CN103966145A - 一株乳酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株乳酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用，乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）LB-Y301，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCCNO：M2014143。所述的乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用。本发明采用了低能N+注入技术，利用筛选平板进行初筛，得到的菌株进行发酵复筛，逐渐提高抑菌多肽的产量，最终获取产量提高了50%的乳酸乳杆菌LB-Y301，该菌株可以大大提高抑菌的效果，在500L发酵罐中，抑菌多肽较出发菌提高了54%,极大地提高了其应用及市场价值。

Description

一株乳酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株乳酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用。

背景技术

由于各种微生物的性质及代谢方式不同，而分为有益微生物与有害微生物，有害的微生物对有机物质发生氧化作用，造成食品变质、发霉、器具腐烂、中毒现象，这一过程，是病原微生物和腐败菌活化生长的结果；而微生物活菌剂是有益的有效的微生物群，能合成抗氧化物质，能抑制和杀死病原微生物和腐败菌。就人体来说它可以消除氧自由基（游离基），杜绝病源，延缓细胞衰老，激活T细胞，分解亚硝基化合物及其他有机致癌物质，抑制病菌、病毒及癌细胞生长，调节人体血脂水平。活性益生菌片就人体来说，它具有类似SOD酵素的作用，可以消除氧自由基（游离基），杜绝病源，延缓细胞衰老，激活T细胞，分解亚硝基化合物及其他有机致癌物质，通过益菌抑菌的原理来抑制病菌、病毒及癌细胞生长，调节人体血脂水平，减少血管壁脂肪沉积，从而恢复自然自愈力，增强和提高免疫功能，使人体各种疾病奇迹般地好转或康复。同时“活性益生菌”中微生物的分泌物如氨基酸、活性抗菌小肽、有机酸、寡聚多糖类、各种维生素、抗生物质和抗病毒物质，各种生化酶和氧（活性氧还原成分子氧）等，既可直接调正各器官功能，又可增加营养，从而改善体内微生态平衡。“活性益生菌”不仅是各种疾病生存的克星，也是各种污染的克星。试想，如果家家户户都能用“活性益生菌”自我保健，不仅人人健康，无数微生物也将会通过家里的下水道进入江河湖泊，那将是一场多么壮观的“清洗地球”的景象！快给我们的肠道多一些活性益生菌吧！快给我们的地球增加一些健康吧！

有益菌群五大科目：

1 、光合菌群：光合菌群（好氧性和厌氧性）属于独立营养微生物，它能利用土壤接受的太阳热能或以紫外线为能源，将土壤中的硫化氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸、维生素类、氮素化合物和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。光合菌的代谢物质或者被植物直接吸收，或者成为其它微生物繁殖的养分，光合细菌如果能够增殖，其它的有益微生物也会增殖。

2 、乳酸菌群： 乳酸菌（厌氧型） , 它以摄取光合细菌酵母菌产生的糖类等物质为基础，产生乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质转化成对动植物有效的养分。乳酸菌还能有效抑制连作障碍产生的致病菌增殖。

3 、酵母菌群： 酵母菌（好氧型）利用氨基酸、糖类及其它有机物质，通过发酵，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌在 “百丰生态菌” 集团军中对于促进其它的有效微生物增殖所需要的基质（食物）的生产提供重要的营养保障。此外，酵母菌生产的单细胞蛋白是动物不可缺少的有效养分。

4 、革兰氏阳性放线菌群（好气性）。 它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。

它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和 VA 菌根菌增殖。

5 、发酵系的丝状菌群（嫌气性）。 以发酵酒精时使用的曲霉菌属为主体，它能和其他微生物共存，尤其对土壤中酯的生成有良好效果。因为酒精生成力强，能防止蛆和其他害虫的发生，并可以消除恶臭。

由上可见，各类微生物都各自发挥着重要作用，核心作用是光合细菌和乳酸菌为主导，其合成能力支撑着其他微生物的活动，同时也利用其他微生物产生的物质，形成共生共荣的关系，保证状态稳定，功能齐全，发挥出集团军作战的强大能量。菌群的主要功能是造就良性生态。只要施用恰当，它就会与所到之处的良性力量迅速结合，产生抗氧化物质，清除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，形成适于动植物生长的良好环境，同时，它还产生大量易为动植物吸收的有益物质，如氨基酸、有机酸、多醣类、各种维生素、各种生化酶、促生长因子、抗生素和抗病毒物质等，提高动植物的免疫功能，促进健康生长，从而在减轻劳动、降低成本、提高产量、改善品质，提前上市，使人们吃（用）上无污染的高质量产品的前提下，提高全社会的生产水平和生活质量，保护地球环境和人类美好的家园

