CN109321478A - 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用 - Google Patents

一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109321478A
CN109321478A CN201811370464.6A CN201811370464A CN109321478A CN 109321478 A CN109321478 A CN 109321478A CN 201811370464 A CN201811370464 A CN 201811370464A CN 109321478 A CN109321478 A CN 109321478A
Authority
CN
China
Prior art keywords
saccharomyces cerevisiae
mycotoxin
fermentation
bacterial strain
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811370464.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109321478B (zh
Inventor
张秀江
胡虹
王秋菊
杜讯
谷立峰
胡宜亮
慕琦
苏士贤
杨红建
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Academy Of Sciences Institute Of Biology LLC
Original Assignee
Henan Academy Of Sciences Institute Of Biology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Academy Of Sciences Institute Of Biology LLC filed Critical Henan Academy Of Sciences Institute Of Biology LLC
Priority to CN201811370464.6A priority Critical patent/CN109321478B/zh
Publication of CN109321478A publication Critical patent/CN109321478A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109321478B publication Critical patent/CN109321478B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/28—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用，可有效解决降解霉菌毒素的菌株及在制备降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T‑2毒素的霉菌毒素生物降解剂中的应用问题，该菌株yk18以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为原始菌株，利用紫外线育种技术，筛选出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T‑2毒素的yk18菌株，对该菌株进行形态特征观察、微生物培养特性试验以及生理生化特性鉴定等，按照《酵母菌的特征与鉴定手册》中的描述和酵母菌的鉴定方法，将该菌株yk18分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

Description

一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用。
背景技术
霉菌毒素污染给饲料工业、畜牧业带来了巨大经济损失，严重威胁人类动物源食品安全。世界卫生组织估测，全球约有25％的农作物受到霉菌毒素污染，2％以上不能食用，每年造成经济损失接近1万亿美元。国家粮食局调研发现，我国谷物霉菌毒素阳性率90％以上，因霉变造成的粮食产后损失每年高达2100万吨，占粮食总产量4.2％，直接经济损失180～240亿元，间接损失每年超过1000亿元。由于人们习惯将不符合人类食用标准的霉菌毒素超标原料转为饲料原料饲喂动物，霉菌毒素对饲料安全的影响远远高于其对人类植物性食品安全的直接影响。动物采食霉变饲料后引起体重下降或引发疾病，还可导致畜产品及其加工制品中毒素及其代谢产物的残留，间接通过食物链进入人体的毒素具有极强的致病及致癌作用，严重威胁人类健康。
霉菌毒素(Mcyotoxin)是霉菌在生长过程中产生的有毒的次级代谢产物。霉菌毒素广泛存在于谷物、粮食和饲料原料中。主要的霉菌毒素包括黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)、单端抱霉烯族毒素(Trichothecenes，主要有T-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇NEO和呕吐毒素DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素(Ochratoxin A，OTA)及烟曲霉毒素(Fumonisins)等。
去除和降解霉菌毒素方法有传统的物理化学方法、吸附剂吸附法及生物降解法。传统的物理化学方法存在效果不稳定、处理过程对环境影响大、营养成分损失多以及难以规模化生产和广泛推广应用等缺陷。吸附剂吸附法是目前应用较多的方法，但是吸附剂吸附法主要对黄曲霉毒素具有较好的作用，对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素等几乎没有效果，且吸附剂大多会影响饲料中维生素和微量元素等营养成分对动物的消化吸收。霉菌毒素生物降解技术通过微生物本身及其代谢产生的物质与毒素作用，能够达到破坏霉菌毒素毒性基团的效果，并且该技术还具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等特点和优势，成为近年来行业关注的热点。
生物技术降解霉菌毒素主要有生物转化型、酶解型及吸附型等三种途径。生物转化型是通过筛选某些微生物，利用其代谢过程中生物转化作用，使霉菌毒素遭到破坏或转变为低毒或无毒的物质。酶解型是利用某些特殊的生物酶降解或分解霉菌毒素，使其转变为低毒或无毒的物质。吸附型是利用某些对霉菌毒素具有吸附功能的特殊生物材料吸附霉菌毒素，减轻对动物造成的危害。
目前生物降解霉菌毒素技术要想实现规模化应用，仍然面临许多待解的难题。中国对霉菌毒素生物降解的研究还主要侧重于对降解单一毒素微生物菌株的筛选及解毒能力的研究，而对于筛选出高活性同时可降解多种霉菌毒素的菌株研究却很少。由于生物酶来源的特殊性、作用的专一性和应用条件苛刻等，对霉菌毒素降解酶及其在实际生产应用的研究也很少。筛选能高效降解多种霉菌毒素的微生物，研发能高效降解霉菌毒素的生物酶制剂是成功控制霉菌毒素的关键，也是霉菌毒素生物降解技术研究领域重要突破点和发展方向。
发明内容
针对霉菌毒素生物降解技术研究现状及存在的问题，本发明之目的是提供一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用，可有效解决降解霉菌毒素的菌株及在制备降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的霉菌毒素生物降解剂中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用，该菌株yk18以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为原始菌株，利用紫外线育种技术，筛选出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的yk18菌株，对该菌株进行形态特征观察、微生物培养特性试验以及生理生化特性鉴定等，按照《酵母菌的特征与鉴定手册》(Barnett，J.A.等，胡瑞卿译，青岛海洋大学出版社，1991)中的描述和酵母菌的鉴定方法，将该菌株yk18分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
该菌株yk18可有效用于制备高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的霉菌毒素生物降解剂，实现菌株yk18在制备高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的霉菌毒素生物降解剂中的应用。
本发明以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18作为发酵菌株，采用液体、固体发酵工艺，在液体深层有氧发酵的基础上结合固体无氧发酵单位体积的活菌数产出量比液态发酵高，固体发酵培养物中代谢产物更加丰富，发酵培养基含水量低，不需要废水处理，环境污染少的优势，进行酿酒酵母菌固体发酵培养。在发酵培养过程中，通过酿酒酵母自溶技术处理，使得一部分酿酒酵母菌有效破碎和酵母细胞物质彻底释放并溶入培养基中，经低温干燥处理得到富含酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养物的霉菌毒素生物降解剂，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明温度对菌株yk18生产性能的影响曲线图。
图2为本发明培养基含水量对菌株yk18生产性能的影响曲线图。
图3为本发明培养基pH值对菌株yk18生产性能的影响曲线图。
图4为本发明硫酸铵对菌株yk18生产性能的影响曲线图。
图5为本发明接种量对菌株yk18生产性能的影响曲线图。
图6为本发明菌株yk18固体发酵生长曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用，所述的菌株以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为原始菌株，利用紫外线育种技术，筛选出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的菌株yk18，对该菌株进行形态特征观察、微生物培养特性试验以及生理生化特性鉴定等，按照《酵母菌的特征与鉴定手册》(Barnett，J.A.等，胡瑞卿译，青岛海洋大学出版社，1991)中的描述和酵母菌的鉴定方法，将该菌株yk18分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
该菌株yk18的筛选，方法是：
(1)、材料：
原始菌种：以由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为原始菌株；
