CN107760612A - 一种黑曲霉yy07菌株及其在固体发酵生产饲用酸性蛋白酶中的应用 - Google Patents

一种黑曲霉yy07菌株及其在固体发酵生产饲用酸性蛋白酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黑曲霉yy07菌株及其在固体发酵生产饲用酸性蛋白酶中的应用，可有效解决生产饲用酸性蛋白酶的问题，将黑曲霉（Aspergillus niger）yy07接种到斜面培养基中进行扩增培养，在35‑40℃下培养70‑75h，置于斜面分离培养基中，菌丝长满斜面分离培养基，作为斜面培养基种子，然后接种于固体发酵培养基中，在35‑40℃培养，待菌丝布满培养基表面，孢子全部变黑为止，然后接种到固体发酵培养基中，在35‑40℃下培养，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，低于60℃进行干燥至含水率10%以下，粉碎，本发明有效用于生产饲用酸性蛋白酶，其制备方法科学、先进，原料丰富，成本低，节能、环保，易推广应用，经济和社会效益巨大。

Description

一种黑曲霉yy07菌株及其在固体发酵生产饲用酸性蛋白酶中 的应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种黑曲霉yy07菌株及其在固体发酵生产饲用酸性蛋白酶中的应用。
背景技术
酸性蛋白酶是一种能在酸性（pH值2～5）条件下将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。
国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉（Aspergillus niger）、大孢子黑曲霉突变株（A.niger var. macrosporus）、斋藤曲霉（A. saitoi）、宇佐美曲霉（A. usamii）、泡盛酒曲霉（A. awamori）、微紫青霉（Pen. janthinellum）、常规青霉（Pen. frequentens）、杜邦青霉（Pen. dupoti）、宛氏拟青霉（Paecilomyces varioti）、小孢米曲霉突变株（A. oryzacvar.microsporus）、根霉（Rhizopus sp.）、微小毛霉（M. pusillus）、粘红酵母（Rhdotorulaglutinis）、粟疫霉（Endothia parasitica）、血红色陀螺孔菌（Trametes sanguinca）、芽枝霉（Cladosporium sp.）等。1903年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。
微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3.350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3.350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等（1994年）用60Coγ射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等（1995年）以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为2.5，最适温度为50℃，90℃下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等（1999年），对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等（2006年）对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等（2007）采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云（2008年）通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。
国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流（沸腾）干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。
饲用酸性蛋白酶商业化产品多是由食品级或工业级改变而来。由于是通过液体深层发酵而来，产品生产成本过高，在畜禽养殖业生产中应用比较困难；来源于食品级或工业级的酸性蛋白酶，很难满足畜禽对该类酶的营养需求，造成使用效果不稳定，经济效益差，影响产品推广应用。
随着集约化畜禽养殖业的发展，加剧了对环境、土壤和水体的污染。其中养殖动物氮的排放是污染的主要物质之一，因而提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低氮排放就显得尤为重要。此外，由于我国蛋白质饲料资源缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低。因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视。