益生菌是无法通过发酵工艺将好氧及厌氧微生物混合培养，各微生物在其生长过程中产生有用物质及其分泌物,形成相互生长的基质和原料，通过相互共生、增殖关系形成一个结构稳定、功能广泛的具有多种多样微生物群落的生物菌群，协同发挥作用。

微生物界有一个有趣的现象，即优势主导现象。不论是有益菌也好，有害菌也好，真正起主导作用的菌只是极小部分，绝大部分属中间观望型，谁占优势，它就跟谁走。施用了活菌的地方，有益菌很快占居优势地位，“领导”菌群向发酵、再生方向行动。其结果是：土壤中有益微生物活动增强，菌系丰富，肥力增加，作物生长发育更健壮；粪便臭味消除，污水变清；动物、家畜健康生长；生态环境变得更加生机勃勃┅┅

乳酸乳杆菌活性益生菌在农业上的机理作用：

乳酸乳杆菌属于乳酸杆菌(，Lacticacid bacteria)是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌，其DNA中G+C含量低于55%，可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)并产生大量乳酸，在自然界分布广泛，是动物和人肠道等处重要的生理性菌群之一。该类群细菌绝大多数对动物和人无毒、无害，负担着动物体内重要的生理功能。 在乳酸菌中，乳酸杆菌是最大的一个属，其定义为杆形乳酸杆菌。乳杆菌属与动物关系最密切，它是动物肠道和阴道中占优势的菌群之一。乳杆菌分布广泛，动物和人类从口腔到直肠始终都有该菌存在。乳酸杆菌己知的生理功能主要表现为：阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体免疫力，促进消化，合成氨基酸和维生素，降低胆固醇，抑制内毒素的生产，延缓衰老和抗辐射等。大量事实证明，只要肠道中乳酸杆菌的数量减少或丢失，出现菌群失调，就可能导致某种疾病的发生;只要肠道中乳酸杆菌的数量增加，区系得到平衡，就可以促进机体健康和治疗某种疾病。可见，增加机体肠道中乳酸杆菌的数量是预防和治疗某些疾病的一种重要措施。乳酸菌作为鱼类益生菌，在肠道内具有较好的定植能力，而且在水产动物中，这种定植无明显的宿主特异性。Ringoe应用从大西洋鲑分离的广布肉杆菌，研究在大菱鲆幼鱼肠道内的定植时，证明了这一点。Joborn 等用肉杆菌来研究其在虹鳟肠道内的定植和对鱼类病原菌的抑制作用，结果表明肉杆菌可以在虹鳟肠道内大量增殖并定植下来，但定植效果不佳，停喂肉杆菌3d后广布肉杆菌的数量明显下降。Rengpipat等用Bacillus 11养殖斑节对虾也得到类似的结果，抑制了水中弧菌数量的增长。由于抗生素、激素类药物在水产上的不合理使用，导致农药残留问题对人类健康造成了巨大威胁。水产养殖领域，人们越来越提倡生态养殖技术。美国在FDA(1989)规定的40多种饲用微生物中有近30种是乳酸菌。我国农业部在1994年批准使用的微生物品种有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳链球菌等，其中大部分为乳酸菌。乳酸菌耐酸，在pH为3.0-4.5时仍可生长，能适应胃肠内的酸性条件，饲喂后能在水产动物体内迅速定植，因此无疑是一种理想的微生物制剂。乳酸菌在水产中的应用大致可分为以下几个方面：

3.1 抑制病原菌，抗病害

乳酸菌能有效调整水产动物肠道的菌群平衡，通过营养竞争、附着位点竞争或分泌抗生素、细菌素等毒素杀死或抑制病原微生物，增强抗感染能力，调节机体肠粘膜的免疫活性，提高动物在遭受病害侵袭时的存活率。近年来，一些乳酸菌开始应用于水产养殖业，实践证明应用乳酸菌防治水生动物疾病是可行的。

