CN103952324B - 一种马克思克鲁维酵母c2及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马克思克鲁维酵母C2及制备方法和应用，马克思克鲁维酵母C2？<b><i>kluyeromyces？marxianus</i></b>？C2，CCTCC？NO：M2014059，该酵母能降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A，生物降解率均达到80%以上。将发酵后的马克思克鲁维酵母C2按一定比例投入受毒素污染的液体或固体粮食或饲料基质中，可使霉菌毒素得到快速、安全、高效地降解脱毒；还可用于动物口服解毒。本发明所述菌株具有生产使用成本低，使用安全的优势，具备广泛的应用前景。

Description

一种马克思克鲁维酵母C2及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种马克思克鲁维酵母C2，该酵母能降解多种霉菌毒素，还涉及该酵母的制备方法和应用。

背景技术

据联合国粮农组织(FAO)估计，全世界每年有25％的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2％不能食用；加之因毒素污染导致动物中毒引起的疾病和死亡，给粮食工业和畜牧业造成巨大的经济损失。调查发现，动物性原料鱼粉同时被多种霉菌毒素污染的情况也很普遍。动物采食霉变饲料后，会引起体重下降或引发疾病。霉变的饲料被动物采食后，毒素及其代谢产物可残留在畜产品及其加工制品中，通过食物链进入人体，这些具有极强致病及致癌作用的毒素严重威胁人类的健康，对人和动物危害较大且为大众熟知并被广泛研究的只有黄曲霉毒素B1(AFB1)，玉米赤霉烯酮(ZEE)，呕吐毒素(DON)，T-2毒素，赭曲霉毒素A(OTA)以及烟曲霉毒素(FUM)等。传统的物理和化学方法去除霉菌毒素存在效果不稳定、营养成分损失大、饲料适口性差，较难广泛用于生产实践。霉菌毒素生物降解指微生物、植物及其代谢产生的酶与毒素作用，使其分子结构中毒性基团被破坏而生成无毒降解产物的过程。微生物对霉菌毒素的生物降解，在饲料加工上可以控制霉菌毒素的污染，在养殖过程中减轻霉菌毒素污染带来的危害，同时减少各种化学添加剂的用量，不会造成营养价值的丢失，保障健康养殖。另外由于微生物数量大、种类多，基因资源丰富，降解有机物污染的潜力很多，几乎所有导致环境污染的有机物都能被微生物所分解，而且干净彻底、无二次污染。因此，越来越多的研究者对霉菌毒素的生物降解菌进行了不懈的研究，譬如专利申请号为200810122672.4、名称为“一种能对霉菌毒素降解的菌株及其制剂的制备方法”提供了一种德沃斯氏菌的细菌制剂能用于单端孢霉烯族毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素的生物降解；专利申请号为201210133701.3、名称为“黄曲霉毒素B₁生物降解剂的制备方法及其应用”提供了一种利用黑曲霉及其提取物用于黄曲霉毒素B1的生物降解。专利申请号为201310083469.1、名称为“一种玉米赤霉烯酮生物降解剂的制备方法及应用”提供了一种啤酒酵母提取物能用于玉米赤霉烯酮毒素的生物降解；上述专利，同时降解多种霉菌毒素的德沃斯氏菌为德沃斯氏菌菌属，该菌属并未列入国内外的允许直接饲喂且通常认为是安全的微生物目录，因此该菌还需要进一步的安全性验证，而另外两种可以直接喂饲的黑曲霉及啤酒酵母都只降解单一种类的毒素。

马克思克鲁维酵母(kluyeromycesmarxianus)是广泛存在于自然界的一种非治病性酵母菌，其具有降解酶种类多和分解能力强的良好生物特性，在乳制品中作为乳糖酶和菊粉酶重要来源，其在农业生产中广泛使用安全性也得到了欧洲食品安全委员会(EFSA)的认可。本发明中马克思克鲁维酵母解除多种毒素的作用，显示出其特殊的生化生理特性，从更广泛的领域利用该菌种的优良性能为人们的生产及生活服务是很有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种马克思克鲁维酵母C2，该酵母能降解去黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A，减少了粮食生产和饲料加工和保存过程中霉菌毒素污染对人和动物的危害，通过生物降解安全、有效的降低粮食或饲料或动物体内的毒素水平，开发研制出对多种霉菌毒素降解的菌株及其制剂。