但如何以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线(UV)与亚硝基胍(NTG) 联合诱变技术，筛选出产酸性蛋白酶的黑曲霉yy07（Aspergillus niger yy07）菌株，并固体发酵，生产饲用酸性蛋白酶，至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种黑曲霉yy07菌株及其在固体发酵生产饲用酸性蛋白酶中的应用，可有效解决生产饲用酸性蛋白酶的问题。
本发明解决的技术方案是，一种固体发酵生产饲用蛋白酶的黑曲霉，经鉴定分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）yy07，2017年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14630，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株是由黑曲霉经紫外线和亚硝基胍联合诱变得到，该菌株有效用于固体发酵生产饲用酸性蛋白酶；黑曲霉（Aspergillus niger）yy07固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的应用方法包括以下步骤：
（1）、扩增培养：将黑曲霉（Aspergillus niger）yy07接种到斜面培养基中进行扩增培养，所述的斜面培养基为马铃薯培养基（PDA），其组分为去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000 mL，煮沸30分钟，过滤，取滤液，加水至1000mL，混匀，加葡萄糖20g、琼脂15g，溶解后，在1.1 kg/cm2压力下灭菌30分钟制成，接种量为每10mL培养基中接种一株黑曲霉（Aspergillus niger）yy07，在35-40℃下培养70-75h，置于斜面分离培养基中，所述的斜面分离培养基为察氏培养基，是由重量计的：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g，加蒸馏水1L，加热溶解，121℃灭菌20min制成，菌丝长满斜面分离培养基，作为斜面培养基种子；
（2）、配制固体发酵培养基：固体发酵培养基是由重量计的麦麸800-900g、豆粕80-100g、玉米粉18-22g和硫酸铵18-22g混合，搅拌均匀，加水至含水量为65-70%，调节pH为6.5，在蒸汽压力1.1kg/cm2压力下灭菌30分钟；
所述的麦麸为新鲜小麦麸皮，其中质量含量包括：粗蛋白＞13％，粗纤维＜10％，粗灰分＜6.0％，水分＜13％；
所述的玉米粉为新鲜玉米粉，其中质量含量包括：粗蛋白＞8％，粗纤维＜5.0％，粗灰分＜26％，水分＜14.0％；
所述的豆粕为新鲜豆饼，其中质量含量包括：粗蛋白＞40.0％，粗脂肪＜8.0％，粗纤维＜6.0％，粗灰分＜7.0％，水分＜13.0％；
（3）、接种：将斜面培养基种子接种于固体发酵培养基中，接种量为固体发酵培养基重量的0.3%；
（4）、发酵培养：将接种斜面培养基种子的固体发酵培养基在35-40℃，培养22-26小时，第一次摇动，继续培养22-26小时，第二次摇动，经过48-60小时待菌丝布满培养基表面，孢子全部变黑为止，低温保存备用；将孢子全部变黑的黑曲霉每1kg菌种接种到装有300kg固体发酵培养基中，在35-40℃下培养22-26小时，第一次翻曲，继续在35-40℃下培养22-26小时，第二次翻曲后，继续培养11-13小时，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，低于60℃进行干燥，当含水率10%以下，粉碎成过60目筛的粉状物，即为饲用酸性蛋白酶（制品）。
本发明菌株是采用黑曲霉菌株经紫外线和亚硝基胍联合诱变获得的具有独特性的黑曲霉（Aspergillus niger）yy07新菌株，有效用于生产饲用酸性蛋白酶，其制备方法科学、先进，原料丰富，成本低，节能、环保，易推广应用，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种黑曲霉菌株yy07，2017年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No14630，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，可有效用于固体发酵生产饲用酸性蛋白酶，其固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的方法由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，一种黑曲霉菌株yy07生产固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的方法，包括以下步骤：
（1）、扩增培养：将黑曲霉（Aspergillus niger）yy07接种到斜面培养基中进行扩增培养，所述的斜面培养基为马铃薯培养基（PDA），接种量为每10mL培养基中接种一株黑曲霉（Aspergillus niger）yy07，在35-40℃下培养70-75h，置于斜面分离培养基中，所述的斜面分离培养基为察氏培养基，是由重量计的：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g，加蒸馏水1L，加热溶解，121℃灭菌20min制成，菌丝长满斜面分离培养基，作为斜面培养基种子；
