CN111685229B - 一种微生态复合添加剂及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种包含枯草芽孢杆菌DN02的微生态复合添加剂及其在水产养殖中的应用。所述枯草芽孢杆菌DN02筛选自凡纳滨对虾肠道，保藏编号为CCTCC NO:M2020091，能够显著抑制病原菌，提高水产动物的免疫力和抗病力，产生蛋白酶及淀粉酶提高饲料消化利用，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。

Description

一种微生态复合添加剂及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种包含枯草芽孢杆菌的微生态复合添加剂及其在水产养殖中的应用。

背景技术

我国是渔业大国，水产养殖已经成为我国主要的食品供给来源之一，水产品具有营养价值高，口味鲜美，有益人体等特点，并且随着国民经济的快速发展，生活水平的不断提高，人们对水产品的需求量日益增加，同时水产品贸易国际化发展，促进了我国水产养殖规模的不断扩大。但是，高密度、集约化养殖为主的水产养殖模式产生了许多问题，如水体富营养化、水质恶劣，各种疾病的爆发等，给水产养殖业带来了巨大的经济损失。传统防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素的应用有效地控制了许多水产疾病的发生，提高了经济效益和社会效益。但是，抗生素的应用也给人类和养殖业带来了许多副作用，并且日益严重，已受到许多方面的关注。抗生素使用易产生耐药性菌株问题，并且存在水产动物体内残留的问题，影响水产品食品安全，因此抗生素替代成为必然。

益生菌能够参与动物体内微生物平衡，直接通过增强动物对肠内有害微生物群落的抑制作用，或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，进而间接起到促进动物生长的作用，提高动物饲料的转化率。来源于养殖动物本身及养殖环境的益生菌在改善养殖水环境、抑制病原微生物的生长、改善养殖动物的健康状况、促进动物生长、提高饲料利用率等方面的作用突出。因此，近些年对于益生菌的筛选成为本领域内的研究热点。

在生产实践中，益生菌通常作为饲料添加剂直接添加到饲料中或者直接使用到池塘中，益生菌通常通过改善养殖动物消化道菌群平衡、促进养殖动物的生长、提高机体的免疫力及对病原微生物的抵抗能力、提供消化酶提高饲料利用率、改善水质等途径，来发挥益生菌的有效作用，但是并不是所有的益生菌菌株都具有这些方面的有益作用，筛选适用于水产养殖的多功能高效益生菌对水产饲料改进具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及包含该菌株的微生态复合添加剂。所述枯草芽孢杆菌筛选自凡纳滨对虾肠道，能够显著抑制病原菌，提高水产动物的免疫力和抗病力，产生蛋白酶及淀粉酶提高饲料消化利用，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。

本发明一方面涉及一种微生态复合添加剂，包含益生菌、益生元和复合维生素。

所述的益生菌为枯草芽孢杆菌DN02(Bacillus subtilis DN02)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2020091。

所述的益生元由低聚木糖和壳寡糖组成。

所述的益生元中低聚木糖和壳寡糖的质量比为5-10:1。

所述的复合维生素由维生素A、维生素E、维生素C和维生素B6组成。

所述的复合维生素中维生素A、维生素E、维生素C和维生素B6的重量比为4-10：3-7：8-12：0.8-1.2。

所述的微生态复合添加剂中各组分及其含量分别为：枯草芽孢杆菌DN02菌粉10-20g/kg，低聚木糖25-50g/kg，壳寡糖5-6g/kg，维生素A 20-50g/kg，维生素E 15-35g/kg、维生素C 40-60g/kg，维生素B6 4-6g/kg，稻壳粉800-860g/kg。

进一步优选地，所述的微生态复合添加剂中各组分及含量分别为：枯草芽孢杆菌DN02菌粉20g/kg，低聚木糖25g/kg，壳寡糖5g/kg，维生素A 50g/kg，维生素E 20g/kg、维生素C 60g/kg和维生素B6 4.5g/kg，稻壳粉815.5g/kg。