种子液体培养基(YPD培养基)：按质量比：1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂和余量为水制成，将葡萄糖用5倍质量体积的水溶解，灭菌，成葡萄糖溶液；将酵母膏、蛋白胨溶解在余量的水中，加入琼脂粉，121℃灭菌20min，再加入葡萄糖溶液，调pH值6.5，制成斜面或平板培养基；如制备1000mL的种子液体培养基，方法是，将10g酵母膏和20g蛋白胨用水溶解，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，再加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，定容至1000mL，调pH值6.5；
固体培养基：固体发酵培养基按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2，按培养基干物质的总质量添加3％硫酸铵、加水至含水量为68％，pH值6.5，121℃灭菌60min；所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量＜10.0％；其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维＜9.0％，粗灰分＜6.0％；玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维＜29.7％，粗灰分＜6.0％；玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维＜9.0％，粗灰分＜6.0％；豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维＜5.0％，粗灰分＜6.0％；
(2)、筛选方法：
取酿酒酵母原始菌种接种至装有液体种子培养基(YPD培养基)的三角瓶中，200r/min，于32℃振荡培养24h，得到正常生长的酿酒酵母菌悬液，然后取酿酒酵母菌悬液接种于斜面种子培养基(YPD培养基)上，在32℃恒温培养24h，得到完全活化的正常生长的酿酒酵母菌斜面菌落；
紫外线诱变处理：取斜面菌落置入2OmL液体种子培养基(YPD培养基)的三角瓶中，32℃活化培养24h，取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液，沉淀加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min，重复2次，制成5mL菌悬液，用血球计数板在显微镜下计数；取1mL电磁振荡制备的菌悬液进行稀释，按质量浓度10-1、10-2、10-3稀释度倾注种子平板培养基(YPD琼脂平板)，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数，作为对照；取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上，30W紫外灯下30cm处照射，照射时间设定为0、240s、300s、360s、420s、480s、540s、600s，取质量浓度10-1、10-2、10-3稀释梯度的紫外照射菌液0.1mL用无菌涂布棒涂布均匀，每组做三个平行线培养记录菌落数，计算各照射时间下的致死率，致死率＝(未经照射菌落数-紫外照射菌落数)/未经紫外照射菌落数，选择致死率70％～80％作为紫外线照射剂量；挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，重复上述紫外线诱变处理，连续进行5次，挑选所需菌株，编号并保存；
初筛：挑取在种子平板培养基(YPD平板培养基)上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的一至数个菌落为代表进行纯化菌株，于平板划线，32℃培养24h，选择菌株生长快菌落大典型菌株继续进行纯化，至少经两次划线，结合镜检选择经纯化的菌株10株转接于种子斜面培养基(YPD斜面培养基)上供复筛使；
复筛：供复筛的10株菌株进行500mL三角瓶固体发酵培养试验，培养基采用固态发酵培养基，在培养基中分别添加来自于Pribolab公司黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T2毒素的标准品，使其霉菌毒素含量分别达到2000μg/kg，32℃培养48h，培养物干燥至含水量10％以下，备用；霉菌毒素的检测方法按北京维德维康生物技术有限公司霉菌毒素检测的标准操作程序进行，复筛菌株培养物霉菌毒素的残留量检测结果如表1，其中yk18菌株黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素的残留量与其它菌株比较都是最低的，呕吐毒素的残留量与其它菌株比较是次低的，表明该菌株yk18降解霉菌毒素效果最明显；
表1诱变菌株发酵培养基霉菌毒素残留量(单位：μg/kg)
菌株编号 黄曲霉毒素B1 玉米赤霉烯酮 呕吐毒素 T-2毒素
yk-03 785 1210 1100 940
yk-05 685 1150 1050 900
yk-08 720 1095 980 870
yk-09 790 1390 1050 965
yk-10 885 1250 1180 820
yk-12 780 1175 1210 905
yk-15 660 1205 1060 800
yk-17 720 1385 960 865
yk-18 620 1080 970 780
yk-20 690 1125 1085 885
按“复筛”的方法，进行菌株yk18固体发酵培养试验，连续5代发酵培养，测定其降解霉菌毒素的效果，结果证明菌株yk18性能好，表明菌株yk18具有良好的遗传稳定性；
按照酵母菌的特征与鉴定手册(Barnett，J.A.等著，胡瑞卿译，青岛海洋大学出版社，1991)中描述的方法对菌株yk18进行形态特征、培养特性和生理生化特性鉴定，具体结果如下：
菌株yk18细胞呈圆形或椭圆形，单个或成双，革兰氏染色阳性，无性繁殖方式为多边芽殖，每个细胞产1个或多个芽孢，芽孢也成圆形或椭圆形，菌落呈奶油状、乳白色、隆起、光滑、稍平坦、边缘整齐偶尔波纹、菌落质地软而湿润容易挑取，无真菌丝。
溶解1g酵母膏和2g蛋白胨于100ml水中，121℃灭菌20min，向其中加入经煮沸过的10％糖液，使糖液浓度达到2％，pH值6.5，将配制好的培养基装入杜氏发酵管中，用接种环将菌株yk18接入发酵管中，每种糖三个重复，以不加糖、不接菌的试管为空白对照，32℃培养，观察发酵管中气泡量，利用无碳源基础培养基和无氮源基础培养基，倒入菌株yk18菌悬液，混匀后倒入培养皿中，待凝固后将测试碳源放其表面，32℃培养观察碳源周围是否形成生长圈；结果显示，选育的菌株yk18可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-半乳糖、海藻糖、棉子糖，不发酵乳糖、密二糖、纤维二糖、菊糖、可溶性淀粉；能同化葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-半乳糖、海藻糖、棉子糖；不分解蛋白质和脂肪；兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵；最适生长温度32℃，最适生长pH为6.5。
基于以上特征，菌株yk18鉴定为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，分类命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，并于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC№16598。
本发明菌株yk18具有降解霉菌毒素的作用，可有效用于霉菌毒素生物降解剂的生产菌种的制备、液体深层有氧发酵和固体无氧发酵中，所述的霉菌毒素为黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素。
所述的生产菌种的制备是，将低温保存的酿酒酵母yk18在平板种子培养基上活化，挑取单菌接种于含种子液体发酵培养基的试管中，32℃，200r/min摇床培养24小时后，以v/v计的2％转接于含种子液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18发酵培养种子液。所述的种子平板培养基配制：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。种子液体培养基配制：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。
所述的液体深层有氧发酵是，在1000ml的三角瓶加入液体发酵培养基300ml,按v/v计的5％添加量加入液体发酵种子液15ml,32℃，200r/min摇床培养24h，得到液体发酵培养液。所述的液体深层有氧发酵培养基配制：称取麦芽汁培养基(市售)130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min。
所述的固体无氧发酵是，在1000ml的三角瓶中加入固体发酵培养基200g,按质量比3％的添加量将酿酒酵母yk18液体发酵培养液6g加到含固体培养基的三角瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封瓶口，放于32℃恒温培养箱中培养48h,得到固体无氧发酵培养物。所述的固体无氧发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基干物质的总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
所得的固体无氧发酵培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干。粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×108个/g，即为酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂。
本发明方法制备的酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂在生长肥育猪和蛋鸡的霉变饲料中的应用，可高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响。
由上述可以看出，本发明的目的有3个，第一个目的是提供一株酿酒酵母菌株，该菌株本身及其发酵培养物能够降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素，可用于创制霉菌毒素生物降解剂。