（2）、配制固体发酵培养基：固体发酵培养基是由重量计的麦麸870g、豆粕90g、玉米粉20g和硫酸铵20g混合，搅拌均匀，加水至体积含水量为68%，调节pH为6.5，在蒸汽压力1.1kg/cm2压力下灭菌30分钟制成；
（3）、接种：将斜面培养基种子100g接种于10个装有固体发酵培养基的三角玻璃器皿中，接种量为固体发酵培养基重量的0.3%，
（4）、发酵培养：将接种斜面培养基种子的固体发酵培养基在38℃，培养24小时，第一次摇瓶，继续培养24小时，第二次摇瓶，经过48-60小时待菌丝布满培养基表面，孢子全部变黑为止，低温保存备用；将孢子全部变黑的黑曲霉每1kg菌种接种到装有300kg固体发酵培养基中，在38℃下培养24小时，第一次翻曲，继续在38℃下培养24小时，第二次翻曲后，继续培养12小时，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，将其送入沸腾流化床干燥干燥箱中，低于60℃进行干燥，当含水率10%以下，粉碎成过60目筛的粉状物，即为饲用酸性蛋白酶（制品）。
实施例2
本发明在具体实施中，一种黑曲霉菌株yy07生产固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的方法，所述的发酵培养是，将接种斜面培养基种子的固体发酵培养基置于发酵室的竹帘子上，发酵室要求通风、透光、可恒温，每次使用前1天，用高锰酸钾、甲醛进行全室包括发酵室所有用品统一消毒处理；竹帘子长宽尺寸为90cm、200cm,每根竹片宽4mm,厚2mm,每片之间间隔2mm,用棉线串在一起；帘子放置在架子上，架子长宽高分别为250cm、70cm、200cm,共设5层，接种子的斜面培养基在竹帘子上的摊铺厚度为50cm,在35-40℃下培养55-65小时，期间不需要翻动培养基，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，然后将其送入沸腾流化床干燥干燥箱中，在低于60℃进行干燥，当含水率10%以下，输入粉碎机中粉碎成过60目筛粉状物，即为本发明饲用酸性蛋白酶（制品）。
本发明的黑曲霉（Aspergillus niger）yy07菌株是由紫外线和亚硝基胍联合诱变获得，应用于固体发酵生产饲用酸性蛋白酶，是申请人的首创，并经实地试验和养殖生产应用，取得了非常好的技术效果，有关资料如下：
1 试验材料
1.1 原始菌株
黑曲霉（Aspergillus niger）由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。
扩增菌株
黑曲霉（Aspergillus niger）yy07由河南省科学院生物研究所有限责任公司提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.14630。
斜面及分离培养基
斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基（硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1L、加热溶解，自然pH值，分装后121℃灭菌20 min）, 分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白。
固体发酵基础培养基
麸皮∶豆粕∶玉米粉＝87∶9∶2，硫酸铵2%, 含水量68%，pH6.5。
试验方法
2.1 菌种的分离和纯化
采用常规稀释分离法。
发酵培养方法
按要求配制发酵培养基，调节初始含水量和pH后，取150g分装于1L三角瓶中，在0.1Mpa压力条件下灭菌30 min后，冷却接种，接种量为0.3%，在特定条件下发酵60h，干燥后，进行酶活的测定。
紫外线诱变处理
取0.1ml稀释的孢子悬液涂布初筛平板,30℃培养4h,紫外灯预热30min后，将平皿置于距15W紫外灯30cm处距分别照射0（对照）、4 min、6 min、8min、10min、12min，每个处理各做2组。随后在暗光条件下，用5mL无菌生理盐水对平皿上的菌落进行洗脱，适当稀释后，涂布于分离培养基，以黑布包裹30℃下避光培养3-4天，根据长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种，编号并保存，同时根据平皿菌落数计算致死率,从而求得成活率。
致死率（%）=（A-B）/A×100%
式中：A为对照组平皿上的菌落数；B为诱变处理后平皿上的菌落数。
亚硝基胍诱变处理
取3ml稀释的孢子悬液, 加入等体积的亚硝基胍溶液, 充分混合,于30℃摇床处理1h,处理分别做2组。取出稀释涂分离培养基, 30℃培养5d,挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验，并编号保存。
挑取一接种环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50g培养基的500ml三角瓶中,培养温度为30℃,培养时间5d,测定酶活。
酶活测定
酶活定义：在40℃，pH值为3.0反应条件下，1分钟内水解酪蛋白产生相当于1μg酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位，以U表示。检测方法采用GB/T28715-2012。
结果与分析
3.1 菌株选育结果
3.1.1 紫外线诱变
