CN111714526A - 离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用。通过从患病大闸蟹体内分离相关细菌并制成相关粉剂，通过实验证明可提升大闸蟹免疫功能，提升其对各种细菌疾病的抵抗能力，减少病虫害的发生，并且高效、健康、环保。此外，本发明还公开了一种离壶菌代谢产物的制备方法。

Description

离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用

技术领域

本发明涉及一种代谢产物的用途，具体涉及一种离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用。

背景技术

增强免疫力是指通过一定手段来使自身免疫力加强。免疫力是生物体自身的防御机制，是生物体识别和消灭外来侵入的任何异物（病毒、细菌等）、处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。

有害物质过量排放，使空气、土壤、水源污染；每一、两年一次的大规模因细菌、病毒引起的流行病肆虐等等，严重困扰着人类的健康，超级细菌更是因为人们过度使用抗生素等药物造成。人类要具备抵抗各种病毒、细菌的防疫能力，创造健康的体魄，最重要是增强自身自然免疫力及对各种疾病的自然治愈力。由于市场需求和高收益的推动，高密度的集中化养殖也造成了水体污染水质恶化，造成了大闸蟹各类疾病的频繁发生。增强大闸蟹免疫力抵抗相关疾病成为当下研究热点。

近年来，由于严重的疾病，我国的虾蟹类养殖业蒙受了巨大的损失；又由于使用抗生素，过硫酸氢钾等药物有安全性、抗药性以及对水环境的不良影响等方面的考虑。因此研究甲壳动物的免疫机制，有效提高虾蟹类本身的抗病能力，越来越受到人们的重视。根据近年来国内外的有关文献，就甲壳动物免疫机制的研究成果，予以综述，以期为虾蟹类的人工养殖及病害防治提供理论依据.一般认为甲壳动物体液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，然而它们却能以不同的方式抵御病原体的侵袭并能识别异己物质，其免疫反应具有不同于脊椎动物的一些独特的性质:主要包括血细胞的吞噬、包囊形成作用以及一些淋巴中的一些酶或因子的杀菌、抗菌作用等，这些反应机制传统上被分为细胞免疫和体液免疫。实际上在甲壳动物中两者密切相关，如体液因子可在血细胞中合成并释放出来，细胞反应又受体液因子的介导和影响等。

为了防治阳澄湖大闸蟹的传染性疾病，使用各种抗菌剂仍被作为目前的主要对策，但是由于耐药性病原菌的形成以及环境污染问题等方面的考虑，正确使用疫苗或免疫增强剂来提高阳澄湖大闸蟹自身的抗病能力，是以后预防蟹病发生的途径。尽管甲壳动物的血淋巴液内不存在免疫球蛋白，但是具有非特异性免疫的性质，适当的诱导可提高血细胞的吞噬能力及多种体液免疫因子的数量和活性。相关研究发现，肌肉注射嗜水气单胞菌疫苗后一定时间内，阳澄湖大闸蟹血清溶菌酶、超氧化物酶歧化酶（SOD），酚氧化酶（PO）活力均有所升高，免疫保护率为74.7%，证明肌肉注射嗜水气单胞菌疫苗的确能够增强中华绒赘蟹的免疫抗病能力。

大闸蟹常见的由细菌引起的疾病1、腐壳病病蟹步足尖端破损、逐渐成黑色溃疡并腐烂，然后步足各节及背甲、胸板出现白色斑点并逐渐变成棕色、红棕色诱斑点，严重时斑点连成不规格形状，边缘呈黑色溃疡中心凹下，甲壳被浸蚀成洞，可见肌肉或皮膜，导致河蟹死亡。该病是由于蟹的步足尖端或甲壳等处受损伤，被细菌感染所致。2、黑鳃病病蟹左右鳃丝部分呈暗灰或黑色，严重时，鳃丝全部变黑色；行动迟缓，呼吸困难，俗称“叹气病”。该病多发生在成蟹养殖的后期、水环境条件恶化，是该病发生的主要原因。3、烂肢病病蟹的腹部及附肢腐烂，肛门红肿，摄食减少至拒食，活动迟缓，最终导致无法蜕壳而死亡。该病是因河蟹在捕捞、运输、放养过程中致伤或在生长过程中受敌害致伤感染病菌所致。4、水肿病病蟹腹部、腹脐及背壳下方肿大呈透明状；病蟹匍匐在池边，拒食，最后在池边或浅水处死亡。该病是因在养殖过程中，蟹腹部受伤感染病菌所致。5、肠胃炎病（又称肠胃鼓气病）病蟹消化不良，肠胃发炎，胀气，打开腹盖，轻压肛门，可见黄色粘液流出，该病是由于投饲不均或饲料变质引起。6、水霉病是常见的真菌性蟹病。病蟹体表及附肢等处，尤其是腹部，长有灰白色的棉絮状菌丝；病蟹行动迟缓，摄食减少，伤口不愈合，导致伤口部位组织溃烂并蔓延；身体瘦弱而无法蜕壳死亡。该病还大量危害抱卵蟹的卵块与幼体。该病是因蟹体受伤或病害、敌害破坏体表霉菌侵入伤口所致。

