CN107312722A - 降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株及其驯化培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，是以安琪酵母菌为基础菌种，将其接种于含不同玉米赤霉烯酮浓度的PDA培养液中进行逐级传代培养；得到的新酵母菌株。该新酵母菌株已保藏，保藏编号为CGMCC No. 13752。该新酵母菌株具有高度安全性，可应用于降解饲料原料及产品、谷物及其制品中的玉米赤霉烯酮毒素，并降解为无毒产物。该新酵母菌株传代培养不退化，具有遗传稳定性。同时，本发明所提供的酵母菌株驯化培育方法步骤简单、易于操作。
Description
技术领域
本发明属于生物降解毒素的方法，尤其是涉及一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株及其驯化培育方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由多种镰刀菌产生并释放到环境中的真菌毒素，具有雌激素样作用，主要表现为慢性毒性，包括对生殖系统的毒性以及基因毒性和内分泌系统的影响。动物采食被玉米赤霉烯酮污染的饲料容易导致动物繁殖周期紊乱，甚至造成繁殖障碍，影响动物生产发育中的机体，尤其是在胎儿及新生儿期，体内一些保护性屏障及代谢、排泄等生理功能尚未完善，对玉米赤霉烯酮更具有易感性。玉米赤霉烯酮在1～3mg/kg 时即能刺激雌激素受体转录，导致繁殖障碍。大多数动物对玉米赤霉烯酮都比较敏感，如猪、牛、绵羊、火鸡和鸡等。玉米赤霉烯酮可对雌性动物的生殖系统造成毒害，并通过胎盘的吸收从母体传给胎儿，损害幼体的健康甚至造成流产。在畜禽中，猪尤其是后备母猪对玉米赤霉烯酮最为敏感，当饲料中含有1 mg/kg以上的玉米赤霉烯酮时就可以引起猪的雌性激素中毒。由于玉米赤霉烯酮是作物在田间生长期间由镰刀霉菌产生的，对其预防很难有成效，必须采取有效的脱毒技术来消除玉米赤霉烯酮的污染。
目前控制玉米赤霉烯酮的方法主要包括物理方法、化学方法及生物方法。常用的控制玉米赤霉烯酮的物理方法有剔除、水洗、脱壳、碾磨、热处理、压煮、辐照和吸附剂吸附等。对于轻微污染玉米赤霉烯酮的谷物可以采取剔除、水洗、脱壳和碾磨等手段清除部分毒素，一般适用于少量谷物中玉米赤霉烯酮的清除。采用热处理和压煮方法对产生玉米赤霉烯酮的真菌起到杀菌作用，但是由于玉米赤霉烯酮的性质很稳定，所以这两种方法对玉米赤霉烯酮的作用并不大，且高温处理会破坏食品或饲料的营养价值。辐照技术处理真菌毒素不但能有效清除毒素，还能同时杀死镰刀菌，但辐照降解后产物的组成、性质以及毒理等尚缺乏研究。吸附剂吸附也是一种能有效清除玉米赤霉烯酮污染的方法，但吸附方法在吸附毒素的同时也会吸附食物中的营养物质，并且由于毒素并未得到降解，会为环境带来污染。常用的清除玉米赤霉烯酮的化学方法包括臭氧处理、双氧水处理及碳酸钠浸泡等，但是化学试剂的添加会引入许多不确定因素，生成新产物的潜在毒性也需进一步研究。
为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株及其驯化培育方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae ，保藏编号：CGMCC No. 13752，于2017年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，具体包括以下步骤：
（1）提供N份PDA液体培养基和一种安琪酵母种子液；分别向N份所述PDA液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得N个不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基；
（2）以相同接种量将所述安琪酵母种子液分别接种到N个不同玉米赤霉烯酮浓度的所述驯化培养基中进行培养，得到N份一次诱导混合菌株液；分别检测N份所述一次诱导混合菌株液中上清液的玉米赤霉烯酮浓度，选取玉米赤霉烯酮浓度降解率最大的一次诱导混合菌株液在PDA培养平板上进行划线扩增培养，得到循环出发菌种；
（3）依次采用N 份所含玉米赤霉烯酮浓度由低到高的所述驯化培养基对所述循环出发菌种进行逐级传代培养，当逐级传代培养后的上清液中的玉米赤霉烯酮浓度不变时，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种，其中N为大于等于2的自然数。
需要说明都是，在依次采用N 份所含玉米赤霉烯酮浓度由低到高的所述驯化培养基对所述循环出发菌种进行逐级传代培养时具体操作步骤为：首先以接种量为1%～3%将所述循环出发菌种接种到装有玉米赤霉烯酮浓度最低的所述驯化培养基中，置于30 ℃、180rpm /min，摇床培养48 h～72 h，得到二代循环出发菌种；然后将该二代循环出发菌种接种到装有玉米赤霉烯酮浓度高一级的所述驯化培养基中，置于30 ℃、180 rpm /min，摇床培养48 h～72 h，得到三代循环出发菌种；最后依次重复上述步骤，实现对所述循环出发菌种进行逐级传代培养。
基于上述，所述步骤（1）中，所述PDA液体培养基的制备方法包括：首先按照质量比为（8～10）：（1～3）的比例分别称取马铃薯和葡萄糖，将所述马铃薯洗净去皮、切块后煮沸成糊状，经过滤处理得到马铃薯泥，向所述马铃薯泥中加入所述葡萄糖并进行灭菌处理，制得所述PDA液体培养基。
基于上述，所述步骤（1）中，所述安琪酵母种子液的制备方法包括：以接种量为0.5%～3.5%的标准将安琪酵母粉接种至所述PDA液体培养基中，并于30℃、180 rpm /min条件下对其恒温震荡培养40 h～63 h，得到所述安琪酵母种子液。
基于上述，所述降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法还包括提供一种菌种保存培养基，将所述降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种保存于所述菌种保存培养基中。