所述枯草芽孢杆菌DN02菌粉中活菌量为10¹⁰CFU/g。

本发明还提供了上述微生态复合添加剂在水质净化中的应用。

本发明还提供了上述微生态复合添加剂在水产养殖中的应用。

本发明的有益效果：

本发明筛选到的枯草芽孢杆菌DN02对金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌四种病原菌均有很强的抑制作用，能有效减少养殖动物病害发生的几率；具有较好的产酶能力，尤其是产蛋白酶能力突出，蛋白酶酶活高达1532.5U/g，淀粉酶和纤维素酶的产量也较高，酶活分别达到89.9U/g和162.4U/g，可广泛用于饲料原料及水产全价饲料的发酵处理，高效分解大分子营养物质，提高饲料消化率。

枯草芽孢杆菌DN02在对虾肠道内的粘附率高达47.81％，能有效定植于宿主肠道上皮，发挥其生物学特性，抑制病原菌入侵感染、产生消化酶等。

枯草芽孢杆菌DN02可作为饲料添加剂，显著促进对虾生长，有效提高饲料利用率，同时提高对虾的免疫力及对病毒的抵抗能力。其中，与对照组相比，添加了枯草芽孢杆菌DN02的益生菌组对虾的特定生长率提高了19.5％，饲料系数降低了21.5％，益生菌组对虾中蛋白酶和淀粉酶活性分别提高了49.9％和91.0％，酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性分别提高了178.5％和71.3％；病毒感染17天后益生菌组累计死亡率仅为21.6％，显著低于对照组。

枯草芽孢杆菌DN02还可以广泛应用于养殖水体的净化，高效降解养殖水体中的氨态氮和硝态氮。DN02菌粉处理48h后，对虾养殖废水中氨态氮的去除率高达96.5％，亚硝态氮的去除率高达97.1％，效果非常显著

本发明提供的含枯草芽孢杆菌DN02的微生态复合添加剂能显著提高养殖动物肠道中的消化酶活性，促进其对饲料的吸收利用，从而促进养殖动物生长，提高其免疫力和全周期存活率。其中，添加微生态复合添加剂的实验组鲤鱼的增重率提高了41.4％-53.7％，其肠道中胰蛋白酶活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性分别提高了28.6％-58.0％、14.5％-22.8％、70.3％-103.1％，攻毒7天内，对照组鲤鱼累计死亡率高达83.2％，而实验组累计死亡率仅有20.1％-26.3％；添加微生态复合添加剂的实验组对虾幼体的成活率提高了28.7％-54.2％，实验组对虾幼体全虾匀浆上清液酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性分别提高了38.2％-53.9％、16.4％-24.9％，效果非常显著。

此外，本发明提供的含枯草芽孢杆菌DN02的微生态复合添加剂还能净化养殖水体，保持养殖水体的洁净稳定。其中，实验组对虾养殖水体中的氨态氮和亚硝态氮含量比对照组分别降低了67.6％-76.1％、75.0％-87.5％，取得了意料不到的技术效果。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌DN02液体发酵培养产蛋白酶曲线；

图2为枯草芽孢杆菌DN02生长曲线。

具体实施方式

本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

实施例中涉及的培养基配方如下：

2216E海水培养基：蛋白陈5g，酵母浸出物1g，磷酸铁0.01g，海水1000ml，pH7.6-7.8，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121℃灭菌20min。

TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤30g，氯化钠15g，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6，配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121℃灭菌20min。

MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐温-80lml，磷酸二氢钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.15g，蒸馏水1000ml，pH6.2-6.4，加入15-20g的琼脂以配制固体培养基，115℃灭菌20min。

本发明实施例中涉及枯草芽孢杆菌DN02菌粉，其制备方法为：将枯草芽孢杆菌DN02进行活化，扩大培养，经液态发酵、喷雾干燥制成活菌量约为10¹⁰CFU/g的菌粉。

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1菌株的分离、筛选与鉴定

1、样品

采集于青岛市胶州对虾养殖场凡纳滨对虾肠道。

2、筛选方法

取对虾肠道，加入无菌生理盐水，28℃，150rpm振荡摇匀1h，使细菌充分散布于生理盐水中，10倍梯度稀释，分别接种于2216E、TSB和MRS固体培养基上，28℃培养24h-48h。选取均匀清晰的单菌落，划线纯化细菌。将获得的单菌落依此命名为DN01、DN02、DN03、……、DN32。