大闸蟹常见细菌病的对策。针对大闸蟹常见细菌疾病没有特效药。养殖户无药可用，只能进行一些物理方法，基本对策为清理池塘底泥，整体换水，水体用生石灰，漂白粉等进行水体消毒。用药多为抗生素类产品如磺胺类药物，土霉素，呋喃西林等。这些操作对大闸蟹品质及环境造成了严重影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用，可以有效提升澄湖大闸蟹抗真菌病，并且高效、健康、环保。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用。

本发明还提供了一种离壶菌代谢产物的制备方法，包括以下步骤：步骤A、从患病大闸蟹体内分离离壶菌，然后进行培养；步骤B、挑取少量菌体接种到摇瓶液体培养基中进行种子发酵和振荡培养；步骤C、将种子摇瓶接入发酵罐进行至少2级发酵；步骤D、发酵完成后加入0.5M Tris HCl缓冲液保护代谢产物，然后进行破壁；步骤E、对菌体细胞破壁的菌液破碎液通过200目筛网过滤，去除残渣、菌丝体细胞壁组织，保留菌液破碎液，然后添加载体填料助剂并干燥。

本发明的有益效果是：通过从患病大闸蟹体内分离相关细菌并制成相关粉剂，通过实验证明可提升大闸蟹免疫功能，提升其对各种细菌疾病的抵抗能力，减少病虫害的发生，并且高效、健康、环保。

下面结合附图对本发明进行详细说明。

附图说明

图1是本发明中离壶菌代谢产物的制备方法的流程图；

图2是本发明的离壶菌代谢产物应用二中实施例1的溶菌酶活力对比图；

图3是本发明离壶菌代谢产物应用二中实施例1的超氧化物歧化酶活力对比图；

图4是本发明离壶菌代谢产物应用二中实施例1的酚氧化酶活力对比图。

具体实施方式

参见附图1，本发明提供了一种离壶菌代谢产物的制备方法，包括以下步骤。上述的离壶菌代谢产物具体是指离壶菌分泌的多糖多肽。

步骤A、从患病大闸蟹体内分离离壶菌，然后进行培养。

详细地，取濒死病蟹，用无菌水冲洗干净后再用75%酒精棉球反复擦洗病蟹体表及步足，打开甲壳，分别取血淋巴、肝胰腺、腹水、肌肉等组织于普通营养琼脂平板上作划线分离，在16-43℃（优选28℃）培养18h -24h，待平板上长出形态一致的优势菌落后，挑选单个优势菌落再次划线，然后将分离好的菌体接种于普通营养琼脂培养基并于16-43℃（优选20℃）下培养24h。

普通营养琼脂培养基的配置如下：牛肉膏 1g，酵母膏 2g，蛋白胨 5g，NaCl 5g，琼脂 15g，加水定容至1000ml调PH为7.4，加入琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2。分装，121℃高压灭菌15min。将分离好的菌体接种于该培养基20℃培养24h，使菌体大量繁殖。

步骤B、挑取少量菌体接种到摇瓶液体培养基中进行种子发酵和振荡培养。

详细地，摇瓶液体培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉3.0-5.5%，牛肉膏1.0-4.5%，糖0.1-1.0%，硫酸铵0.01-1.00%，代谢产物产生诱导剂0.01-1.00%，代谢产物激活剂I 0.01-0.50%，代谢产物激活剂II 0.01-0.50%，其余为水。振荡培养条件为在180rpm-200rpm、28-32℃的条件下振荡培养至少40h。