以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为原始菌株，利用紫外线育种技术，筛选出一株能够高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的yk18菌株。对该菌株进行形态特征观察、微生物培养特性试验以及生理生化特性鉴定等，按照《酵母菌的特征与鉴定手册》(Barnett，J.A.等，胡瑞卿译，青岛海洋大学出版社，1991)中的描述和酵母菌的鉴定方法，将该菌株命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18已于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的是提供了高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素生物降解剂的制备方法。
以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18作为发酵菌株，采用先进的液体、固体发酵工艺，在液体深层有氧发酵的基础上结合固体无氧发酵单位体积的活菌数产出量比液态发酵高，固体发酵培养物中代谢产物更加丰富，发酵培养基含水量低，不需要废水处理，环境污染少的优势，进行酿酒酵母菌固体发酵培养。在发酵培养过程中，通过酿酒酵母自溶技术处理，使得一部分酿酒酵母菌有效破碎和酵母细胞物质彻底释放并溶入培养基中，经低温干燥处理得到富含酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养物的霉菌毒素生物降解剂。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18生产霉菌毒素生物降解剂的工艺主要包括生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵等，包括以下工艺：
生产菌种的制备
将低温保存的酿酒酵母yk18在平板种子培养基上活化，挑取单菌接种于含液体发酵培养基的试管中，32℃，200r/min摇床培养24小时后，以v/v计的2％转接于含液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18发酵培养种子液。
液体深层有氧发酵
在1000ml的三角瓶加入液体发酵培养基300ml,按v/v计的5％添加量加入液体发酵种子液15ml,32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18液体发酵培养液。
固体无氧发酵
在1000ml的三角瓶中加入固体发酵培养基200g,按质量比3％的添加量将酿酒酵母yk18液体发酵培养液6g加到含固体培养基的三角瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封瓶口，放于32℃恒温培养箱中培养48h,得到酿酒酵母yk18固体发酵培养物。
将上述所制得的酿酒酵母yk18固体发酵培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干。粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×108个/g，即为酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂。
所述培养基的配制为：
种子平板培养基：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5，制成斜面或平板培养基。
种子液体培养基：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。
液体发酵培养基：称取麦芽汁培养基(市售)130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min。
固体发酵培养基：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基干物质的总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
本发明的第三个目的是提供一种高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素生物降解剂,并应用于畜禽养殖业生产。
由酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18创制的霉菌毒素生物降解剂含有高效降解霉菌毒素的酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母的发酵培养物，使得本发明的产品可有效降解饲料原料和饲料产品中霉菌毒素的毒性，又可将降解后的低毒或无毒的物质吸附起来，随动物代谢排出体外，彻底消除或减轻霉菌毒素对动物的危害。
本发明酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18活菌在动物胃肠道内对霉菌有抑制作用，对霉菌毒素有降解作用。动物胃肠道内寄生了大量的微生物，这些微生物在合适的营养底物下能够保持正常的生长代谢，这将有利于维护各菌系之间的代谢平衡并为动物胃肠道消化吸收功能提供一个良好的微生态环境，使得日粮中的各种养分在胃肠道内能被充分吸收和利用，实现养殖效益的最大化。酿酒酵母yk18为兼性厌氧菌，在动物体内生长繁殖，能消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，并代谢产生乳酸等有机酸，从而有利于乳酸菌等有益菌的生长，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，可改善胃肠道环境和菌群结构，促进胃肠道对营养物质的消化、吸收和利用。厌氧环境同时可以降低好氧菌对蛋白质的分解，降低动物体内胺和氨的浓度。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽都是重要的抗氧化剂和自由基消除剂。酵母菌体内的超氧化物歧化酶(SOD)可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。谷胱甘肽在酵母细胞内含量较高，可消除自由基，能起到强有力的保护作用。谷胱甘肽还具有整合解毒作用，能与体内的霉菌毒素等有毒有害的物质相结合，并促进其排出体外，起到中和解毒作用。
本发明酿酒酵母yk18的细胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白和几丁质组成，对霉菌毒素具有很强的吸附性。酿酒酵母细胞壁对霉菌毒素的吸附能力主要是由于酵母细胞壁的特殊结构对霉菌毒素产生吸附力。酿酒酵母细胞壁的解毒机理就是细胞壁的葡聚糖和甘露聚糖捕获霉菌毒素，从而阻止动物胃肠道对霉菌毒素的吸收，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响。酵母细胞壁作为一种生物活性物质，一方面对霉菌毒素具有降解、分解和吸附作用，另一方面作为免疫促进剂，通过激发和增强机体免疫力，改善动物健康，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响。
本发明酿酒酵母yk18发酵培养物是一种含有酿酒酵母菌赖以生长的培养基经酵母培养和生物转化的产品。它营养丰富，含有维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸，适口性好。酿酒酵母菌代谢能产生多种酶，降解饲料中的抗营养因子，降低肠道内食糜粘度，促进胃肠对营养物质的消化、吸收和利用，提高饲料利用率。酵母细胞富含畜禽生长需要的多种营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素和激素等。蛋白质含量达到45％～60％，可以和大豆蛋白相媲美；氨基酸组成合理，动物必需的8种氨基酸含量均很高，尤其是赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等几种重要的必需氨基酸含量较高，因此对赖氨酸含量较低的谷物是非常有效的补充物；富含B族维生素如烟酸、胆碱、核黄素、泛酸、叶酸等，一直被认为是天然B族维生素的丰富来源，VB2以结合形式存在，动物体对其吸收率可达60％以上，是一种理想的VB2补充源；含有丰富的矿物质(6％～9％)，如钾、镁、磷、铁、锌、锰等；以及含核酸(6％～8％)、生理活性物质(1％～2％)等，为动物提供多种营养成分。此外，酵母培养物中含有未知生长因子，具有促生长作用。
本发明酿酒酵母yk18创制的霉菌毒素生物降解剂可高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素。产品特异性强，主要生物活性成分仅抑制霉菌和降解相应的霉菌毒素，对饲料的营养价值不会有任何影响，对动物无任何毒副作用。降解产物无毒无害，排出体外不会造成对环境污染。产品对霉菌毒素及其降解物具有吸附作用，减少霉菌毒素对动物器官(尤其是肝脏、肾脏、生殖系统等)的损害；酿酒酵母细胞壁可以解除动物免疫抑制，提高机体免疫力，减少疾病的发生。产品适口性好、绿色安全，可以替代益生菌，有效调节肠道有益菌群，降低饲料添加成本，促进动物生长，提高饲料利用率。适用于处理各种发霉的饲料和饲料原料，可以添加各种饲养动物的饲料中。
本发明菌株yk18具有降解霉菌毒素的功效，并可有效用于制备高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的霉菌毒素生物降解剂，该降解剂可有效用于降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
本发明酿酒酵母yk18创制的霉菌毒素生物降解剂对生长肥育猪霉变饲料和生产性能的影响试验：
在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18，经过40天饲养试验，猪粪样品中黄曲霉毒素B1平均含量为饲料中毒素平均含量的14.8％～16％，玉米赤霉烯酮平均含量为饲料中平均含量的17.5％～19.2％，呕吐毒素平均含量为饲料中毒素平均含量的16.1％～16.6％，T-2毒素含量为饲料中毒素平均含量的2.7％～3.1％，添加酿酒酵母yk18降解霉菌毒素效果显著。
在生长肥育猪霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18可显著降低霉菌毒素造成的生长肥育猪发病，较对照组相比分别降低发病率95％、96.26％、96.89％。
在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18可显著降低霉菌毒素对生长肥育猪平均日增重的影响，较对照组相比分别提高平均日增重69.2％、69.8％、71.7％，分别提高经济效益0.82％、0.6％、1.35％。试验各组每头猪较对照组分别多增重13.08kg、13.2kg、13.56kg，按各试验组增重成本计算，折合人民币每头猪多增收166.5元、168.3元、171.6元，经济效益显著。