3、对虾消化道共生菌的生物特性分析

共生菌(待测菌株)和病原菌(对照菌株)经斜面活化培养，加入适量生理盐水，制成浓度为10^4-7cells/ml的菌悬液，注射给予健康凡纳滨对虾。其中，鳗弧菌作为强毒对照菌株，粘质沙雷氏菌作为弱毒对照菌株，通过累计死亡率的统计和比较，分析对虾共生菌活菌的生物特性。结果显示：多数菌株不同剂量均与生理盐水注射组无显著性差异，部分菌株高剂量有弱毒性，选择安全、没有毒性的菌株进行下一步抗病菌株筛选。

4、对虾病原菌拮抗菌的筛选

以致病菌作为指示菌，采用平板拮抗法筛选益生菌。在涂有指示菌的平板上分别点种待筛选的细菌菌液，28℃恒温培养，48h内观察点种区周围是否出现抑菌透明区或覆盖区。

结果显示，申请人从凡纳滨对虾肠道分离的15株共生菌中有4株菌对对虾病原菌有明显的拮抗作用。体外拮抗试验结果如表1所示，抑制作用表示为抑菌圈直径与菌落直径的比值，1表示没有抑制作用，1-2表示抑制作用一般，>2表示抑制作用较强。

表1潜在益生菌对病原菌的拮抗作用

菌株	金黄色葡萄球菌	鳗弧菌	哈维氏弧菌	副溶血弧菌
					DN02	2.76±0.05	3.18±0.08	3.26±0.10	3.38±0.07
DN04	2.35±0.03	1	2.98±0.06	1
					DN09	2.93±0.06	3.07±0.10	1	1
DN25	2.53±0.06	1	1	2.55±0.07

从表1的数据可以看出，本发明筛选到的4株拮抗菌中，DN02菌株对金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌四种病原菌均有很强的抑制作用，效果显著；而DN04、DN09、DN25这三株菌株只对其中的两种病原菌有明显的抑制效果。

4、菌株鉴定

(1)形态学观察

将上述DN02菌株涂布平板，培养24h后观察菌落形态、颜色、大小、质地、边缘等。同时进行染色(革兰氏染色+芽孢染色)，油镜观察菌体形态特征。

DN02菌株菌落形态类似圆形，乳白色，边缘波浪形，有褶皱，表面粗糙不透明，染色观察呈短杆状，革兰氏阳性菌，能形成芽孢。

(2)分子生物学鉴定

提取DN02菌株基因组DNA，对其16S rRNA基因进行扩增。所用引物分别为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和GGTTACCTTGTTACGACTT。将扩增产物进行测序分析。将测序分析结果与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的基因序列进行比对。结果显示：DN02菌株16S rRNA基因与已公布的枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度高达99.2％，鉴定证实DN02菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将其命名为枯草芽孢杆菌DN02(Bacillus subtilis DN02)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2020091。

实施例2枯草芽孢杆菌DN02产酶能力测定

1、潜在益生菌产酶能力定性实验

分别配置产蛋白酶定性培养基、产淀粉酶定性培养基、产纤维素酶定性培养基，将筛选出的病原菌拮抗菌进行活化，将各菌株的液体培养物用无菌接种棒点种于不同培养基上，恒温培养48h，形成明显菌落后观察。菌株产蛋白酶分解酪素则平板上出现透明圈；淀粉培养基需滴加卢戈氏碘液，菌株产淀粉酶则蓝紫色平板上出现透明圈；产纤维素酶定性培养基需用刚果红染色，再用NaCl冲洗，菌落产纤维素酶分解纤维素钠则出现透明圈。观察并记录平板上产显色圈情况，产酶能力表示为透明圈直径与菌落直径的比值，-表示菌未生长，1表示不产生酶，1-2表示产酶能力一般，>2表示产酶能力较强。