陈营等从健康牙鲆肠道中分离得到多种乳酸菌，且体外实验表明对弧菌均有抑制作用。周海平为探明乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对水产养殖病害的生物防治功能，采用试管稀释法和平板抑菌圈检测法，探讨了乳酸杆菌代谢产物对沙蚕弧菌(Vibrio nereis)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、漂浮弧菌(Vibrio natriegen)的抑制能力，结果表明：乳酸杆菌对病原弧菌具有良好的抑制作用。

Jiravanichpaisal等报道了乳酸杆菌作为有益菌可以用来防止由发光细菌感染造成的斑节对虾的白点病。杨莺莺等研究乳酸杆菌L1对致病弧菌的抑制作用，证明乳酸杆菌及代谢物质对鲨鱼弧菌和溶藻弧菌具有协同抑制作用。杨勇等证明乳酸菌代谢产物对鳗弧菌的生长具有非常显著的抑制作用，该代谢产物对鳗弧菌的抑制效率在90%以上。姜英辉等研究了乳酸链球菌L3-18的培养及其对海洋弧菌的抑制作用。窦晓明就乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究表明，3株乳酸菌（命名为A-1，A-2，A-3）胞外产物对副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)有较强的抑制作用。

3.2 促进生长，提高免疫力

乳酸菌能分泌乳酸，产生多种消化酶，可帮助鱼类消化吸收，促进生长。Byurl等从鲆鱼分离并筛选出一菌株Lactobacillus sp.DS-12，它表现出强的抗菌活性，能抑制多种鱼体病原菌（如鳗弧菌、嗜水气单胞菌等）的生长，在2次各为期1个月的饲喂实验中，他们发现饲喂含有DS-12菌株的试验组，鱼的平均体重的增加均比对照组的快，揭示了乳酸菌同时拥有既抑菌又促生长的双重机能。Gildberg等用含有大西洋鳕鱼内脏提取出来的乳酸菌的饲料喂鳕鱼苗，3个月后将鱼苗放养在带有强致病弧菌的环境中，能够提高抗病率。Gatesoupe利用乳酸菌饲养的轮虫作为大菱鲆仔鱼的鲜活饵料，证明乳酸菌可以提高仔鱼对病原弧菌的抵抗力。Nikoskelainent等研究表明，给虹鳟投喂含有乳酸杆菌的饵料，可以提高它们的免疫力。桂远明等报道乳酸菌等微生物制剂对鲤具有促生长和提高抗病力作用。

3.3 净化养殖水体

向养殖水体投放有益菌（光合细菌、乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等）及有益酶（蛋白分解酶、纤维素酶、植酸酶等）的复合制剂，不仅促进饵料生物大量繁殖、生长，而且可分解鱼类残饵、粪便及水中有机质，改良水体环境，抑制水体中有害菌的繁殖生长，调节藻相平衡，控制有害菌藻。使用以乳酸菌为主的微生态制剂，可以有效降低水中的亚硝酸盐含量；而芽孢杆菌对于水体中氨态氮和有机物的分解作用比较明显，可降低水体中氨态氮、亚硝酸盐的含量，避免了传统肥料高耗氧、破坏和污染水质、高发病率的缺点。所以乳酸菌可与芽孢杆菌、光合细菌、反硝化菌等有益菌混合使用，作为养殖水体的水质调控剂，改善水中生态环境，净化水质，促进鱼虾类健康生长。

经现场与室内实验乳酸杆菌对养殖水体，饲料的降解作用进行了深入研究，结果表明，各实验组中的NO2--N、NO3--N、PO43-P从实验第1天到第4天一直处于下降趋势，而NH4+-N呈上升趋势，对COD无降解能力，温度、菌浓度、底物浓度对NO2--N、NO3--N、PO43-P、NH4+-N降解率的影响是极其显著的。 结果表明，芽孢杆菌结合乳酸杆菌使用，可以明显降低养殖水体氨氮等有害物质的含量。

目前市场上畅销的EM菌是由多种有益微生物组成的活菌制剂，在水产养殖上 既可用作水质净化、改良剂，保持水质稳定，又可作为饵料拌合剂，增强养殖品种的免疫力，促进养殖品种的健康生长，从而提高产量和效益。乳酸菌作为EM菌的主导菌应用于水质净化的效果良好。经实验在养殖池中使用EM菌，实验池溶氧量比对照池提高11.2%，NH4+-N和NO2--N含量分别降低了54%、55%，饵料系数降低8.2%。江苏赣榆罗阳用户用解毒益水露（水产EM）与水溶性腐植酸降低虾池PH效果明显，且不反弹。

4 应用前景

从目前的研究报道来看，乳酸菌对动物免疫有多方面的调节作用，能显著提高机体的免疫功能，尤其是在对病原菌的定植拮抗方面，这使对乳酸菌等益生菌研究成为当今生物技术的热门课题之一。

作为最有前途的抗生素替代品，乳酸菌正以其独特的优势影响着医药、食品、畜牧等多种产业的发展。乳酸菌在水产养殖中的应用前景是诱人的，完全有可能取代目前所用的抗生素、化学促生素，成为21世纪人们所接受的绿色微生物制剂。但是关于乳酸菌的研究在陆生动物中开展的较多，而在水产动物中的研究却刚刚起步，特别是乳酸菌对水产养殖环境的影响以及抗菌机理的基础研究还很少。所以要真正把乳酸菌这种潜能变成现实尚有一段距离，仍需要大量的研究投人。由于单一使用某一微生物都存在一些缺点，现在许多学者和生产厂家在试图利用不同菌株的不同特性，将多种微生物培育后复合为复合微生态制剂，以期发挥它们的综合作用。随着对其作用机制研究的不断深入，以及人们对绿色环保意识的不断增强，乳酸菌的应用前景会更加广阔。　　

在饲料行业的制粒工艺中，一般温度都会很高，80度到100多度不等。而乳酸杆菌不耐高温，通常情况下，40摄氏度的时候就开始死亡，43度时基本上全部死去，该问题迄今为止尚未得到有效解决，被称之为世界性难题。希望在未来的几十年中能得到有效的结果。

发明内容

为了解决目前益生菌高效抑菌作用，提高抑菌多肽的产生且抑制有害菌的生长，本发明提供了一株乳酸乳杆菌LB-Y301及其在发酵产抑菌多肽中的应用，通过诱变提高了乳酸乳杆菌LB-Y301发酵产物中抑菌多肽的产量，产量提高了50%。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）LB-Y301，已于2014年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2014143。

本发明所述的乳酸乳杆菌LB-Y301的筛选方法：原始出发菌株LB-101经过低能氮离子束注入后，平板筛选得到的菌株，摇瓶发酵复筛得到产物多肽浓度高的乳酸乳杆菌 ，为下一轮诱变菌株。重复上述步骤，直至获取目标菌株乳酸乳杆菌LB-Y301，具体步骤如下：

（a）单孢子悬浮液的制备：将出发菌株LB-101制成孢子悬浮液，浓度为1×10⁶个/ml；

（b）低能氮离子注入 ：取100μL孢子悬浮液，均匀涂布到无菌空平板上，以无菌风吹干，在20Kev能量下，40×10¹⁴ions/cm²剂量下进行氮离子诱变，离子注入完毕后，在无菌环境下用1ml 蒸馏水进行洗脱，洗脱后的菌液在30℃温浴1h，然后涂布到平板上， 30℃倒置培养1-2d。

（c）发酵复筛：将步骤（b）筛选出的菌株接入斜面培养基，在30℃下培养1-2d，然后斜面转入种子培养基中，在30℃下培养8-10h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250ml摇瓶装30ml培养基，发酵温度30℃，发酵48h，测定发酵液中抑菌多肽的含量，筛选出多肽含量最高的乳酸乳杆菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤直至筛选到目标菌株LB-Y301。

上述筛选方法中：步骤（b）中筛选平板为：葡萄糖0.5%、胰蛋白胨1%、牛肉膏0.3%，琼脂1.5%、酵母膏0.3%、 硫酸镁0.05%,碳酸钙0.3%，其余为水pH6.0

步骤（c）种子培养基为：碳源8%、氮源1.5-2%，无机盐 0.15-0.2%，缓冲剂 3-4%，其余为水，pH=6.0，发酵培养基成分为：碳源12%、氮源1.1%，无机盐 0.15%，缓冲剂 4-7 %，其余为水，pH=6，其中碳源为葡萄糖或糖蜜中的一种或混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵中的一种或混合物，无机盐为磷酸二氢钾，缓冲剂碳酸钙。(以上均为质量百分比)

本发明乳酸乳杆菌LB-Y301的形态学及生理化学特性：

菌落颜色：乳白透明色

需氧方式：兼性厌氧

菌落大小：2-3mm

生长温度：30℃

最适pH ：6.0

菌落形态：圆形

革兰氏染色：呈阳性

上述乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用，包括如下步骤：

1）平板培养：将乳酸乳杆菌LB-Y301接于平板基本培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间1-2d；

2）斜面培养：将步骤1）中平板培养的乳酸乳杆菌LB-Y301转接到斜面基本培养基上，培养时间24-36h，培养温度30℃；

3）种液培养：将步骤2）中斜面培养的乳酸乳杆菌LB-Y301接到种子培养基中培养，培养时间12-16h，培养温度30℃，摇床转速为150r/min；

4）发酵培养：将步骤3）中的种液转接到发酵培养基中，接种量为10%（v/v），培养时间为48h，培养温度为30℃，摇床转速为150r/min。

其中：步骤1）和2）中的基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5%、氮源1.6-2%、琼脂1.5%，其余为水，pH6.0；其中所述的碳源为葡萄糖或糖蜜中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨、牛肉膏或酵母膏。

步骤3）种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8%、氮源1.5-2%，无机盐 0.15-0.2%，缓冲剂 3-4%，pH=6.0，其余为水，其中碳源为葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵或者磷酸氢二铵中的一种或几种；无机盐为磷酸二氢钾；缓冲剂为碳酸钙。

步骤4）发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源12-14%、氮源1-1.2%、无机盐0.15-0.2%、缓冲剂7%，其余为水，pH=6.0，其中碳源为葡萄糖、糖蜜 中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵中的一种或几种，缓冲剂为碳酸钙，无机盐为磷酸二氢钾。

有益效果：本发明采用了低能N⁺注入技术，以LB-101为出发菌，平板进行初筛，得到的菌株进行发酵复筛，逐渐提高益生菌发酵产物中抑菌多肽的含量，发酵液中抑菌多肽含量超过15g/L，较出发菌产量提高了50%的生产菌株，从而提高了益菌抑菌的效果。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1 乳酸乳杆菌LB-Y301的筛选方法

出发菌株乳酸乳杆菌LB-101 是从南京工业大学江浦校区的土壤中筛选得到的。

以LB-101为出发菌筛选乳酸乳杆菌LB-Y301，具体步骤如下：

a）单孢子悬浮液的制备：将乳酸乳杆菌制成孢子悬浮液，浓度为1×10⁶个/ml。

b) 低能氮离子注入 ：取100ul孢子悬浮液 ，均匀涂布到无菌平板上，以无菌风吹干，在20Kev能量下，40×10¹⁴ions/cm²剂量下进行氮离子诱变，离子注入完毕后，在无菌环境下用1ml 无菌水溶液洗脱，洗脱后的菌液在30℃温浴1h，然后涂布到筛选平板上，进行筛选，30℃倒置培养1-2d，选取溶钙圈大的，菌落饱满的。

c）发酵复筛：将步骤（b）筛选出的乳酸乳杆菌接入斜面培养基中，在30℃下培养1d，然后斜面转入种液中，在30℃下培养10h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250ml摇瓶装30ml培养基，转速为150r/min，发酵温度30℃，发酵48h，测定发酵液抑菌多肽的含量，筛选出抑菌多肽含量最高的乳酸乳杆菌菌作为下一轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤，筛选到目标菌株LB-Y301。

其中培养基配方为：

步骤b)中的筛选平板培养基为：葡萄糖0.5%、胰蛋白胨1%、牛肉膏0.3%，琼脂1.5%、酵母膏0.3%、酒硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3%，其余为水pH6.0 。

步骤c）中的种子液培养基:葡萄糖8%、酵母膏1% 、硫酸铵1%、 磷酸二氢钾0.15%，碳酸钙4%，pH为6, 其中葡萄糖需要分消.