本发明酿酒酵母yk18创制的霉菌毒素生物降解剂对蛋鸡霉变饲料和生产性能的影响试验：
试验期间，设对照组，对照组未添加酿酒酵母yk18对照组蛋鸡采食量减少，精神萎靡，体重下降，产蛋量下降；肠道病增多，出现经常性拉稀，而且拉稀症状严重，排黑色粘性粪便；鸡冠肿大、发红、出现“假公鸡”现象。添加酿酒酵母yk18试验各组均未出现上述现象。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18,经过60天饲养试验，鸡排泄物的样品中黄曲霉毒素B1含量降为饲料中含量的2.9％～8.1％，玉米赤霉烯酮含量为饲料中含量的8.7％～21.3％，呕吐毒素含量为饲料中含量的9.8％～19.1％，添加酿酒酵母yk18降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素效果显著。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，添加0.1％与0.2％、0.3％组降解霉菌毒素差异显著，添加0.2％、0.3％组降解霉菌毒素差异不显著，以添加0.2％组降解霉菌毒素效果最显著，考虑到使用成本和效果的关系，建议应用过程中添加量为0.2％比较经济。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18基本上不影响产蛋鸡的生产性能，产蛋率可达86.59％～89.74％，单枚蛋重、日产蛋总重、料蛋比与空白对照组差异显著。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18不会降低蛋的品质。在日粮中添加0.2％的酿酒酵母yk18，该组的蛋黄占整个蛋的百分比，比对照组提高了3.27％，提高幅度显著；该组的蛋壳厚度比对照组下降4.65％，且下降幅度显著；该组蛋的哈氏单位比对照组提高了2.24％，但差异不显著，其他常规指标间没有显著差异。
在产蛋鸡霉变饲料的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％的酿酒酵母yk18，可分别比对照组多增加收入1656.00元、1920.00元、1824.00元，经济效益显著。
实验1酿酒酵母yk18创制霉菌毒素生物降解剂的生产工艺
种子斜面(平板)培养基：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5，制成斜面或平板培养基。
种子液体培养基：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。
液体发酵培养基：称取麦芽汁培养基(市售)130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min。
固体发酵培养基：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
将低温保存的酿酒酵母yk18在平板种子培养基上活化，挑取单菌接种于含种子液体发酵培养基的试管中，32℃培养24小时后，以v/v计的2％转接于含种子液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18液体发酵培养种子液。在1000ml的三角瓶加入液体发酵培养基300ml,按v/v计的5％添加量加入液体发酵培养种子液15ml,32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18液体发酵培养液。在1000ml的三角瓶中加入固体发酵培养基200g,按质量比3％的添加量将酿酒酵母yk18液体发酵培养液6g加到含固体发酵培养基的三角瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封瓶口，放于32℃恒温培养箱中培养48h,得到酿酒酵母yk18固体发酵培养物。将上述所制得的酿酒酵母yk18固体发酵培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干。粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×108个/g，即为酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂。
实验2酿酒酵母yk18创制霉菌毒素生物降解剂的生产工艺
种子的制备
将低温保存的酿酒酵母yk18在试管种子斜面培养基上活化，挑取单菌接种于含种子液体发酵培养基的试管中，32℃培养24小时后，以v/v计的2％转接于含种子液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，即得酿酒酵母yk18液体发酵培养种子液。
所述的种子斜面培养基配制：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。种子液体培养基配制：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。
液体发酵培养
5升的液体发酵罐中加入制备的液体培养基2000ml,按v/v计的5％添加量加入液体发酵培养种子液100ml,培养温度32℃，发酵罐转速200转/分钟，培养12h,发酵罐转速120转/分钟再继续培养12h,得到酿酒酵母yk18液体发酵培养液。
所述的液体发酵培养基的配制：称取麦芽汁培养基(市售)260.2g，加入蒸馏水或去离子水2000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min。
固体发酵培养
称取麸皮8千克，玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉各4千克，硫酸铵0.6千克，混合均匀，加水使含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。将制备的固体发酵培养基装入发酵箱中，按固体发酵培养基干物质量(m/m)的3％加入液体发酵培养液混合均匀，密闭发酵箱，保持固体发酵箱培养温度32℃，发酵培养48h,得到酿酒酵母yk18固体发酵培养物。将上述所制得的酿酒酵母yk18固体发酵培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干。粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×108个/g，即为酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂。
上述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
实验3酿酒酵母yk18液体发酵培养基的优化
麦芽汁培养基加入其它增菌成分，将各种添加增菌成分培养基列表如表2。按表2制备6种培养基，24h液体发酵培养后进行酿酒酵母yk18活菌计数，每种培养基设置4个重复，结果如表3。由表3可知，2％葡萄糖、0.5％硫酸铵、0.5％氯化钾、0.5％硫酸镁、0.5％氯化钠在液体发酵培养过程中对酿酒酵母yk18活菌数的增加都有明显的影响。其中2％葡萄糖增加活菌数0.2×108个/mL，0.5％硫酸铵增加活菌数0.09×108个/mL，0.5％氯化钾增加活菌数0.1×108个/mL，0.5％硫酸镁增加活菌数0.04×108个/mL，0.5％氯化钠增加活菌数0.1×108个/mL。
上述所述的麦芽汁培养基的配制为：称取麦芽汁培养基(市售)130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min。
表2酿酒酵母yk18液体发酵培养基的优化
组别 麦芽汁 2％葡萄糖 0.5％硫酸铵 0.5％氯化钾 0.5％硫酸镁 0.5％氯化钠
Ⅰ + － － － － －
Ⅱ + + － － － －
Ⅲ + + + － － －
Ⅳ + + + + － －
Ⅴ + + + + + －
Ⅵ + + + + + +
“+”表示培养基中添加该成分，“－”表示培养基中未添加该成分。
表3不同培养基的组成对酿酒酵母yk18液体发酵活菌数的影响
组别 重复试验活菌数(×10<sup>8</sup>个/mL) 平均数(×10<sup>8</sup>个/mL)
Ⅰ 0.15 0.18 0.16 0.13 0.15
Ⅱ 0.31 0.37 0.33 0.39 0.35
Ⅲ 0.42 0.45 0.41 0.48 0.44
Ⅳ 0.50 0.54 0.53 0.57 0.54
Ⅴ 0.56 0.55 0.59 0.61 0.58
Ⅵ 0.68 0.66 0.70 0.69 0.68
实验4酿酒酵母yk18固体发酵培养条件的优化
温度对酿酒酵母yk18生产性能的影响
温度是固态发酵一个重要的可调节参数，是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移除，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行。温度偏低，酿酒酵母菌株细胞内酶的催化活性降低，延缓了菌体组成物质的合成速度；温度偏高，菌株培养初期生长繁殖过快，但由于供氧速度的限制不利于生长代谢产物的积累，影响最终酿酒酵母yk18的活菌数。为寻求合适的固体发酵培养温度，本试验以酿酒酵母yk18固体发酵培养基含水量为68％、pH值为6.5，分别在28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃不同温度下进行发酵培养培养48h，分别测定发酵培养基中酿酒酵母yk18的活菌数，结果如图1，由图1表明酿酒酵母yk18固体发酵培养最适温度为32～34℃。
上述所述固体发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
培养基含水量对酿酒酵母yk18生产性能的影响
对于固态发酵来说，适宜的含水量，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖。过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，培养基膨胀程度降低，水的活度低，透气性好，但不利于营养物质的吸收，从而抑制菌体生长。含水量过高过低都对酿酒酵母生长繁殖不利，从而影响单位体积内的活菌数。本试验将酿酒酵母yk18分别接种到初始pH值为6.5，含水量分别为60％、64％、68％、72％、76％和80％的固态发酵培养基上，在32℃的条件下进行发酵培养试验48h，结果如图2，由图2表明，含水量为68％时酿酒酵母yk18固体发酵活菌数达最高。
上述所述固体发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量分别达到60％、64％、68％、72％、76％和80％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
培养基pH值对酿酒酵母yk18生产性能的影响