表2益生菌产酶能力测定

菌株	产蛋白酶能力	产淀粉酶能力	产纤维素酶能力
				DN02	2.57±0.12	4.63±0.11	3.38±0.14
DN04	-	1	1.89±0.08
				DN09	1.95±0.11	2.05±0.09	2.37±0.10
DN25	2.73±0.07	2.86±0.04	1

从表2的结果可以看出，枯草芽孢杆菌DN02具有较好的产酶能力，在淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶产量方面均超过其他菌株，效果显著。

2、枯草芽孢杆菌DN02固体培养条件下产酶定量测定

选择常用的饲料原料麸皮进行固体培养测定。接种活化枯草芽孢杆菌DN02，调节菌液浓度5×10⁷cfu/mL，接种到灭菌的麸皮固体发酵培养基，培养48h。取培养好的固体培养物2.5g，加入不同pH磷酸缓冲液25ml振荡30min后，离心取上清液，测定蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶酶活。测定方法分别参照标准GB/T 28715-2012、GB/T 24401-2009、NY/T 912-2004。蛋白酶活定义为在pH 7.2,37℃条件下，1min水解酪蛋白产生lμg酪氨酸为一个酶活力单位(U)。淀粉酶活定义为在pH6.0、37℃条件下，1h液化1g可溶性淀粉即为一个酶活力单位(U)。纤维素酶活定义为在pH 5.5、37℃条件下，每分钟水解浓度为4mg/mL羧甲基纤维素钠释放1μmol还原糖为一个酶活力单位(U)。

结果显示，本发明提供的枯草芽孢杆菌DN02在麸皮固体培养条件下产蛋白酶能力突出，蛋白酶酶活高达1532.5U/g，淀粉酶和纤维素酶的产量也较高，酶活分别达到89.9U/g和162.4U/g，取得了意料不到的技术效果。所述枯草芽孢杆菌DN02可广泛用于饲料原料及水产全价饲料的发酵处理，在提供活性菌株益生特性的同时，能够高效分解大分子营养物质，提高饲料消化率。

3、枯草芽孢杆菌DN02液体培养条件下产蛋白酶水平

接种活化枯草芽孢杆菌DN02，取活化好的菌液5ml，接种于液体发酵培养基中，37℃培养，24h开始取样，每隔12h取样一次。参照GB/T 28715-2012方法测定上清液中蛋白酶酶活，以U/ml表示。

结果如图1所示，枯草芽孢杆菌DN02在液体培养条件下产蛋白酶能力较强24-60h产蛋白酶能力持续升高，60-96h蛋白酶产量趋于稳定，其发酵上清液中蛋白酶酶活最高可达2015.6U/ml，效果显著。

综上，本发明提供的枯草芽孢杆菌DN02在固体培养和液体培养条件下均表现出显著的高产蛋白酶能力，因此，该菌株可广泛应用于蛋白原料预处理，在养殖生产中有效提高蛋白利用率。

实施例3枯草芽孢杆菌DN02生长性能评估

将枯草芽孢杆菌DN02按照1％的接种量接种至液体发酵培养基中，30℃，180r/min，振荡培养，每2h定时取样，测定菌液的OD 600值，具体结果见图2。

如图2所示，枯草芽孢杆菌DN02生长曲线呈阶段性变化，其迟滞期较短，4h后进入指数生长期，OD值呈快速增长趋势，10-28h都处于稳定期。同时，该菌在培养8h时产生芽孢，芽孢浓度达到10⁸CFU/mL。DN02生长延滞期短、稳定期长的特性非常适合进行发酵工业开发。

实施例4枯草芽孢杆菌DN02肠道粘附能力测定

取凡纳滨对虾肠道，轻轻挤压出肠内容物，用棉线将肠道两端扎紧，将肠道在PBS缓冲液中浸泡30min，并侧剪开肠道，用无菌载玻片刮取肠道粘液，PBS缓冲液缓慢冲洗肠粘液3次，吸取1000μL枯草芽孢杆菌DN02菌液加入肠道粘液中，30℃静置培养，2h后再次用PBS缓冲液缓慢冲洗3次，将肠粘液稀释涂布，平板计数。以正常培养DN02为对照组。