步骤c）中的发酵培养基：葡萄糖12%、酵母膏0.1%、 硫酸铵1%、磷酸氢二钾0.15%硫酸镁0.01% 碳酸钙4%，pH6.0，其中葡萄糖需要分消。

发酵结果抑菌多肽含量检测如表1

表1

菌号	出发菌株LB-101	乳酸乳杆菌LB-Y301
			多肽含量（g/L）	10	15

原始出发菌株LB-101每升发酵液中多肽产量为10g，乳酸乳杆菌LB-Y301每升发酵液中多肽产量为15g，经过诱变选育的酵母的产多肽的能力较出发菌有很大的提升，提高了50%。

实施例2

本实施例说明诱变株乳酸乳杆菌LB-Y301的生物学形态及遗传稳定性

本发明乳酸乳杆菌LB-Y301的形态学及生理化学特性：菌落呈乳白透明色 ，兼性厌氧，菌落大小为2-3mm，圆形菌落，生长温度30℃，最适pH为6，革兰氏染色：阳性。

传代实验条件：以实例1中的培养基及培养条件进行传代实验

结果如表2

表2 乳酸乳杆菌LB-Y301的遗传稳定性

传代次数	多肽产量（g/L）
		1	15.2
2	15.5
		3	14. 8
4	15,3
		5	14.9
6	15.4

从遗传稳定性实验结果分析可知，突变株乳酸乳杆菌LB-Y301经过6次传代实验，其多肽产量稳定，具有很好的遗传稳定性，可以作为进一步开发和研究的菌株。

实施例3

本实例说明乳酸乳杆菌LB-Y301利用糖蜜发酵产抑菌多肽

本实施例中所述培养基配方如下：

平板培养基：葡萄糖0.5%、牛肉膏0.3%，胰蛋白胨1%、琼脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3% ，其余为水，pH6.0。

斜面培养基：葡萄糖0.5%、牛肉膏0.3%，胰蛋白胨1%、琼脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3% ，其余为水，pH6.0。

种子培养基：葡萄糖8%、酵母膏1%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸铵1%、碳酸钙4%，pH为6.0，其中葡萄糖需要分消。

发酵培养基：糖蜜12%、酵母膏0.1%、 硫酸铵1%、磷酸二氢钾0.15% 碳酸钙7%，pH为6.0，其中糖蜜需要分消。

将乳酸乳杆菌LB-Y301接种到平板培养基，培养温度30℃，培养时间1-2d，然后转入斜面培养基，在30℃下培养24-36h，然后斜面转入种子培养基中，在30℃下培养12-14h。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v），250ml摇瓶装30ml培养基，转速为150r/min,发酵温度30℃，发酵48h，测定发酵液中抑菌多肽为15.06g/L，比同等条件的原始出发菌提高了50.6%。

实施例4

本实例说明乳酸乳杆菌LB-Y301利用糖蜜发酵产抑菌多肽

本实验所述实验培养基配方

平板培养基：葡萄糖0.5%、牛肉膏0.3%，胰蛋白胨1%、琼脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3% ，其余为水，pH6.0。

斜面培养基：葡萄糖0.5%、牛肉膏0.3%，胰蛋白胨1%、琼脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3% ，其余为水，pH6.0。

种子培养基：葡萄糖8%、酵母膏1%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸铵1%、碳酸钙4%,pH为6.0，其中葡萄糖需要分消。

发酵培养基：糖蜜12%、酵母膏0.1%、 硫酸铵1%、磷酸二氢钾0.15% ,碳酸钙7%，pH为6.0，其中糖蜜需要分消。

将乳酸乳杆菌LB-Y301接种到平板培养基，培养温度30℃，培养时间1-2d，然后转入斜面培养基，在30℃下培养24-36h，然后斜面转入种子培养基中，在30℃下培养12-14。取种子液接入发酵培养基中，接种量10%（v/v）， 转速为150r/min,发酵温度30℃，发酵48h，测定发酵液中抑菌多肽为15.2g/L，比同等条件的原始出发菌提高了52%。

实施例3

本实例说明乳酸乳杆菌LB-Y301在500l发酵罐中发酵产抑菌多肽。

本实验所述实验培养基配方

平板培养基：葡萄糖0.5%、牛肉膏0.3%，胰蛋白胨1%、琼脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3% ，其余为水，pH6.0。

斜面培养基：葡萄糖0.5%、牛肉膏0.3%，胰蛋白胨1%、琼脂1.5%、酵母膏0.3%、硫酸镁0.05%，碳酸钙0.3% ，其余为水，pH6.0。

种子培养基：葡萄糖8%、酵母膏1%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸铵1%、碳酸钙4%，pH为6.0，其中葡萄糖需要分消。

发酵培养基：糖蜜12%、酵母膏0.1%、 硫酸铵1%、磷酸二氢钾0.15% ，碳酸钙7%，pH为6.0，其中糖蜜需要分消。

将乳酸乳杆菌LB-Y301接种到平板培养基，培养温度30℃，培养时间1-2d，然后转入斜面培养基，在30℃下培养24-36h，然后斜面转入一级种子培养基中，在30℃，转速为150r/min下培养12-14h，取一级种子液，以接种量10%（v/v），接入二级种子液中（50L种子罐 ）转速为200r/min,发酵温度30℃，发酵48h，测定发酵液中抑菌多肽为15.4g/L，比同等条件的原始出发菌提高了54%。

实施例4乳酸乳杆菌LB-Y301发酵液产品在蟹塘水质处理中的应用

主要指标为pH，氨氮，硫化氢，烟硝酸盐

使用方法：将实施例3得到的乳酸乳杆菌发酵液稀释100倍泼洒到2号蟹塘水面，每亩用10 L乳酸乳杆菌发酵液，10-15d泼洒一次，1号蟹塘为对照

1号，2号蟹塘在泼洒乳酸乳杆菌发酵液之前各种指标差别不大，下表第1d为未泼洒乳酸乳杆菌发酵液的水质指标

通过上表可以看出乳酸乳杆菌发酵液对蟹塘水体中的氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等有害物质有明显的降解作用，其中发酵液中的乳酸乳杆菌菌体对水体中的物质有降解作用，发酵液中多肽抑制水体中有害菌的生长。

Claims (6)

1.一株乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）LB-Y301，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO：M 2014143。

2.权利要求1所述的乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用。

3.根据权利要求2所述的乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用，其特征在于包括如下步骤：

1）平板培养：将乳酸乳杆菌LB-Y301接于平板基本培养基上培养，培养温度为30℃，培养时间1-2d；

2）斜面培养：将步骤1）中平板培养的乳酸乳杆菌LB-Y301转接到斜面基本培养基上，培养时间24-36h，培养温度30℃；

3）种液培养：将步骤2）中斜面培养的乳酸乳杆菌LB-Y301接到种子培养基中培养，培养时间12-16h，培养温度30℃，摇床转速为150r/min；

4）发酵培养：将步骤3）中的种液转接到发酵培养基中，接种量为10%（v/v），培养时间为48h，培养温度为30℃，摇床转速为150r/min。

4.根据权利要求3所述的乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用，其特征在于：步骤1）和2）中的基本培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5%、氮源1.6-2%、琼脂1.5%，其余为水，pH6.0；其中所述的碳源为葡萄糖或糖蜜中的一种或两种，所述氮源为蛋白胨、牛肉膏或酵母膏。

5.根据权利要求3所述的乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用，其特征在于：步骤3）种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源8%、氮源1.5-2%，无机盐 0.15-0.2%，缓冲剂 3-4%，其余为水，pH=6.0，其中碳源为葡萄糖、玉米淀粉或糖蜜中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵或者磷酸氢二铵中的一种或几种；无机盐为磷酸二氢钾；缓冲剂为碳酸钙。

6.根据权利要求3所述的乳酸乳杆菌LB-Y301在发酵生产抑菌多肽中的应用，其特征在于：步骤4）发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源12-14%、氮源1-1.2%、无机盐0.15-0.2%、缓冲剂7%，其余为水，pH=6.0，其中碳源为葡萄糖、糖蜜 中的一种或几种混合物；氮源为酵母膏、硫酸铵中的一种或几种，缓冲剂为碳酸钙，无机盐为磷酸二氢钾。