为了研究固体发酵培养基pH值对酿酒酵母yk18生产性能的影响，根据固体发酵培养基难以调节pH值的特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整。本试验在培养基含水量为68％，温度为32℃，pH值分别为5、5.5、6、6.5、7、7.5的条件下发酵培养48h，观察发酵培养基pH值对酿酒酵母yk18生产性能的影响，结果如图3，图3表明酿酒酵母yk18固态发酵培养最适pH值为6.5。
上述所述固体发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值分别调成5、5.5、6、6.5、7、7.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
硫酸铵对酿酒酵母yk18生产性能的影响
在酿酒酵母yk18固体发酵培养基中分别加入0、1％、2％、3％、4％、5％、6％的硫酸铵，在32℃的条件下进行发酵培养试验48h，确定硫酸铵对酿酒酵母yk18生产性能的影响，结果如图4，由图4表明，少量添加硫酸铵对酿酒酵母yk18活菌数的增加有明显促进作用，但随着添加量的增加活菌数增加不明显。
上述所述固体发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量分别添加0、1％、2％、3％、4％、5％、6％的硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
接种量对酿酒酵母yk18生产性能的影响
在酿酒酵母yk18固体发酵培养基分别按1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量在32℃的条件下发酵培养48h，确定发酵培养基中不同接种量对酿酒酵母yk18生产性能的影响，结果如图5。由图5可以看出，接种量为3％时酿酒酵母yk18的活菌数最高，达到6.1×108个/g。发酵培养所得的活菌数与接种量在一定范围内成正比，因为培养基所提供的营养水平只能满足一定数量酿酒酵母yk18生长繁殖需要。当接种量超过一定范围后，必然造成一部分酿酒酵母yk18营养供应不足，从而限制一部分酿酒酵母yk18的生长繁殖。因此，3％的接种量对固体发酿酒酵母yk18生产性能是最佳的。
上述所述固体发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
酿酒酵母yk18固体发酵生长曲线
酿酒酵母yk18在32℃的条件下进行固体发酵培养84h，研究其生长曲线，结果如图6。0～12h发酵活菌数增加较慢；12～48h活菌数迅速增加；48h后,生长曲线趋于平缓，活菌数增加不明显；60h后活菌数有减少的趋势，培养时间过长，可能造成菌体活性降低且增加被污染的风险。因此，在酿酒酵母yk18产品产业化生产时，考虑发酵成本和活菌数的关系，最经济的培养时间48h。
上述所述固体发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基的干物质总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60min。所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％。其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％。玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％。豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。
实验5酿酒酵母yk18对霉变饲料和生长肥育猪生产性能的影响
霉菌毒素是产霉菌在粮食或饲料上生长繁殖过程中产生的有毒代谢产物，至今检测到的霉菌毒素已超过350种，据统计，全球每年有25％的谷物被霉菌毒素所污染，目前我国饲料中霉菌毒素的检出率在90％以上，带菌量超过国家标准的约为50％，其中对猪危害最大的主要有6种毒素，即黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T—2毒素、烟曲霉毒素、赭曲霉毒素等。猪采食带有霉菌毒素的饲料后，可导致急性或慢性中毒，主要造成肝脏、肾脏的损害以及肠道出血、腹水、消化机能障碍、神经症状和皮肤病变。霉菌毒素对动物机体免疫系统破坏造成的免疫抑制是其最为重要和最为本质的危害，霉菌毒素除直接使猪中毒致死外，更为重要的是使猪的免疫机能和生产性能下降，长期处于亚健康状态，造成了许多的免疫失败和频频严重发生且难以预防的疾病。霉菌毒素直接造成猪食欲下降，采食减少，干扰营养物质的吸收，降低消化酶的活性，降低饲料转化率，致使饲料消耗增加，生产性能下降。
本试验所用的酿酒酵母yk18是该菌株的微生物发酵培养物，富含丰富的酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养物。通过试验旨在探索和验证酿酒酵母yk18对霉变饲料和生长肥育猪生产性能的影响，指导在生产实践中的应用。
1.材料和方法
1.1酿酒酵母yk18
河南省科学院生物研究所有限责任公司提供。产品含：酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养物，其中酿酒酵母活菌数≥2.5×108个/g。
1.2试验动物及试验设计
选体重、生长日龄相近的长大杜生长肥育猪猪72头，随机分为4个组，每组18头。1组为对照组，饲喂基础日粮；2组为基础日粮中添加0.1％的酿酒酵母yk18；3组为基础日粮中添加0.2％酿酒酵母yk18；4组为基础日粮中添加0.3％酿酒酵母yk18。
1.3试验日粮
基础日粮配方见表1。基础日粮中玉米、米糠和麸皮等被霉菌毒素污染，经检测基础日粮含黄曲霉毒素B1 45μg/kg、玉米赤霉烯酮300μg/kg、呕吐毒素3500μg/kg、T-2毒素540μg/kg，分别超过国标225％、120％、350％、108％。
1.4饲养管理
预试期5天。预试期内分别饲喂含4种不同的日粮。自由采食，自由饮水，常规免疫，在试验中观察猪的采食及健康情况，每天以组为单位记录采食量、健康情况；正试期每10天期末以组为单位收集猪粪样品。正试期期初、期末分别对猪只称重，每次称重均在早晨饲喂前空腹进行。计算平均日增重、饲料转化率、饲料成本，并对计算结果进行统计分析。
1.5样品的采集
1.5.1饲料
各组饲料分别取样1kg，将饲料充分混匀后，风干后粉碎，过80目筛，制成分析样品，保存于干燥器中，放在阴凉干燥处。
1.5.2粪样
正试期每10天期末以组为单位收集猪粪样品，早晚从每组试验猪中随机采集猪粪样各500g混合，以组为单位充分混匀，在60℃烘箱内烘干。测定水分后，用植物样品粉碎机粉碎，过80目筛，制成分析样品，装入样品袋，充分混匀后保存于干燥器中，放在阴凉干燥处，备用。
1.6试验地点
汝州市济生康生物技术有限公司养猪场。
1.7试验时间
试验期从2017年9月16日至10月30日。共45天，其中预试期5天，正试期40天。
表1试验猪日粮配方及营养水平(％)
2.试验结果分析
2.1.酿酒酵母yk18对猪日粮中霉菌毒素的降解效果
2.1.1霉菌毒素的检测
2.1.1.1仪器设备
511酶标分析仪(上海第一分析仪器厂)，震荡器(北京长安科学仪器厂)，样品粉碎机，微量移液器，量筒、容量瓶等。
2.1.1.2试剂
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW022.02)，玉米赤霉烯酮酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW055.01)，呕吐毒素酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW070.01)，T2毒素检测试剂盒ELISA酶联免疫试剂盒(长沙安迪生物科技有限公司，96T)。试剂盒提供的试剂：标准溶液、抗体溶液、酶标物、显色液、终止液、浓缩洗涤液、空白对照。自备物品：氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、蒸馏水。
2.1.1.3样品中霉菌毒素的提取
饲料和粪样样品中的黄曲霉毒素B1含量的测定，参照黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒说明书进行；玉米赤霉烯酮含量的测定，参照玉米赤霉烯酮酶联免疫试剂盒说明书进行；呕吐毒素含量的测定，参照呕吐毒素酶联免疫试剂盒说明书进行；T-2毒素含量的测定，参照T-2毒素酶联免疫试剂盒说明书进行。
2.1.1.4结果与分析
试验和对照各组每10天期末猪粪样品检测结果见表2。
表2猪粪样品中霉菌毒素的含量(单位：μg/kg％)
试验表明，生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，黄曲霉毒素B1对照组猪粪样品中毒素平均含量为饲料中毒素含量的58.2％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18的猪粪样品中黄曲霉毒素B1平均含量分别为饲料中毒素平均含量的16％、15.2％、14.8％，添加酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂降解黄曲霉毒素B1效果显著。
试验期间在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，玉米赤霉烯酮对照组猪粪样品中毒素平均含量为饲料中毒素平均含量的40.8％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18的猪粪样品中玉米赤霉烯酮平均含量分别为饲料中毒素平均含量的19.2％、18.3％、17.5％，添加酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂降解玉米赤霉烯酮效果显著。
试验期间在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，呕吐毒素对照组猪粪样品中毒素平均含量为饲料中毒素平均含量的35.6％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18的猪粪样品中呕吐毒素平均含量分别为饲料中毒素平均含量的16.6％、16.1％、16.2％，添加酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂降解呕吐毒素效果显著。
试验期间在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，T-2毒素对照组猪粪样品中毒素平均含量为饲料中毒素平均含量的15.9％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组猪粪样品中T-2毒素平均含量分别为饲料中毒素平均含量的3.1％、2.7％、2.7％，添加酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂降解T-2毒素效果显著。