本发明的另一个目的是在于提供了一种马克思克鲁维酵母C2的制备方法，方法易行，操作简便，相对传统的物理和化学降解法方法有毒素去除率高、不会对饲料原料造成营养破坏等优势，相对于其他生物降解有降解毒素种类多、降解效率高等优点。

本发明的再一个目的是在于提供了一种马克思克鲁维酵母C2在制备动物饲料添加剂中的应用，该菌剂的添加除了能像普通酵母菌一样为饲料中营养成分的消化利用提供多种降解酶、产生富蕴的酒香味增加动物食欲，还能抑制饲料的霉变或降低饲料中霉菌毒素的水平，并且环境耐受性好，达到多重应用效果。

本发明最后一个目的在于提供了一种马克思克鲁维酵母C2在制备急性霉菌中毒解毒剂中的应用。对于毒素污染而导致急性中毒的动物，可以通过口服马克思克鲁维酵母霉菌毒素去毒剂进行抢救或解毒。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一株能对多种霉菌毒素降解的马克思克鲁维酵母，其特征在于：分类命名：马克思克鲁维酵母C2kluyeromycesmarxianusC2；保藏号为：CCTCCNO：M2014059，该细菌已于2014年3月3日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。

生物学特性：该菌株在麦芽汁琼脂平板上繁殖生长形成的菌落圆形，边缘全缘，脐状突起，乳白色，光滑湿润，直径4～6mm，通过镜检观察，细胞形态呈卵圆或椭圆形，两端出芽生殖。在生孢子培养基上，有子囊孢子形成。不形成假菌丝。在生理生化特征为：发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、棉籽糖等，不发酵可溶性淀粉、L-鼠李糖和海藻糖等。不同化硝酸钾，可同化盐酸乙胺和盐酸尸胺，在无维生素培养基上不能生长，在含100mg/L放线菌酮的培养基上生长良好。适宜生长温度35℃左右。

分子生物学特征：26SrDNA序列，其序列为SEQIDNO.1所示。

一种能降解多种霉菌毒素的马克思克鲁维酵母C2菌剂的制备方法，其步骤是：

A、将马克思克鲁维酵母C2菌株原种在培养基上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上获得试管种备用；

B、将马克思克鲁维酵母C2菌株斜面种子，接种YDP一级种子培养基活化，34-36℃下250r/min震荡培养23-25h。

所述的YDP培养基配方为(1L)：葡萄糖20g、酵母粉10g，蛋白胨20g；pH值7.2，121℃下灭菌20min。

C、将培养的种子液按1％(V/V)的接种量接种50L发酵罐中放大培养，发酵培养基装液量65％，培养过程中实时在线补1:4(V/V)泡敌稀释液消泡，调整通气量1:1～1.5，及搅拌转速300～800r/min控制溶氧浓度在30％以上，控温32-34℃，培养17-19h，再作为二级种子液按3％(V/V)的接种量接种下一级发酵罐，进行逐级放大培养，末级放大培养35-37h，至溶解氧DO值自然回升至80％以上，即发酵完毕。

所述的发酵培养基配方(1L)：菊芋粉10～50g、酵母膏5～20g、蛋白胨5～20g、MgSO41～5g、K2HPO41～5g、聚醚0.5～3ml，pH值6.5，121℃下灭菌20min。

D、放罐后经0.8μm孔径陶瓷膜微滤，在压力0.2～0.3MPa浓缩至原体积1/4体积，干物质达到30％左右，再加入10％淀粉填料，通过造粒、干燥得到马克思克鲁维酵母霉菌毒素去毒剂。

一种马克思克鲁维酵母C2在制备动物饲料添加剂或解毒剂中的应用，具体如下：

根据液体或固体粮食或饲料基质受霉菌毒素污染的水平，一般对应度毒素浓度在10μg/kg～1000μg/kg，按处理原料重量的0.1％～10％(w/w)投加马克思克鲁维酵母霉菌毒素去毒剂，拌匀后保持一定温度25～35℃，处理40～80h，使霉菌毒素得到快速、安全、高效地降解脱毒。