粘附率＝粘附后菌体数量/对照组菌体数量×100％。

结果显示，粘附性是益生菌重要的益生特性，粘附能力是益生菌定植于宿主肠道上皮的第一步。结果显示，枯草芽孢杆菌DN02在对虾肠道内的粘附率为47.81％，说明枯草芽孢杆菌DN02进入对虾肠道内，将有47.81％的菌体粘附在肠道，发挥其生物学特性，抑制病原菌入侵感染、产生消化酶等，对宿主产生积极的影响。

实施例5枯草芽孢杆菌DN02净水能力测定

先将对虾养殖池养殖污水(其中氨态氮初始浓度为4.52mg/L，亚硝态氮初始浓度2.06mg/L)进行灭菌，冷却后用250mL三角瓶分装，装液量100mL，分别设置空白对照组和DN02处理组，每组3个平行。处理组按5ppm向水体中投加枯草芽孢杆菌DN02菌粉(10¹⁰CFU/g)，空白对照组不投菌。处理48h后，分别检测对照组和处理组水体中亚硝态氮和氨态氮含量，计算去除率。结果见表3和表4。

去除率＝(初始浓度-终止浓度)/初始浓度×100％。

表3处理48h后对虾养殖污水中氨态氮的去除情况

组别	初始NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N(mg/L)	终止NH<sub>4</sub><sup>+</sup>-N(mg/L)	去除率
				对照组	4.52±0.13	4.44±0.32	1.77％
实验组	4.52±0.13	0.16±0.05	96.5％

表4处理48h后对虾养殖污水中亚硝态氮的去除情况

组别	初始NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N(mg/L)	终止NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N(mg/L)	去除率
				对照组	2.06±0.24	1.14±0.02	2.56％
实验组	2.06±0.24	0.06±0.05	97.1％

从表3和表4的结果可以看出，采用本发明提供的枯草芽孢杆菌DN02菌粉处理48h后，对虾养殖废水中氨态氮的去除率高达96.5％，亚硝态氮的去除率高达97.1％，净水效果非常显著。从而说明，枯草芽孢杆菌DN02能高效降解养殖水体中的氨态氮和硝态氮，有效净化养殖水体，有助于提高养殖户的经济效益，并保持良好的水体环境。

实施例6枯草芽孢杆菌DN02对对虾生长、免疫及抗病力的影响

实验设对照组和益生菌组，每组分别设置三个平行，每个平行对虾60尾。其中，对照组饲喂基础饲料，益生菌组是在基础饲料中按1‰的质量比添加上述实施例5制备得到的枯草芽孢杆菌DN02菌粉(10¹⁰CFU/g)，混合均匀投喂对虾。养殖实验期间每天投饵两次，溶氧≥7mg/l，温度29±l℃，pH 8.0±0.3。

养殖实验结束后，对对虾进行计数并称重，计算其特定生长率。每个平行中随机取样抽血，分别测定免疫及消化相关酶活力。同时，选取30尾对虾进行白斑综合征病毒人工感染实验。感染实验前通过预实验确定合适的病毒浓度1×10^-5。病毒以PBS缓冲液稀释，用1ml无菌注射器经腹腔注射对凡纳滨对虾进行感染，50μl/尾，以注射等量PBS缓冲液组作为空白对照组。攻毒后分别继续投喂实验饲料或基础饲料(对照组和空白对照组)，持续17d。攻毒实验期间日常管理同养殖实验，及时捡出死亡对虾，同时记录死亡时间和死亡数量。攻毒实验结束后，统计累计死亡率，评价抗病效果。具体结果详见表5。

表5枯草芽孢杆菌DN02对凡纳滨对虾生长、消化及免疫的影响

组别	对照组	益生菌组
			特定生长率	21	25.1
饲料系数	1.58	1.24
			蛋白酶(U/ml)	19.17	28.73
淀粉酶(U/ml)	4.79	9.15
			酚氧化酶(U/ml)	6.5	18.1
超氧化物歧化酶(U/ml)	174	298
			病毒感染实验累计死亡率	89.5％	21.6％