2.2酿酒酵母yk18对生长肥育猪平均日增重的影响
经过40天的饲养试验，各组平均日增重见表3
表3试验各组平均日增重(单位：千克/头、克/头-日、％)
组别 头数 天数 平均始重 平均末重 平均日增重 相对比较
1组 18 40 76.6±0.54 95.5±1.59 472.5±27.1 0
2组 18 40 75.5±0.68 105.8±1.82 799.3±22.2 69.2
3组 18 40 76.2±0.62 106.8±1.43 802.3±29.3 69.8
4组 18 40 76.0±0.51 108.45±1.39 811.3±28.7 71.7
在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加霉菌毒素生物降解剂酿酒酵母yk18,可显著降低霉菌毒素对生长肥育猪平均日增重的影响，较对照组相比分别提高平均日增重69.2％、69.8％、71.7％。
2.3酿酒酵母yk18对生长肥育猪采食量及饲料转化率的影响
经过40天的饲养试验，试验各组采食量及饲料转化率如表4
表4试验全期采食量及饲料转化率(单位：千克/头、克/头-日、％)
组别 头数 天数 总采食量 日采食重 料肉比 料肉比比较
1组 18 40 64.40 1610 3.41 100.0
2组 18 40 107.08 2677 3.35 98.4
3组 18 40 106.80 2670 3.33 97.8
4组 18 40 106.40 2660 3.28 96.4
试验结果表明，三个添加酿酒酵母yk18试验组都显著提高了生长肥育猪的总采食量和平均采食量，分别比对照组增加66.27％、65.84％、65.22％，料肉比分别降低1.6％、2.2％、3.6％。
2.4酿酒酵母yk18对生长肥育猪发病率的影响
试验期间，全程无猪死亡。凡腹泻、呕吐、拒食、皮肤上出现如蚊虫叮咬的红色和紫斑、耳根部有溃烂斑和发热现象等现象的猪，统计为发病猪。各组的发病率情况见表5。
表5试验各组的发病率(单位：％)
组别 头数 天数 饲养头日数 发病头日次数 发病率 发病率比较
1组 18 40 720 160 22.22 100.0
2组 18 40 720 8 1.11 5.0
3组 18 40 720 6 0.83 3.74
4组 18 40 720 5 0.69 3.11
发病率(％)＝累计发病头日数/累计饲养头日数×100
试验进行到中后期，对照组猪多表现为猪呕吐、拒食，采食量下降；皮肤发痒、毛长粗乱、消化不良,可在粪便中见到未消化的饲料。患病猪只在皮肤上出现如蚊虫叮咬的红色和紫色斑，耳根部有溃烂斑。生长缓慢、渐进性消瘦，严重的露出脊梁骨和肋骨。试验结果表明：在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18可显著降低霉菌毒素对生长肥育猪发病率的影响，较对照组相比分别降低发病率95％、96.26％、96.89％。
2.5经济效益分析
表6试验各组猪的经济效益分析(单位：元/千克、％)
组别 头数 天数 饲料成本 增重成本 增重成本比较
1组 18 40 3.7688 12.852 100.00
2组 18 40 3.7988 12.726 99.02
3组 18 40 3.8288 12.75 99.21
4组 18 40 3.8588 12.657 98.48
由表6的试验结果表明，在生长猪的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18,较对照组相比均降低了猪的增重成本，分别提高经济效益0.82％、0.6％、1.35％。试验期间，试验各组每头猪较对照组分别多增重13.08kg、13.2kg、13.56kg，按各试验组增重成本计算，折合人民币每头猪多增收166.5元、168.3元、171.6元，经济效益显著。
3.结论
酿酒酵母yk18的微生物发酵培养物，富含丰富的酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养物。可高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素。产品特异性强，对饲料的营养价值不会有任何影响，对动物无任何毒副作用。优化猪肠道新陈代谢，提高消化率，增加猪采食量。还可为益生菌提供营养和适宜肠道环境，提高有益微生物菌群活性。刺激猪机体产生免疫应答，提高免疫力，降低发病率。改善猪生产与繁殖性能，提高养猪经济效益。
试验结果表明，在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18，经过40天饲养试验，猪粪样品中黄曲霉毒素B1平均含量为饲料中毒素平均含量的14.8％～16％，玉米赤霉烯酮平均含量为饲料中平均含量的17.5％～19.2％，呕吐毒素平均含量为饲料中毒素平均含量的16.1％～16.6％，T-2毒素含量为饲料中毒素平均含量的2.7％～3.1％，添加酿酒酵母yk18降解霉菌毒素效果显著。
在生长肥育猪霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18可显著降低霉菌毒素造成的生长肥育猪发病，较对照组相比分别降低发病率95％、96.26％、96.89％。
在生长肥育猪的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18可显著降低霉菌毒素对生长肥育猪平均日增重的影响，较对照组相比分别提高平均日增重69.2％、69.8％、71.7％，分别提高经济效益0.82％、0.6％、1.35％。试验各组每头猪较对照组分别多增重13.08kg、13.2kg、13.56kg，按各试验组增值成本计算，折合人民币每头猪多增收166.5元、168.3元、171.6元，经济效益显著。
实验6酿酒酵母yk18对饲料霉菌毒素及蛋鸡生产性能的影响
1.材料和方法
1.1酿酒酵母yk18
河南省科学院生物研究所有限责任公司提供。产品含：酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养物，其中酿酒酵母活菌数≥2.5×108个/g。
1.2试验动物及试验设计
将800只罗曼褐壳商品蛋鸡，随机分为4组，每组设4个重复，每个重复50羽；其中Ⅰ组为空白对照组、Ⅱ组为添加0.1％酿酒酵母yk18、Ⅲ组为添加0.2％酿酒酵母yk18、Ⅵ组为添加0.3％酿酒酵母yk18。
1.3试验日粮
基础日粮配方为：玉米(62％)、豆粕(25％)、贝壳(8％)、预混料(5％)，预混料中除微量元素、维生素外，还添加了占大料1％的鱼粉，并添加了一定比例的蛋氨酸。基础日粮中玉米被霉菌毒素严重污染，经检测基础日粮含黄曲霉毒素B1 33μg/kg、玉米赤霉烯酮360μg/kg、呕吐毒素4500μg/kg，分别超过国标165％、144％、150％。
1.4试验时间和地点
试验在河南省武陟县蛋鸡养殖场进行，预试开始时鸡龄在11个月；试验时间为2017年9月19日至2017年11月27日，其中头10天为预试期，后60天为正试期。
1.5试验蛋鸡的饲养管理
本次试验的蛋鸡自由采食、饮水，光照时间为16小时。每只蛋鸡日平均饲喂料两次，第一次在上午8点，饲喂量为全天所需饲喂量的60％，第二次在下午4点，饲喂量为全天所需饲喂量的40％。饲养方式为三层阶梯式笼养，每笼3只鸡。
1.6预试期鸡群调整方法
在预试期开始时，将鸡舍内各笼内的蛋鸡数均调整为每笼3只，然后按笼为单位每天记录各笼的产蛋数。记录10天后按各重复小组统计产蛋数，并根据统计结果进行适当调整，即将产蛋数高的小组内的鸡，按笼为单位调整到产蛋数较低的组内，以使各小组在正式试验开始时的产蛋数基本相等。
1.7测定指标
试验期间每天下午3点分笼记录产蛋数、分重复组称测产蛋重，并记录每天的耗料量；并在试验结束时，选取试验效果明显的组及对照组作为蛋品质量测定组，每个重复组选取10枚蛋，进行常规蛋品指标测定。正试期每20天期末以组为单位收集鸡粪样品。
1.8样品的采集
1.8.1饲料
各组饲料分别取样1kg，将饲料充分混匀后，风干后粉碎，过80目筛，制成分析样品，保存于干燥器中，放在阴凉干燥处。
1.8.2粪样
正试期每20天期末以组为单位收集鸡粪样品，早晚从每组试验鸡群中随机采集鸡粪样各500g，以组为单位充分混匀，在60℃烘箱内烘干。测定水分后，用植物样品粉碎机粉碎，过80目筛，制成分析样品，装入样品袋，放在阴凉干燥处。
1.9统计分析方法
将试验原始记录资料输入到SPSS统计软件中，通过统计软件进行数据处理，多重比较采用LSD。
2.试验结果分析
2.1.酿酒酵母yk18对蛋鸡日粮中霉菌毒素的降解效果
2.1.1霉菌毒素的测定
2.1.1.1仪器设备
511酶标分析仪(上海第一分析仪器厂)，震荡器(北京长安科学仪器厂)，样品粉碎机，微量移液器，量筒、容量瓶等。
2.1.1.2试剂
黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW022.02)，玉米赤霉烯酮酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW055.01)，呕吐毒素酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW070.01)。试剂盒提供的试剂：标准溶液、抗体溶液、酶标物、显色液、终止液、浓缩洗涤液、空白对照。自备物品：氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、蒸馏水。
2.1.1.3样品中霉菌毒素的提取
饲料和粪样样品中的黄曲霉毒素B1含量的测定，参照黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒说明书进行；玉米赤霉烯酮酶含量的测定，参照玉米赤霉烯酮酶联免疫试剂盒说明书进行；呕吐毒素含量的测定，参照呕吐毒素酶联免疫试剂盒说明书进行。
2.1.1.4结果与分析
试验和对照各组正试期间每20天期末鸡粪样品霉菌毒素检测结果见表1。
表1鸡粪样品中霉菌毒素的含量(单位：μg/kg、％)
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，对照组鸡排泄物样品中黄曲霉毒素B1含量为饲料中含量的48.2％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18的鸡排泄物样品中黄曲霉毒素B1含量分别为饲料中含量的24.5％、9.1％、8.8％，添加酿酒酵母yk18降解黄曲霉毒素B1效果显著。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，对照组鸡排泄物样品中玉米赤霉烯酮含量为饲料中含量的20.2％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18的鸡排泄物样品中玉米赤霉烯酮含量分别为饲料中含量的8.7％、2.8％、2.4％，添加酿酒酵母yk18降解玉米赤霉烯酮效果显著。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，对照组鸡排泄物样品中呕吐毒素含量为饲料中含量的43.2％，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18的鸡排泄物样品中呕吐毒素含量分别为饲料中含量的19.1％、10.4％、9.8％，添加酿酒酵母yk18降解呕吐毒素效果显著。