一种马克思克鲁维酵母C2在制备急性霉菌中毒解毒剂中的应用，具体如下：

对于毒素污染而导致急性中毒的动物，可以通过口服马克思克鲁维酵母霉菌毒素去毒剂进行抢救或解毒。

在本发明中，所述的霉菌毒素包括但不限于：黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

采用筛选的1株马克思克鲁维酵母菌kluyeromycesmarxianusC2(CCTCCM2014059)，能降解去黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A，其特点是采用发酵培养的马克思克鲁维酵母菌C2细胞及其所产生的降解酶作为一种生物催化剂，按一定比例投入受上述毒素污染的液体或固体粮食或饲料基质中，使霉菌毒素得到快速、安全、高效地降解脱毒；或作为一种生物药剂用于因此类霉菌毒素中毒动物的解毒。

1.本发明提供一种马克思克鲁维酵母，黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A霉菌毒素生物降解率均达到80％以上。

2.本发明提供一种马克思克鲁维酵母霉菌毒素去毒剂，具有生产使用成本低，使用安全的优势。

3.本发明提供一种马克思克鲁维酵母霉菌毒素去毒剂可用于液体或固体粮食或饲料基质脱毒，还可用于动物口服解毒。

4.本发明提供一种马克思克鲁维酵母在具有特有的降解多种霉菌毒素的同时，并具有很强菊糖降解酶活，环境耐受性好。

附图说明

图1为克思克鲁维酵母C2菌株出芽生殖形态示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所述试剂或原料，如未特别说明，均购自生化商店。

实施例1：

一种马克思克鲁维酵母C2的获得，其步骤是：

1、从湖北黄陂自然养殖土猪场采集健康猪新鲜粪便及猪场周边菜地和水沟土壤的样品，将样品用无菌水震荡均匀成悬液，梯度稀释1000后，取0.2ml在添加100ug黄曲霉毒素B1的马丁孟加拉红琼脂平板(购于青岛海博生物)上涂布，30℃下培养出单菌落。挑取不同单菌落在马丁孟加拉红琼脂平板上划线传代数次得到纯化菌株，验证对黄曲霉毒素B1的降解效果，最终获得能够降解黄曲霉毒素B1的菌株，加入甘油，在-80℃冰箱保存。对于该菌株自定义为C2菌株。

2、通过生理生化及26s鉴定，最终确定C2为一株马克思克鲁维酵母，命名马克思克鲁维酵母(kluyeromycesmarxianus)C2(以下简称C2菌株)，该细菌已于2014年3月3日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：马克思克鲁维酵母C2kluyeromycesmarxianusC2，保藏号为CCTCCNO：M2014059，地址中国武汉武汉大学。26SrDNA序列为SEQIDNO.1所示。

C2菌株具体有典型的马克思克鲁维酵母生理生化特征：该菌株在麦芽汁琼脂平板上繁殖生长形成的菌落圆形，边缘全缘，脐状突起，乳白色，光滑湿润，直径4～6mm，通过镜检观察，细胞形态呈卵圆或椭圆形，两端出芽生殖。在生孢子培养基上，有子囊孢子形成。不形成假菌丝。在生理生化特征为：发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、棉籽糖等，不发酵可溶性淀粉、L-鼠李糖和海藻糖等。不同化硝酸钾，可同化盐酸乙胺和盐酸尸胺，在无维生素培养基上不能生长，在含100mg/L放线菌酮的培养基上生长良好。适宜生长温度35℃左右。

实施例2：

一种马克思克鲁维酵母C2的制备方法，其步骤是：

A、用接种环挑取C2菌株斜面种子，接种YDP摇瓶种子培养基，35℃培养18～20h，作为一级种子液。

YDP培养基配方为(1L)：葡萄糖20g、酵母粉10g，蛋白胨20g；pH值7.2，121℃下灭菌20min。

B、将培养的种子液按1％(V/V)的接种量接种50L发酵罐中放大培养，发酵培养基装液量65％，培养过程中实时在线补加消泡剂，控制溶氧浓度在30％以上，控温32℃，培养24h，OD600值达到10左右，作为二级种子液。

C、按3％(V/V)的接种量将二级种子液接种到10t发酵罐发酵培养基中，发酵装液量70％，实时消泡和控制溶氧15％以上，30℃培养30h左右，至溶解氧DO值自然回升至80％以上，即发酵完毕，发酵液菌量达到8.6*10⁸cfu/ml。

D、放罐后经0.8μm孔径陶瓷膜微滤，在压力0.2～0.3MPa浓缩至原体积1/4体积，干物质达到30％左右，再加入10％淀粉填料，通过造粒、干燥得到马克思克鲁维酵母粉剂。粉剂菌量菌量为2.3*10¹⁰cfu/g。

发酵培养基配方(1L)：菊芋粉30g、酵母膏15g、蛋白胨5g、MgSO₄3g、K₂HPO₄5g、聚醚1.5ml，在线补加硅油消泡剂。

实施例3：

C2菌降解黄曲霉毒素B1溶液试验：

配制6000ng/ml的黄曲霉毒素无菌溶液，按1:9(v/v)比例加入以下三种试液中,A₁为按10⁶cfu/ml接种马克思克鲁维酵母C2后的YPD新鲜培养液，B₁为按10⁶cfu/ml接种马克思克鲁维酵母C2培养30h后的YPD发酵液，C₁为未接种马克思克鲁维酵母C2的YPD培养基，将以上溶液放入37度摇床，震荡60h后，用均质机均质破碎，甲醇浸提后待测。检测方法：免疫亲和层析净化高效液相色谱法，结果见表1,马克思克鲁维酵母C2可以在含黄曲霉毒素B1的培养基中生长，并可以代谢法分解黄曲霉毒素B1。

表1C2菌对黄曲霉毒素B1的降解率

样品	毒素浓度(ng/ml)	降解率
			对照C1	580	/
样品A1	89	84.6％
			样品B1	68	88.3％

实施例：4

C2菌降解黄曲霉毒素B1溶液试验：

配制浓度为分别50ng/ml,150ng/ml,450ng/ml的黄曲霉毒素B1无菌溶液各20ml，加入发酵后离心的马克思克鲁维酵母C2的菌泥，使溶液中菌株终浓度达到10⁸cfu/ml，将以上溶液放入37度摇床，震荡60h后，测定黄曲霉毒素B1处理前后浓度，并计算降解率和平均降解速率，结果见表2。

表2不同毒素浓度条件下马克思克鲁维酵母C2的降解率及降解速率

实施例5：

C2菌降解黄曲霉毒素B1固体基质试验：

将黄曲霉毒素B1溶液按毒素终浓度为200ng/g均匀拌入由麸皮、豆粕、玉米粉1:1:1混合而成固体基质中，再加入1％(w/w)的实施例2中制备的C2菌菌粉和35％(v/w)的蒸馏水，拌匀后分为两份，每份约100克装入锥形瓶，其中一份(A₂样)加入微波炉中加热灭活5分钟，另一份(B₂样)不灭活，再将样品放入37度摇床震荡60h后，取10克用均质机均质破碎，甲醇浸提，免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定毒素含量，A₂样品中毒素浓度为156ng/g，而B₂样品中毒素浓度为21ng/g。剩余样品通过小鼠喂食测定两样品的半致死剂量(LD₅₀)，A₂样品的LD₅₀为37g/d*kg,B₂样品的LD₅₀为185g/d*kg。

实施例6:

C2菌对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素的降解

参照实施例3分别配制含500ng/ml玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素的YPD培养基溶液，灭菌处理后按10⁶cfu/ml接种马克思克鲁维酵母C2，以未接菌溶液为对照，将以上溶液放入37度摇床，震荡60h后，用均质机均质破碎，乙腈浸提后用免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定毒素浓度，计算降解率，结果见表3,马克思克鲁维酵母C2菌对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A也有很好的降解效果，但对呕吐毒素的降解并不十分显著，限于其他毒素标准品暂无法获得，因此暂不知道C2菌对其他霉菌毒素的降解效果。

表3C2菌对玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、呕吐毒素的降解率

毒素种类	对照液浓度ng/ml	实验组浓度ng/ml	降解率
				玉米赤霉烯酮	516	102	80.2％
赭曲霉毒素A	508	90	82.3％
				呕吐毒素	510	443	13.1％-

实施例7：

饲料脱毒实验：

选用体重20～30kg左右健康生长猪15头，随机分到3个处理，对照组C₄饲喂典型的玉米豆粕型日粮，霉菌毒素组A₄饲喂由自然霉变玉米100％替代基础饲粮正常玉米的饲粮，实验脱毒组B₄饲喂自然霉变玉米按10⁹cfu/kg拌入C2菌株菌液，保持37℃、湿度恒温处理90h后，代替基础饲粮正常玉米的饲粮，测定饲料脱毒前后的毒素浓度，见表4。自然采食及饮食，按照常规程序进行驱虫和免疫，实验周期为30天，实验始末清晨空腹称重，记录喂食量、增重、料肉比，见表5。

表4脱毒前后霉菌毒素毒素残留浓度

表5C2菌脱毒饲料对猪生长性能影响的对比

平均日增重(kg)

平均采食量(kg)

平均料肉比

对照组C4	0.95±0.18	2.63±0.27	2.77±0.75
				霉菌毒素组A4	0.46±0.21	2.21±0.14	4.8±1.67
脱毒组B4	0.85±0.15	2.45±0.15	3.1±0.66

实施例8：

母猪脱毒实验

选择湖北黄陂某自然养殖猪场，该猪场送检死胎中检测到有霉菌毒素，从该猪场挑选经产仔长白母猪20个，已经配种怀孕，随机分成2组,其中一组饲喂常用饲料(C₅组),另一组在常用饲料中添加10⁷cfu/kgC2菌剂(AF组),观察两组母猪从配种开始到产仔后10d饲喂饲料期间所产仔猪数量与质量。结果几乎C组中所有窝组都有弱仔和死亡,并且仔猪通常吮乳能力下降,甚至没有找奶头的欲望,在母猪食用含有C2菌的饲料后,所产仔猪的弱仔数和死亡数相对降低，见表6。

表6C2菌脱毒对母猪繁殖性能改善

实施例9：

C2菌株其他生产及应用性能

热耐受能力：取C2菌株培养液离心，0.9％生理盐水洗涤两次后重新悬浮(活均量(1～2×l0⁸cfu/ml)于52℃水浴中处理5h后，每隔1h取样迅速流水冷却至室温，然后采用稀释平板法测定酵母菌存活率，见表7。

表7C2菌株在52℃下处理不同时间的存活率

热处理时间(h)	1h	2h	3h	4h	5h
						存活率(％)	92	84	71	56	47

耐胃酸能力：取质量分数为10％的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值为2.0，每100mL盐酸溶液中加1g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，得到人工胃液。取C2菌株培养液离心，0.9％生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以10⁷cfu/ml终浓度接种于人工胃液中，震荡混匀，37℃水浴孵育，2h后取样进行活菌计数，计算存活率为78.8％

耐胆盐能力：配制额外添加1.0％，2.0％，3.0％，4.0％(w/v)猪胆盐的YPD培养基。取取C2菌株培养液离心，0.9％生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以10⁷cfu/ml终浓度接种于不同胆盐浓度的YPD培养基，37℃培养12h后，测定培养液浊度变化，判定菌体生长情况，见表8.

表8：不同浓度猪胆盐对C2菌株生长的影响

注：++代表生长良好，+代表生长一般，-代表不能生长。

C2菌菊粉酶酶活测定：将0.5mlC2菌发酵液加入到4.5ml用pH4.6的0.2mol/L醋酸缓冲液配制的浓度为2％(w/w)的菊糖(市售聚果糖)溶液中，55℃反应10min，沸水灭活。酶活力测定方法：DNS还原糖测定法，酶活定义为：以菊糖为底物，每分钟酶解产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。计算得到，C2菌种发酵液的酶活力在180～200U/ml，达到较高的酶活力水平。

SEQUENCELISTING

<110>武汉科前动物生物制品有限责任公司

<120>一种马克思克鲁维酵母C2及制备方法和应用

<130>一种马克思克鲁维酵母C2及制备方法和应用

<160>1

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>551

<212>DNA

<213>马克思克鲁维酵母

<400>1

caaaggggggcattgccttagtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctg60

gcgtcttcgacgtccgagttgtaatttgaagaaggcgactttgtagctggtccttgtcta120

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gccagctgggactgaggattgcgacttttgtcaaggatgctggcgtaatggttaaatgcc540

gcccgtcttga551

Claims (7)

1.一种马克思克鲁维酵母，其特征在于：马克思克鲁维酵母(kluyeromycesmarxianus)C2，保藏号为CCTCCNO：M2014059。

2.权利要求1所述的马克思克鲁维酵母在制备动物饲料添加剂中的应用。

3.权利要求1所述的马克思克鲁维酵母在制备急性霉菌中毒解毒剂中的应用。

4.权利要求1所述的马克思克鲁维酵母在降解黄曲霉毒素B1中的应用。

5.权利要求1所述的马克思克鲁维酵母在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

6.权利要求1所述的马克思克鲁维酵母在降解赭曲霉毒素A中的应用。

7.权利要求1所述的马克思克鲁维酵母在同时降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A中的应用。