从表5的数据可以看出，与对照组相比，添加了枯草芽孢杆菌DN02的益生菌组对虾的特定生长率提高19.5％，饲料系数降低21.5％，从而说明枯草芽孢杆菌DN02能显著促进对虾生长，有效提高饲料利用率；益生菌组对虾中蛋白酶和淀粉酶活性分别提高了49.9％和91.0％，酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性分别提高了178.5％和71.3％，病毒感染17天后益生菌组对虾的累计死亡率仅为21.6％，显著低于对照组，从而说明本发明所述枯草芽孢杆菌DN02可以有效提高对虾的免疫力及对病毒的抵抗能力，因此可以作为益生菌广泛应用于对虾的养殖生产过程中。

综上，本发明提供的枯草芽孢杆菌DN02既能有效抑制水产病原菌，减少养殖动物病害发生的几率；同时该益生菌能高产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，可广泛用作饲料添加剂，提高养殖动物对饲料的利用率，促进养殖动物生长，提高养殖动物的免疫力和抗病能力。另外，该菌能够有效净化养殖水体，有助于提高养殖户的经济效益，并保持良好的水体环境。

本发明提供的枯草芽孢杆菌DN02可以单独作为添加剂，还可以与其他添加剂，例如多糖类免疫增强剂、维生素类、中草药等进行复配，应用于鱼类、虾蟹等水产动物的饲料中，应用前景广阔。

实施例7

一种微生态复合添加剂，每公斤添加剂中含有：枯草芽孢杆菌DN02菌粉10g，低聚木糖50g，壳寡糖5g，维生素A 25g，维生素E 35g、维生素C 50g和维生素B6 6g，稻壳粉819g。

实施例8

一种微生态复合添加剂，每公斤添加剂中含有：枯草芽孢杆菌DN02菌粉15g，低聚木糖40g，壳寡糖6g，维生素A 20g，维生素E15g、维生素C 40g和维生素B6 4g，稻壳粉860g。

实施例9

一种微生态复合添加剂，每公斤添加剂中含有：枯草芽孢杆菌DN02菌粉20g，低聚木糖25g，壳寡糖5g，维生素A50g，维生素E 20g、维生素C 60g和维生素B6 4.5g，稻壳粉815.5g。

实施例10微生态复合添加剂对鲤鱼生长及抗病力的影响

选用初始体重为76.55±0.95g的鲤鱼幼鱼，随机分配分为4组，每组设4个重复，每个重复50尾鱼。对照组T0：投喂基础饲料，实验组在基础饲料中按1‰的质量比添加微生态复合添加剂，T1添加为实施例7所述微生态复合添加剂，T2添加为实施例8所述微生态复合添加剂，T3添加为实施例9所述微生态复合添加剂。试验为期8周，期间水温26±1℃，溶氧保持在7.0mg/L以上。养殖实验结束后，随机选取25尾鱼，分别检测鲤鱼的增重率，以及肠道中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力，具体结果见表6。同时，随机选取25尾鱼，分别注射半致死浓度的嗜水气单胞菌进行攻毒实验，观察并计算死亡率。

表6微生态复合添加剂对鲤鱼生长性能的影响

从表6的数据可以看出，与对照组相比，添加微生态复合添加剂的实验组鲤鱼的增重率提高了41.4％-53.7％，其肠道中胰蛋白酶活性、淀粉酶活性、脂肪酶活性分别提高了28.6％-58.0％、14.5％-22.8％、70.3％-103.1％，效果非常显著(P<0.05)。从而说明，本发明提供的含枯草芽孢杆菌DN02的微生态复合添加剂能够显著提高鲤鱼肠道中的消化酶活性，促进鲤鱼对饲料的吸收利用，从而有效促进生长和发育。

此外，攻毒7天内，对照组累计死亡率高达83.2％，而添加微生态复合添加剂的实验组累计死亡率仅有20.1％-26.3％。从而说明，本发明提供的含枯草芽孢杆菌DN02的微生态复合添加剂能显著提高了鲤鱼的抗病力。

实施例11微生态复合添加剂对对虾幼体生长、免疫及水体水质的影响

实验在青岛市胶州对虾育苗场进行，实验用虾苗来自该育苗场同一池孵化的中国明对虾蚤状Ⅰ期幼体。对照组T0饲喂粗蛋白为45％，粗脂肪为11％的基础饲料，实验组在基础饲料中按2‰的质量比添加微生态复合添加剂，T1添加为实施例7所述微生态复合添加剂，T2添加为实施例8所述微生态复合添加剂，T3添加为实施例9所述微生态复合添加剂。

实验在控温育苗池中进行，保持各组间温度一致。幼体培育水体持续充气，水温保持在24±0.5℃，pH7.8-8.0，盐度17-18‰，投饵量根据幼体摄食情况、水质情况及剩余对虾数量进行调整。饲养实验持续15天。实验结束计数成活对虾尾数，计算中国明对虾幼体的成活率；采集幼体培育水体，测定水体中氨态氮的含量和亚硝态氮的含量；并随机取样测定全虾匀浆上清液酚氧化酶及超氧化物歧化酶活性，具体结果见表7。

表7微生态复合添加剂对对虾幼体生长、免疫及水体水质的影响

从表7的数据可以看出，与对照组相比，添加微生态复合添加剂的实验组对虾幼体的成活率提高了28.7％-54.2％(P<0.05)，并且实验组对虾幼体全虾匀浆上清液酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性分别提高了38.2％-53.9％、16.4％-24.9％，效果非常显著。从而说明，本发明提供的含枯草芽孢杆菌DN02的复合添加剂能显著促进养殖动物生长，提高其免疫力和全周期存活率。

此外，与对照组相比，添加微生态复合添加剂的实验组对虾养殖水体中的氨态氮和亚硝态氮含量分别降低了67.6％-76.1％、75.0％-87.5％。从而说明本发明提供的含枯草芽孢杆菌DN02的复合添加剂还能净化养殖水体，保持养殖水体的洁净稳定，从而更有益于促进水产动物的健康。

综上，本发明提供的微生态复合添加剂能显著提高养殖动物肠道中的消化酶活性，促进其对饲料的吸收利用，从而促进养殖动物生长，提高其免疫力和全周期存活率，同时所述微生态复合添加剂还能净化养殖水体，有助于提高养殖户的经济效益，应用前景广阔。

Claims (8)

1.一种微生态复合添加剂，其特征在于，所述微生态复合添加剂包含益生菌、益生元和复合维生素；所述的益生菌为枯草芽孢杆菌DN02（Bacillus subtilis DN02），其保藏编号为CCTCC NO: M 2020091。

2.如权利要求1所述的微生态复合添加剂，其特征在于，所述的益生元由低聚木糖和壳寡糖组成。

3.如权利要求2所述的微生态复合添加剂，其特征在于，所述的益生元中低聚木糖和壳寡糖的质量比为5-10:1。

4.如权利要求3所述的微生态复合添加剂，其特征在于，所述的复合维生素由维生素A、维生素E、维生素C和维生素B6组成。

5.如权利要求4所述的微生态复合添加剂，其特征在于，所述的微生态复合添加剂中各组分及其含量分别为：枯草芽孢杆菌DN02菌粉10-20g/kg，低聚木糖25-50g/kg，壳寡糖5-6g/kg，维生素A 20-50g/kg，维生素E 15-35g/kg、维生素C 40-60g/kg，维生素B6 4-6g/kg，稻壳粉800-860 g/kg。

6.如权利要求5所述的微生态复合添加剂，其特征在于，所述的微生态复合添加剂中各组分及其含量分别为：枯草芽孢杆菌DN02菌粉20g/kg，低聚木糖25g/kg，壳寡糖5g/kg，维生素A 50g/kg，维生素E 20g/kg、维生素C 60g/kg和维生素B6 4.5g/kg，稻壳粉815.5 g/kg。

7.如权利要求5或6所述的微生态复合添加剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌DN02菌粉中活菌量为10¹⁰CFU/g。

8.权利要求1-7任一所述的微生态复合添加剂在水质净化中的应用。

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