2.2酿酒酵母yk18对蛋鸡产蛋率的影响
经对各试验组数据进行统计分析，试验各组在整个试验期的产蛋率分别为：64.00％、86.59％、89.74％、88.60％。显著性分析检验表明，添加0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组的产蛋率均极显著高于其它各组(P&lt;0.01)；添加0.1％酿酒酵母yk18组的产蛋率极显著高于空白对照组(P&lt;0.01)，其中以0.2％酿酒酵母yk18组的产蛋率为最高(表2)。
表2霉去净对蛋鸡生产性能的影响(单位：％、kg、g)
项目 产蛋率 日产蛋总重 蛋重/枚 料蛋比
Ⅰ组 64.00<sup>aA</sup>±5.86 7.70<sup>aA</sup>±0.17 60.15<sup>aA</sup>±1.56 2.17<sup>dD</sup>±0.16
Ⅱ组 86.59<sup>bB</sup>±5.19 11.24<sup>bB</sup>±0.20 64.90<sup>bB</sup>±3.96 2.08<sup>bB</sup>±0.14
Ⅲ组 89.74<sup>cC</sup>±4.83 11.88<sup>bB</sup>±0.15 66.19<sup>cC</sup>±1.48 2.03<sup>aA</sup>±0.12
Ⅵ组 88.60<sup>cC</sup>±5.21 11.77<sup>bB</sup>±0.16 66.40<sup>cC</sup>±1.46 2.05<sup>AB</sup>±0.12
注：以上同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著(P&lt;0.05)，大写字母表示差异极显著(P&lt;0.01)，下同。
2.3酿酒酵母yk18对蛋鸡产蛋重的影响
由表2可知，产蛋鸡霉变饲料严重影响单枚蛋重和日产蛋总重。添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组单枚蛋重和日平均产蛋总重均极显著高于对照组(P&lt;0.01)；添加0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组单枚蛋重和每日平均产蛋总重均显著高于添加0.1％酿酒酵母yk18组(P&lt;0.01)；添加0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组单枚蛋重和每日平均产蛋总重差异不明显。
2.4酿酒酵母yk18对蛋鸡料蛋比的影响
由表2表明，添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组的料蛋比极显著低于空白对照组。添加0.2％酿酒酵母yk18组的料蛋比极显著低于添加0.1％酿酒酵母yk18组的料蛋比(P&lt;0.01)。添加0.2％、0.3％酿酒酵母yk18组的料蛋比差异不显著。
2.5各组蛋品质分析结果
在试验结束前，选取试验效果比较显著的0.2％酿酒酵母yk18组和0.3％酿酒酵母yk18的蛋与对照组的蛋进行蛋品质量比较分析，结果表明：在蛋壳强度、蛋黄比色、蛋壳百分率、哈氏单位等指标上，0.2％和0.3％酿酒酵母yk18组和空白对照组之间没有显著差异(P&gt;0.05)；在蛋形指数(长径比横径)上，0.2％酿酒酵母yk18组显著高于0.3％酿酒酵母yk18组(P&lt;0.05)，但二组与空白对照组间没有显著差异(P&gt;0.05)；在蛋壳厚度上，空白对照组极显著高于两个试验组的蛋壳厚度(P&lt;0.01)；在蛋黄百分率上，0.2％酿酒酵母yk18组显著高于对照组(P&lt;0.05)(见表3)。
表3酿酒酵母yk18对鸡蛋常规品质的影响(单位：㎏/㎝2、mm、％)
项目 蛋形指数 蛋壳强度 蛋壳厚度 蛋黄比色 蛋壳百分率 蛋黄百分率 哈氏单位
Ⅰ组 1.31<sup>abA</sup>±0.045 13.41<sup>a</sup>±3.06 0.43<sup>aA</sup>±0.03 9.10<sup>a</sup>±0.79 12.40<sup>a</sup>±0.91 25.06<sup>bA</sup>±1.78 75.45<sup>a</sup>±6.95
Ⅲ组 1.32<sup>aA</sup>±0.036 14.53<sup>a</sup>±2.79 0.41<sup>bB</sup>±0.03 9.36<sup>a</sup>±0.79 12.22<sup>a</sup>±0.01 25.88<sup>aA</sup>±1.47 75.14<sup>a</sup>±7.78
Ⅵ组 1.30<sup>bA</sup>±0.032 13.90<sup>a</sup>±2.80 0.40<sup>bB</sup>±0.02 9.16<sup>a</sup>±0.68 12.40<sup>a</sup>±0.61 25.16<sup>abA</sup>±1.72 75.06<sup>a</sup>±12.02
2.6酿酒酵母yk18对蛋鸡饲养经济效益的影响
2.6.1计算依据
各试验组鸡200只，平均日投放饲料0.12kg/只，本次试验期共进行了60天。商品鸡蛋按8.00元/kg、饲料按2.40元/kg、酿酒酵母yk18成本按30元/kg计。
2.6.2计算公式
计算时按试验期内各组实际产蛋重、饲料消耗量和酿酒酵母yk18添加量，按下列公式计算毛利润：毛利润(元)＝蛋重×8.00－饲料×2.4－酿酒酵母yk18费用
2.6.3试验期各组鸡的毛利润分析
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，结果表明，添加0.1％、0.2％、0.3％的酿酒酵母yk18可分别比对照组增加收入1656.00元、1920.00元、1824.00元，经济效益显著(见表4)。
表4试验期间各组获毛利润分析
3.结论
试验期间，未添加酿酒酵母yk18对照组蛋鸡采食量减少，精神萎靡，体重下降，产蛋量下降；肠道病增多，出现经常性拉稀，而且拉稀症状严重，排黑色粘性粪便；鸡冠肿大、发红、出现“假公鸡”现象。添加酿酒酵母yk18试验各组均未出现上述现象。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％酿酒酵母yk18,经过60天饲养试验，鸡排泄物的样品中黄曲霉毒素B1含量降为饲料中含量的2.9％～8.1％，玉米赤霉烯酮含量为饲料中含量的8.7％～21.3％，呕吐毒素含量为饲料中含量的9.8％～19.1％，添加酿酒酵母yk18降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素效果显著。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18，添加0.1％与0.2％、0.3％组降解霉菌毒素差异显著，添加0.2％、0.3％组降解霉菌毒素差异不显著，以添加0.2％组降解霉菌毒素效果最显著，考虑到使用成本和效果的关系，建议应用过程中添加量为0.2％比较经济。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18基本上不影响产蛋鸡的生产性能，产蛋率可达86.59％～89.74％，单枚蛋重、日产蛋总重、料蛋比与空白对照组差异显著。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加酿酒酵母yk18不会降低蛋的品质。在日粮中添加0.2％的酿酒酵母yk18，该组的蛋黄占整个蛋的百分比，比对照组提高了3.27％，提高幅度显著；该组的蛋壳厚度比对照组下降4.65％，且下降幅度显著；该组蛋的哈氏单位比对照组提高了2.24％，但差异不显著，其他常规指标间没有显著差异。
在产蛋鸡的霉变饲料的日粮中添加0.1％、0.2％、0.3％的酿酒酵母yk18可分别比对照组增加收入1656.00元、1920.00元、1824.00元，经济效益显著。
由以上可以清楚的看出，本发明菌株yk18是申请人经科学研究、试验和对实践总结才筛选出的具有特异性的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，可有效用于制备高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的霉菌毒素生物降解剂，实现菌株yk18在制备高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素的霉菌毒素生物降解剂中的应用，及在生长肥育猪和蛋鸡霉变饲料中的应用，高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响。作为霉菌毒素生物降解剂，用在生长肥育猪和蛋鸡的霉变饲料中，可显著降低发病率，提高养殖经济效益，仅就猪而言，经计算，每头猪可增收166元以上；蛋鸡产蛋率达89％以上，与对照组相比，可增加收入1800元以上，经济和社会效益巨大。

Claims (7)

1.一种降解霉菌毒素的菌株yk18，分类命名为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的降解霉菌毒素的菌株yk18在生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵制备霉菌毒素生物降解剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的降解霉菌毒素的菌株yk18在生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵制备霉菌毒素生物降解剂中的应用，其特征在于，所述的生产菌种的制备是，将低温保存的酿酒酵母yk18在种子平板培养基上活化，挑取单菌接种于含种子液体发酵培养基的试管中，32℃，200r/min摇床培养24小时后，以v/v计的2%转接于含种子液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18发酵培养种子液；所述的种子平板培养基是：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml 含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5；种子液体培养基配制：溶解10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml 含20g葡萄糖灭菌溶液，pH值6.5。