基于上述，制备所述菌种保存培养基的步骤包括：首先按照质量比为（8～10）：（1～3）：1的比例分别称取马铃薯、葡萄糖和琼脂粉，将所述马铃薯洗净、去皮、切块并置于蒸馏水中进行蒸煮，经纱布过滤后得到马铃薯泥，然后将所述葡萄糖和所述琼脂粉溶解于所述马铃薯泥中并进行灭菌处理，制得所述菌种保存培养基。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明所提供的一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，是以食用安琪酵母粉为出发菌株，经过玉米赤霉烯酮多次诱导驯化得到的新酵母菌株，具有高度安全性，对人体无害，可应用于降解饲料原料及产品、谷物及其制品中的玉米赤霉烯酮毒素，并降解为无毒产物，保障了饲料原料及其产品、谷物及其制品的食用安全性。
另外，由本发明所提供的驯化培育方法获得的降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种对玉米赤霉烯酮的降解能力可达到20%，所述降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种经扩增培养后制取的新酵母菌株培养液，对玉米赤霉烯酮的降解能力可达到54.2%；经过10代培养后获取的酵母菌株及其培养液对玉米赤霉烯酮的降解率可达到78.5%。同时，经驯化后的第一代酵母菌株经10次以上传代培养不退化，具有遗传稳定性，并且酵母培养液的降解能力远远高于菌株本身，有利于在饲料中添加使用。另外本发明所提供的酵母菌株驯化培育方法步骤简单、易于操作。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株，该酵母菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏编号：CGMCC No. 13752，于2017年03月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” 具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本实施例还提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，具体包括以下步骤：
（1）首先称取200 g马铃薯，洗净去皮、切成小块并将其煮沸成糊状经八层纱布过滤后得到马铃薯泥，向所述糊状马铃薯泥中加入20 g葡萄糖，然后分装至锥形瓶并置于115 ℃下灭菌25 min，制得PDA液体培养基；
然后将所述PDA液体培养基分为10份，以接种量为1%的标准将安琪酵母粉接种至其中一份所述PDA液体培养基中，并于30℃、180 rpm /min条件下对其恒温震荡培养48 h，得到安琪酵母种子液；分别向剩余9份所述PDA液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得玉米赤霉烯酮浓度分别为3.5 μg/mL、4.0μg/mL、4.10 μg/mL、4.87 μg/mL、5.0 μg/mL、5.77 μg/mL、6.0 μg/mL、6.25 μg/mL和6.5 μg/mL的9种不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基，并分别将其装入9个三角瓶中；
（2）将所述安琪酵母种子液分别接种到上述步骤（1）所制备的9 个装有不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基三角瓶中；将接种后的9个三角瓶置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h，得到9份一次诱导混合菌株液；分别检测9份所述一次诱导混合菌株液中上清液的玉米赤霉烯酮浓度，并将上清液中玉米赤霉烯酮浓度降解率数值最大的一次诱导混合菌株液在PDA培养平板上进行划线扩增培养，得到循环出发菌种；
（3）以接种量为1%的标准将所述循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.5 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到二代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该二代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.0 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到三代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该三代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.10 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到四代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该四代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.87 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到五代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该五代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.0 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到六代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该六代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.77 μg/mL的驯化培养基中并置于30℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到七代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该七代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.0 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180rpm /min下摇床培养72 h后，得到八代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该八代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.25 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到九代循环出发菌种，以接种量为1%的标准将该九代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.5 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到十代循环出发菌种。
每代培养结束后，分别检测每代上清液中玉米赤霉烯酮的浓度，当上清液中玉米赤霉烯酮的浓度不变时，认为达到该菌种对玉米赤霉烯酮的最大耐受能力，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种。
该降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法还包括制备一种菌种保存培养基，将所述降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种保存于所述菌种保存培养基中。其中制备该菌种保存培养基的步骤包括：首先按照质量比为10：1：1的比例分别称取马铃薯、葡萄糖和琼脂粉，将所述马铃薯洗净去皮切块并置于蒸馏水中进行蒸煮，经纱布过滤后得到马铃薯泥，然后将所述葡萄糖和所述琼脂粉溶解于所述马铃薯泥中并进行灭菌处理，制得所述菌种保存培养基。
性能测试
毒素降解试验：
由本实施例所提供的降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法中，所述步骤（2）出现了有三份降低玉米赤霉烯酮浓度的培养基，分别命名为T1、T2、T3，三份降低玉米赤霉烯酮浓度的培养基中玉米赤霉烯酮降解率分别为5.12%、7.68%和22.08%。
然后将T3作为选育对象采用所述步骤（3）对其进行逐级传代培养，驯化选育出一株能够稳定降解玉米赤霉烯酮的第一代酵母菌生产菌种，此第一代酵母菌生产菌种在30℃、180 rpm条件下对玉米赤霉烯酮的降解率稳定保持在20%以上，并对所述第一代酵母菌生产菌种在不同共培养时间对玉米赤霉烯酮的降解效果进行了测定，可将玉米赤霉烯酮浓度由6.25 μg/mL降低至4.10 μg/mL，降解率为34.4%；
最后采用所述PDA液体培养基对所述第一代酵母菌生产菌种进行10代培养，经过10代培养后获取的第十代酵母菌生产菌种及其培养液对玉米赤霉烯酮的降解率达到78.5%。
实施例2
本实施例提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，具体步骤与实施例1中的步骤大致相同，不同之处在于：
所述步骤（1）中，向剩余9份所述PDA液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得玉米赤霉烯酮浓度分别为3.0 μg/mL、3.5 μg/mL、4.2 μg/mL、4.65 μg/mL、5.1 μg/mL、5.67μg/mL、6.2 μg/mL、6.3 μg/mL和6.7 μg/mL的9种不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基，并分别装入9个三角瓶中；
所述步骤（3）为：以接种量为3%的标准将所述循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.0 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72h后，得到二代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该二代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.5 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到三代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该三代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.2 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到四代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该四代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.65 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到五代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该五代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.1 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到六代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该六代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.67 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到七代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该七代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.2 μg/mL的驯化培养基中并置于30℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到八代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该八代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.3 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180rpm /min下摇床培养72 h后，得到九代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该九代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为6.7 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到十代循环出发菌种。
每代培养结束后，分别检测每代上清液中玉米赤霉烯酮的浓度，当上清液中玉米赤霉烯酮的浓度不变时，认为达到该菌种对玉米赤霉烯酮的最大耐受能力，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种。
实施例3
本实施例提供一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，具体步骤与实施例1中的步骤大致相同，不同之处在于：
所述步骤（1）中，将所述PDA液体培养基分为6份，以接种量为3%的标准将安琪酵母粉接种至其中一份所述PDA液体培养基中，并于30℃、180 rpm /min条件下对其恒温震荡培养48h，得到安琪酵母种子液。分别向剩余5份所述PDA液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得玉米赤霉烯酮浓度分别为3.9 μg/mL、4.82 μg/mL、4.98 μg/mL、5.35 μg/mL、5.88μg/mL的5种不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基并分别装入5个三角瓶中制得驯化培养基；
所述步骤（3）为：以接种量为3%的标准将所述循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为3.9 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72h后，得到二代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该二代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.82 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到三代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该三代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为4.98 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到四代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该四代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.35 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72 h后，得到五代循环出发菌种，以接种量为3%的标准将该五代循环出发菌种接种到玉米赤霉烯酮浓度为5.88 μg/mL的驯化培养基中并置于30 ℃、180 rpm /min下摇床培养72h后，得到六代循环出发菌种。每代培养结束后，分别检测每代上清液中玉米赤霉烯酮的浓度，当上清液中玉米赤霉烯酮的浓度不变时，认为达到该菌种对玉米赤霉烯酮的最大耐受能力，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (6)
1.一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株，其特征在于，该酵母菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae ，保藏编号：CGMCC No. 13752，于2017年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，包括以下步骤：
（1）提供N份PDA液体培养基和一种安琪酵母种子液；分别向N份所述PDA液体培养基中添加玉米赤霉烯酮甲醇储备液，制得N个不同玉米赤霉烯酮浓度的驯化培养基；
（2）以相同接种量将所述安琪酵母种子液分别接种到N个不同玉米赤霉烯酮浓度的所述驯化培养基中进行培养，得到N份一次诱导混合菌株液；分别检测N份所述一次诱导混合菌株液中上清液的玉米赤霉烯酮浓度，选取玉米赤霉烯酮浓度降解率最大的一次诱导混合菌株液在PDA培养平板上进行划线扩增培养，得到循环出发菌种；
（3）依次采用N 份所含玉米赤霉烯酮浓度由低到高的所述驯化培养基对所述循环出发菌种进行逐级传代培养，当逐级传代培养后的上清液中的玉米赤霉烯酮浓度不变时，保留此菌种作为降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种，其中N为大于等于2的自然数。
3.根据权利要求2所述的降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述PDA液体培养基的制备方法包括：首先按照质量比为（8～10）：（1～3）的比例分别称取马铃薯和葡萄糖，将所述马铃薯洗净去皮、切块后煮沸成糊状，经过滤处理得到马铃薯泥，向所述马铃薯泥中加入所述葡萄糖并进行灭菌处理，制得所述PDA液体培养基。
4.根据权利要求3所述的降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述安琪酵母种子液的制备方法包括：以接种量为0.5%～3.5%的标准将安琪酵母粉接种至所述PDA液体培养基中，并于30℃、180 rpm /min条件下对其恒温震荡培养40 h～63 h，得到所述安琪酵母种子液。
5.根据权利要求4所述的降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，其特征在于，它还包括提供一种菌种保存培养基，将所述降解玉米赤霉烯酮的酵母菌生产菌种保存于所述菌种保存培养基中。
6.根据权利要求5所述的降解玉米赤霉烯酮的酵母菌株的驯化培育方法，其特征在于，制备所述菌种保存培养基的步骤包括：首先按照质量比为（8～10）：（1～3）：1的比例分别称取马铃薯、葡萄糖和琼脂粉，将所述马铃薯洗净、去皮、切块并置于蒸馏水中进行蒸煮，经纱布过滤后得到马铃薯泥，然后将所述葡萄糖和所述琼脂粉溶解于所述马铃薯泥中并进行灭菌处理，制得所述菌种保存培养基。
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