步骤C、将种子摇瓶接入发酵罐进行至少2级发酵。

1级发酵包括以下步骤：将种子摇瓶接入50L发酵罐进行发酵，其中培养基装液量为65%、灭菌温度121℃，30min，发酵培养温度为28-32℃，PH为6.0-7.2，发酵时间36h；2级发酵包括以下步骤：菌种经过50L发酵罐发酵后接入500L发酵罐进行发酵，其中培养基装液量70%、灭菌温度121℃，30min，发酵培养温度为28-32℃，PH为6.0-7.2，发酵时间为10-70h（优选20h）。

1级发酵时培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉3.0-5.5%，牛肉膏1.0-4.5%，糖0.1-1.0%，硫酸铵0.01-1.00%，代谢产物产生诱导剂0.01-1.00%，代谢产物激活剂I0.01-0.50%，代谢产物激活剂II 0.01-0.50%，余量为水；2级发酵时培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉3.0-5.5%，牛肉膏1.0-4.5%，糖0.1-1.0%，硫酸铵0.01-1.00%，代谢产物产生诱导剂0.01-1.00%，代谢产物激活剂I 0.01-0.50%，代谢产物激活剂II 0.01-0.50%，余量为水。

如需大规模发酵可进行3级发酵。

步骤D、发酵完成后加入0.5M Tris HCl缓冲液保护代谢产物，然后进行破壁。

步骤E、对菌体细胞破壁的菌液破碎液通过200目筛网过滤，去除发酵培养基残渣、菌丝体细胞壁组织，保留菌液破碎液，然后添加载体填料助剂并干燥。详细地，菌液破碎液加入载体和填料后进入离心式喷雾干燥器干燥，其中物料进口温度：180-200℃，出口温度：70-80℃。利用高速离心式雾化器使物料分散成雾状，与热空气充分接触，使其水分瞬间蒸发完成干燥，形成细度100目-200目粉状成品。

本发明还提供了一种离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用。上述的离壶菌代谢产物指的是离壶菌分泌的多糖多肽。

应用一：通过浸泡处理提升大闸蟹幼苗苗体的免疫力。

10-70h大闸蟹幼苗苗体进行浸泡处理以提高抗真菌病免疫力，其包括以下步骤：

（1）、将离壶菌代谢产物以清水稀释至5ppm～40ppm；

（2）、用稀释后的离壶菌代谢产物液体对阳澄湖大闸蟹幼苗进行浸泡处理，浸泡时间为10min-15min，一天浸泡一次，共浸泡3次。

浸泡时间至少提前于投入养殖池期 3～4天。浸泡处理可以是在大闸蟹的全生育期施用，但经过我们的观察和长期研究，对大闸蟹幼苗苗体进行浸泡处理的效果更好，大闸蟹幼苗苗体优选为80-120头/斤的幼苗。

实施例1：将离壶菌代谢产物以清水稀释至30ppm，用稀释后的离壶菌代谢产物对大闸蟹个体进行浸泡处理，以清水作对照，每个处理用30只螃蟹。处理24h，48h，72h，96h后，分别统计大闸蟹剩余存活个体数处理后的实验结果如下表所示。

其中，免疫保护率=（对照组死亡率－免疫组死亡率）/对照组死亡率。

结果与分析：由上表可见，离壶菌代谢产物能够显著增强大闸蟹自身对抗真菌病的免疫力， 应用本发明方法处理后的大闸蟹幼苗面对相关病原菌侵害时能够表现出明显的抗病能力，免疫保护率达到74%。

应用二：通过投喂大闸蟹带有离壶菌代谢产物的饵料，提升大闸蟹的免疫力。

进一步的，通过将离壶菌代谢产物加入饵料中投喂于阳澄湖大闸蟹以高抗真菌病免疫力，投喂时间至少提前于疫病高发期 3～4天，每天投喂2次共投喂6次，其中离壶菌代谢产物与饵料的比例为0.1-10：100（本实施例为1：100）。拌饵处理同样可以是在大闸蟹的全生育期施用，但经过观察和长期研究，在周边地区发生相应病害前使用的效果更好。

上述的离壶菌代谢产物之所以具有提高大闸蟹免疫能力的效果，在研究中发现，饲喂大闸蟹离壶菌代谢产物后一定时间内，阳澄湖大闸蟹血清溶菌酶、超氧化物酶歧化酶（SOD），酚氧化酶（PO）活力均有所升高，同时，测得的免疫保护率74.4%，证明饲喂离壶菌代谢产物的确能够增强阳澄湖大闸蟹的免疫抗病能力。吞噬作用在甲壳动物免疫防御中具有极为重要的意义，在吞噬前、吞噬过程中和吞噬后，各种抗氧化酶、氧化酶和水解酶都发挥着重要的作用，其中关键性的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶，过氧化物酶等，而SOD是关键的抗氧化酶之一，是超氧自由基的天然消除剂，可以清除体内多余的自由基，使自由基的形成与消除处于一种动态平衡中，从而免除其对生物分子的损伤等.此外，SOD还具有抗菌、抗病毒、抗衰老等作用，已有研究发现，SOD活性与生物的免疫水平密切相关。因此，SOD可作为机体非特异性免疫指标，来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响。

实施例1：将离壶菌代谢产物通过饲料投喂，进而检测大闸蟹血清溶菌酶活力，SOD活性，酚氧化酶活力检测大闸蟹免疫力。

将健康阳澄湖大闸蟹转塘河蟹养殖场，规格为50g左右，饲养于实验室中120cmX80cmX80cm的水族箱内，箱内放入适量的水草、瓦片等，每一水族箱内放养15只，每组三只水族箱；水温25-28℃,暂养一周后开始实验。每天09:00和16：30各投喂1次，投喂量约为蟹体重的3%（含蛋白量3%）连续投喂3天。以清水作对照，每个处理用30只螃蟹。处理24h，48h，72h，96h后，分别统计大闸蟹剩余存活个体数处理后的实验结果如下表所示。

血清的制备分别取正常的和投喂离壶菌代谢产物的12，24，36，48，72，96，120，144h的大闸蟹，自第二关节处折断取血淋巴，置于Eppendorf离心管中4℃过夜，然后低速离心使血清析出。

溶菌酶活力的测定以溶壁微球菌冻千粉为底物，按Hultmark等人的方法进行。将底物用0.lmol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.4）配成底物悬液，取3mL该悬液5mL待测血清于试管中混匀，测其A值。然后将试管移入37℃水浴中保温30min，取出后立即放入冰浴中10min终止反应，测其A值。溶菌活力U按下式计算：U＝（Ao--A）÷A式中U为溶菌活力；Ao为反应前光密度值；A为反应后光密度值。

超氧化物酶歧化酶SOD活力的测定参照邓碧玉等的连苯三酚自氧化法进行。

酚氧化酶（PO）活力的测定分别取正常的和饲喂离壶菌代谢产物后3，6，12，24，36，48，72，96，120，144，168，192h的大闸蟹，抽取血淋巴液，测定其血清的PO活力，测定方法参照王雷等的进行。

如图2所示，溶菌酶活力：大闸蟹经投喂离壶菌代谢产物后，不同时间采样测得的溶菌酶的活力（U）分别为0.128（12h），0.167（24h），0.224（36h），0.256（48h），0.281（72h），0.223（96h），0.197（120h），0.142（144h），对照组均值为0.0904。中华绒鳌蟹血清溶菌酶活力（U）随着受免时间的延长而逐渐升高，至72h时达到最大，随后逐渐减弱，经t检验（P<0.05），差异显著。

如图3所示，超氧化物酶歧化酶（SOD）活力：大闸蟹经投喂离壶菌代谢产物后，不同时间采样测得的超氧化物酶歧化酶（SOD）的活性分别为129.5（12h），180.6（24h），223.8（36h），265.7（48h），279.9（72h），249.3（96h），218.2（120h），191.4（144h），对照组均值为118.2。超氧化物酶歧化酶（SOD）的活性随着受免时间的延长而逐渐升高，至72h时达到最大，随后逐渐减弱，经t检验（P<0.05），差异显著。

如图4所示，酚氧化酶（PO）活力：大闸蟹经投喂离壶菌代谢产物后，不同时间采样测得的酚氧化酶的活力（U）分别为134.1（12h），145.9（24h），167.0（36h），179.1（48h），151.3（72h），132.4（96h），128.6（120h），120.3（144h），对照组均值为116.9。大闸蟹血清酚氧化酶活力（U）随着受免时间的延长而逐渐升高，至48h时达到最大，随后逐渐减弱，经t检验（P<0.05），差异显著。

上述技术方案主要列举了幼蟹浸泡法，成蟹饲喂法等应对疫病上的应用，但经过实验和观察，离壶菌代谢产物对提高大闸蟹的应激能力、提高大闸蟹应对不良环境能力提升其成活率也有显著效果，因此，离壶菌代谢产物在提高大闸蟹应对其他疾病上具有普适性，是一种极具应用潜力和研究价值的阳澄湖大闸蟹抗真菌病制剂。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种离壶菌代谢产物在提升阳澄湖大闸蟹抗真菌病的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过对阳澄湖大闸蟹幼苗苗体进行浸泡处理以提高抗真菌病免疫力，其包括以下步骤：

（1）、将离壶菌代谢产物以清水稀释至5ppm～40ppm；

（2）、用稀释后的离壶菌代谢产物液体对阳澄湖大闸蟹幼苗进行浸泡处理，浸泡时间为10min-15min，一天浸泡一次，共浸泡3次。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将离壶菌代谢产物加入饵料中投喂于阳澄湖大闸蟹，投喂时间至少提前于疫病高发期 3～4天，每天投喂2次共投喂6次，其中离壶菌代谢产物与饵料的比例为0.1-10：100。

4.一种离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A、从患病大闸蟹体内分离离壶菌，然后进行培养；

步骤B、挑取少量菌体接种到摇瓶液体培养基中进行种子发酵和振荡培养；

步骤C、将种子摇瓶接入发酵罐进行至少2级发酵；

步骤D、发酵完成后加入0.5M Tris HCl缓冲液保护代谢产物，然后进行破壁；

步骤E、对菌体细胞破壁的菌液破碎液通过200目筛网过滤，去除残渣、菌丝体细胞壁组织，保留菌液破碎液，然后添加载体填料助剂并干燥。

5.根据权利要求4所述离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤：取濒死病蟹，用无菌水冲洗干净后再用75%酒精棉球反复擦洗病蟹体表及步足，打开甲壳，分别取血淋巴、肝胰腺、腹水、肌肉等组织于普通营养琼脂平板上作划线分离，在16-43℃培养18h -24h，待平板上长出形态一致的优势菌落后，挑选单个优势菌落再次划线，然后将分离好的菌体接种于普通营养琼脂培养基并于16-43℃下培养24h。

6.根据权利要求4所述离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，所述步骤B中摇瓶液体培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉3.0-5.5%，牛肉膏1.0-4.5%，糖0.1-1.0%，硫酸铵0.01-1.00%，代谢产物产生诱导剂0.01-1.00%，代谢产物激活剂I 0.01-0.50%，代谢产物激活剂II 0.01-0.50%，其余为水。

7.根据权利要求4所述离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，所述步骤C中1级发酵包括以下步骤：将种子摇瓶接入50L发酵罐进行发酵，其中培养基装液量为65%、灭菌温度121℃，30min，发酵培养温度为28-32℃，PH为6.0-7.2，发酵时间36h；2级发酵包括以下步骤：菌种经过50L发酵罐发酵后接入500L发酵罐进行发酵，其中培养基装液量70%、灭菌温度121℃，30min，发酵培养温度为28-32℃，PH为6.0-7.2，发酵时间为10-70h。

8.根据权利要求7所述的离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，1级发酵时培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉3.0-5.5%，牛肉膏1.0-4.5%，糖0.1-1.0%，硫酸铵0.01-1.00%，代谢产物产生诱导剂0.01-1.00%，代谢产物激活剂I 0.01-0.50%，代谢产物激活剂II 0.01-0.50%，余量为水；2级发酵时培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉3.0-5.5%，牛肉膏1.0-4.5%，糖0.1-1.0%，硫酸铵0.01-1.00%，代谢产物产生诱导剂0.01-1.00%，代谢产物激活剂I 0.01-0.50%，代谢产物激活剂II 0.01-0.50%，余量为水。

9.根据权利要求4-8任一项所述离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，步骤E中，载体填料助剂以质量百分比计包括生化黄腐酸30-40%，白炭黑10-15%，腐植酸25-40%，有机硅3-9%，代谢产物吸附剂4-9%、代谢产物保护剂3-6%和代谢产物稳定剂2-7%。

10.根据权利要求4-8任一项所述的离壶菌代谢产物的制备方法，其特征在于，步骤E中干燥包括如下步骤：菌液破碎液加入载体和填料后进入离心式喷雾干燥器干燥形成细度100目-200目粉状成品，其中物料进口温度为180-200℃，出口温度为70-80℃。

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