4.根据权利要求2所述的降解霉菌毒素的菌株yk18在生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵制备霉菌毒素生物降解剂中的应用，其特征在于，所述的液体深层有氧发酵是，在1000ml的三角瓶加入液体发酵培养基300ml,按v/v计的5%添加量加入液体发酵种子液15ml，32℃，200r/min摇床培养24h，得到液体发酵培养液；所述的液体深层有氧发酵培养基配制：称取麦芽汁培养基130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求2所述的降解霉菌毒素的菌株yk18在生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵制备霉菌毒素生物降解剂中的应用，其特征在于，所述的固体无氧发酵是，在1000ml的三角瓶中加入固体发酵培养基200g,按质量比3％的添加量将酿酒酵母yk18液体发酵培养液6g加到含固体培养基的三角瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封瓶口，放于32℃恒温培养箱中培养48h,得到固体无氧发酵培养物；所述的固体无氧发酵培养基配制：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基干物质的总质量添加3%硫酸铵，加水使培养基含水量达到68%，pH值6.5，121℃灭菌60min；其中麸皮：粗蛋白≥15.0%，粗纤维﹤9.0%，粗灰分﹤6.0%；玉米芯粉：粗蛋白≥2.2%，粗纤维﹤29.7%，粗灰分﹤6.0%；玉米粉：粗蛋白≥10.0%，粗纤维﹤9.0%，粗灰分﹤6.0%；豆粕粉：粗蛋白≥44.0%，粗纤维﹤5.0%，粗灰分﹤6.0%。
6.根据权利要求5所述的降解霉菌毒素的菌株yk18在生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵制备霉菌毒素生物降解剂中的应用，其特征在于，所述的所得的固体无氧发酵培养物均匀散于瓷盘中，放于室温，自然风干，粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×108个/g，即为酿酒酵母yk18霉菌毒素生物降解剂。
7.根据权利要求2所述的降解霉菌毒素的菌株yk18在生产菌种的制备、液体深层有氧发酵、固体无氧发酵制备霉菌毒素生物降解剂中的应用，其特征在于，所述的霉菌毒素生物降解剂在生长肥育猪和蛋鸡的霉变饲料中的应用，可高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素。
CN201811370464.6A 2018-11-17 2018-11-17 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用 Active CN109321478B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811370464.6A CN109321478B (zh) 2018-11-17 2018-11-17 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811370464.6A CN109321478B (zh) 2018-11-17 2018-11-17 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109321478A true CN109321478A (zh) 2019-02-12
CN109321478B CN109321478B (zh) 2021-07-16

Family

ID=65257865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811370464.6A Active CN109321478B (zh) 2018-11-17 2018-11-17 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109321478B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110563499A (zh) * 2019-07-09 2019-12-13 湖北新保得生物科技有限公司 一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法
CN112094763A (zh) * 2020-09-02 2020-12-18 青岛普罗百世生物科技有限公司 一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090098244A1 (en) * 2001-12-20 2009-04-16 Erber Aktiengesellschaft Microorganism for biological detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and/or zearalenons, as well as method and use thereof
CN103952324A (zh) * 2014-05-06 2014-07-30 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种马克思克鲁维酵母c2及制备方法和应用
CN105441343A (zh) * 2015-11-24 2016-03-30 中国农业科学院饲料研究所 一株酿酒酵母及其酿酒酵母培养物
CN107312722A (zh) * 2017-06-22 2017-11-03 河南工业大学 降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株及其驯化培育方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090098244A1 (en) * 2001-12-20 2009-04-16 Erber Aktiengesellschaft Microorganism for biological detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and/or zearalenons, as well as method and use thereof
CN103952324A (zh) * 2014-05-06 2014-07-30 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种马克思克鲁维酵母c2及制备方法和应用
CN105441343A (zh) * 2015-11-24 2016-03-30 中国农业科学院饲料研究所 一株酿酒酵母及其酿酒酵母培养物
CN107312722A (zh) * 2017-06-22 2017-11-03 河南工业大学 降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株及其驯化培育方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张秀江等: "新型霉菌毒素生物降解剂的创制与应用", 《河南省科学院生物研究所有限责任公司》 *
张秀江等: "酵母菌对饲料中黄曲霉毒素B1的降解和脱除作用研究", 《河南科学》 *
戎晓平: "霉菌毒素生物降解技术与传统吸附剂区别", 《广东饲料》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110563499A (zh) * 2019-07-09 2019-12-13 湖北新保得生物科技有限公司 一种以黄酒糟为基质生产氨基酸叶面肥的方法
CN112094763A (zh) * 2020-09-02 2020-12-18 青岛普罗百世生物科技有限公司 一株酿酒酵母及其在育肥猪饲料中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109321478B (zh) 2021-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101463329B (zh) 一种酿酒酵母、含有该酵母的酵母制剂、饲料、其制备方法及其用途
CN103981118B (zh) 一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用
CN106260540B (zh) 一种用于教槽料的生物饲料及教槽料
CN102168045B (zh) 一种枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法
CN101690545B (zh) 一种菌剂与酶复合微生态制剂的生产方法
CN101638627B (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用
CN101869184B (zh) 一种微生物饲料添加剂及其制备方法
CN101099543B (zh) 一种水产生物饲料及其制备方法
CN104770575B (zh) 一种黄芪微生态制剂及其制备方法和应用
CN102517238B (zh) 一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用
CN106260504B (zh) 一种利用啤酒酵母泥生产微生物发酵湿饲料的方法
CN102559545A (zh) 一种水产用复合微生态制剂及其预混料
CN102433283A (zh) 一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用
CN104293696A (zh) 一株粪肠球菌hew-a131及其应用
CN103088010A (zh) 一种生物保健垫料及其制备方法
CN103184174B (zh) 培养基中含腐植酸钠饲料用枯草芽孢杆菌生物制剂的生产
CN102559560B (zh) 一种发酵后高产乳酸的地衣芽孢杆菌及其制剂和应用
CN111534459B (zh) 一株高产淀粉酶的发酵乳杆菌及其在制备发酵饲料中的应用
CN109554356A (zh) 一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂及其应用
CN112136965B (zh) 一种增免促生长型发酵中草药饲料添加剂及其制备方法
CN111647541B (zh) 丁酸梭菌活菌制剂及其生产方法、动物饲料添加剂
CN107821789A (zh) 一种提高鱼虾肠道健康度的生物酵素及其制备方法和应用
CN103301409B (zh) 防治虾偷死病的组合物及其制备方法
CN103098980A (zh) 一种微生物秸秆饲料发酵剂
CN109321478A (zh) 一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant