决定簇释放出来。在采集样品过程中，应保证被选生物存活，操作过程要迅速，否则体内菌群会发生变化，致病菌极可能被腐败菌所替代，导致本方法失效。
四、生物免疫：将步骤三制备好的免疫因子，将免疫因子以拌料方式添加在养殖动物饵料中，添加比例为1-5%，或将免疫因子以万分之1-5的比例撒播到养殖水体中，撒播或投料后，保持水体不交流1-2 h，在此过程中如果原养殖活动需通气则应保持通气，然后恢复水体流动，每天进行一次，持续7-14天。在本实施例中，采用拌料添加的方式进行实验，添加比例为3%。
免疫具体实验过程如下：
本实验过程跟踪测量了创伤弧菌Vibrio vulnificus免疫后的稚鲍情况。
本次试验共分为四阶段，分别为：
第一阶段，暂养阶段（7 d）。
第二阶段，免疫阶段（10 d，添加本实施例制备的免疫因子和抗生素）。
第三阶段，活菌添加阶段（14d，开始添加创伤弧菌Vibrio vulnificus）。
第四阶段，后续观察阶段（10 d，停止添加创伤弧菌Vibrio vulnificus）。
操作温度为12-14℃。
实验共分为三组，分别为：
第一组、在免疫阶段添加本实施例制备的免疫因子。
第二组、在免疫阶段添加土霉素（实验证明，土霉素对创伤弧菌Vibrio vulnificus致死）。
第三组、无添加。
因为本实验采用流水养殖，在添加试剂后，所有实验组均停水1-2h，然后统一通水。
实验结果：
1、在阶段一，各处理组的死亡量未纳入统计。
2、在阶段二，无鲍死亡。
3、在阶段三，如附图1所示，第三组的死亡率最大（13.33%），第二组的死亡率最低（0%），第一组死亡率次之（6.67%）；在后续观察阶段，第三组持续死亡，至42d，其死亡率达到43.33%，而第一组的死亡量最低（15.00%），第二组的死亡数持续增加至20.00%，具体见图1。
实验期间，每2-3天统计各处理组鲍的摄食量。
在阶段一，各处理组的摄食量差异不显著；
在阶段二，各处理组的变化趋势不显著；
在阶段三，18 d（添加活菌后第2天）各处理组的摄食量均显著降低，20 d后有所恢复，其中第二组的摄食量相对最高，第三组相对最低，第一组居中；
在阶段四，第三组持续降低，第一组和第二组差异不显著，但均显著高于第三组，具体见附图2。
采用TCBS固体培养基对皱纹盘鲍体内的弧菌丰度进行了统计分析。在第一阶段，各处理组鲍体内的弧菌数差异不显著；在第二阶段，第一组和第二组均显著高于第三组，说明此时期的鲍处于相对亚健康状态；在第三阶段，第三组的鲍体内活菌浓度持续增加，最高时约为其他两组的3倍，第一组和第二组的鲍体内活菌浓度维持了一段时间（18-22 d）的低值，均极显著低于第三组，后呈现上升态势；在后续观察阶段，第一组的弧菌浓度保持最低，第三组最高，第二组居中。具体见附图3所示。
通过实验可发现，第一组，即免疫因子添加组能够激发稚鲍的免疫活动，具体表现为相比第三组显著降低死亡率，提升摄食率，并且降低稚鲍体内的弧菌数量，而且该免疫结果能够持续较长时间；该方法也能够发挥与第二组，即添加抗生素类似甚至更优的作用，完全可以替代抗生素治疗该类型的疾病。
以上仅为本发明的集中实施例，本发明还适用于其他其他致病菌引发的水产动物快速免疫，预防养殖动物死亡，同时也可以作为免疫制剂长期在稚鲍养殖车间使用。

Claims (9)

1.一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其包括下列步骤：
1）致病菌培养基制备
在溶剂中加入终浓度为4g/L的蛋白胨、1g/L酵母膏或酵母浸粉以及1g/L醋酸钠，混匀至溶解后灭菌处理形成致病菌培养基；
2）免疫因子制备
提取发病组织，放置于步骤1）所制备的致病菌培养基中，添加比例为1-5%（w/v）；然后将培养基置于28℃条件下培养至培养基中的OD600值为1-1.5结束培养，然后对培养基进行灭菌处理，冷却后保存在4℃条件下形成免疫因子。
2.根据权利要求1所述的一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中在灭菌处理之前对致病菌培养基的pH值调整为7.8。
3.根据权利要求1所述的一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其特征在于：当确认病原微生物为弧菌，步骤1）中还需要在溶剂中添加终浓度为3g/L的牛胆酸钠、5g/L的牛胆粉、10g/L的硫代硫酸钠和1g/L的柠檬酸铁，将pH调节至8.6。
4.根据权利要求1所述的一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中的灭菌处理是121℃高压灭菌18 min，或110℃高压灭菌25 min，亦或煮沸30 min。
5.根据权利要求1所述的一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中的溶剂为养殖环境中的海水或淡水。
6.根据权利要求1所述的一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中的发病组织是在养殖生物中挑选即将死亡但未死亡且病害特征显著的动物的发病组织，在保证组织样品存活的情况下，迅速将组织样本使用无菌海水清洗3遍，然后在无菌环境下切成小块。
7.根据权利要求1所述的一种防止水产养殖动物致病的免疫因子的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中的灭菌处理是将培养基冷冻、煮沸，反复三次，其中每次冷冻时间10-30min，最后一次煮沸时间大于30 min。
8.一种权利要求1-7中任意一项制备方法制备的防止水产养殖动物致病的免疫因子的使用方法，将该免疫因子以拌料方式添加在养殖动物饵料中，添加比例为1-5%，保持水体不交流1-2 h，在此过程中如果原养殖活动需通气则应保持通气，然后恢复水体流动，每天进行一次，持续7-14天。
9.一种权利要求1-7中任意一项制备方法制备的防止水产养殖动物致病的免疫因子的使用方法，将该免疫因子直接撒播到养殖水体中，添加比例为万分之1-5，保持水体不交流1-2 h，在此过程中如果原养殖活动需通气则应保持通气，然后恢复水体流动，每天进行一次，持续7-14天。
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