本试验采用紫外线诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿。紫外线照射孢子成活率结果如表1所示。
表1 紫外线照射孢子成活率
照射时间（min） 0 4 6 8 10 12
活菌数（个∕ml） 5000 3250 2100 1350 500 100
成活率（%） 100 65 42 27 10 2
为了筛选在固体培养条件下产酶高产菌株, 经紫外线诱变处理后, 得到100株突变株。这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵培养，进行酶活测定,获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示。其中yz-10的酶活最高为984U/g（干基）。
表2 紫外线诱变后菌株的产酶活力
菌株编号 酶活力（u∕g）
yz-03 887.67±2.77b
yz-05 784.33±5.47f
yz-08 819.33±1.00d
yz-09 890.00±0.96b
yz-10 984.67±8.07a
yz-12 872.67±3.42c
yz-15 756.00±3.51g
yz-17 821.00±1.67d
yz-18 718.00±1.64h
yz-20 799.33±10.79e
注：表中同列数据肩标字母不同表示差异显著（P﹤0.05），字母相同表示差异不显著（P＞0.05），下同。
亚硝基胍诱变
选择经紫外线诱变产酶最高的yz-10菌株用亚硝基胍进行进一步诱变处理, 由酪蛋白平板初筛得到菌株36株, 经摇瓶复筛得到菌株10株，此10株再经三角瓶固体发酵复筛。酶活力超过1000U/g的菌株有4株, 基中yy07株产酶最高活为1646 U/g，结果如表3所示。选择酶活力最高的菌株yy07株进行固体发酵培养，对所产的酸性蛋白酶酶学性质及稳定性进行试验。菌株yy07经鉴定，分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger）yy07菌株，2017年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14630，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
表3 亚硝基胍诱变的菌株产酶情况
菌株编号 yy02 yy05 yy07 yy08
酶活力（u∕g） 1268.67±4.06c 1450.33±5.82b 1646.00±7.26a 1106.00±25.15d
3.2 影响黑曲霉（Aspergillus nigeryy07）菌株产酶因子的试验
(1) 温度对黑曲霉菌株产酶的影响
温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行。为寻求合适的发酵温度，本试验以黑曲霉yy07菌株发酵培养基含水量为68%、pH值为6.5的条件下培养60h，分别在27℃、30℃、33℃、37℃和40℃不同温度下进行发酵培养，分别测定酶活力，表明黑曲霉yy07菌株产酶最适发酵温度为33℃。
(2)培养基含水量对黑曲霉菌株产酶的影响试验
对于固态发酵来说，适宜的含水量，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖。过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，培养基膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长。含水量过高过低都对黑曲霉菌株生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活力。本试验将黑曲霉yy07菌株分别接种到初始pH值为6.5，含水量分别为60%、64%、68%、72%、76%和80%的固态发酵培养基上，在33℃的条件下进行发酵培养试验，表明含水量为68%时黑曲霉yy07菌株产酶活力达最高值。
培养基 pH值对黑曲霉菌株产酶的影响试验
为了研究发酵培养基pH值对黑曲霉yy07菌株产酶的影响，根据固体培养基难以调节pH值的特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整。本试验在培养基含水量为68%，温度为33℃，pH值分别为5、5.5、6、6.5、7、7.5的条件下发酵培养60h，观察发酵培养基pH值对黑曲霉yy07菌株产酶的影响，表明黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5。
玉米粉添加量对黑曲霉菌株产酶的影响试验
本试验将玉米粉按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的添加量分别添加到固体发酵基础培养基中，在30℃、pH值为6.5、培养基含水量为68%条件下分别发酵60h，观察玉米粉添加量对黑曲霉yy07菌株产酶的影响。结果当玉米粉添加量为2%时，黑曲霉yy07菌株产酶活力最大。随着玉米粉添加量的增加，可能会导致发酵培养基粘性加大，通透性差，造成黑曲霉yy07菌株产酶活力急剧下降。
(5) 豆粕添加量对黑曲霉菌株产酶的影响试验
在固体发酵培养基中分别添加0、3%、6%、9%、12%、15%的豆粕作为补充氮源，于33℃、pH为6.5、含水量为68%条件下分别发酵培养55-65h，考察其对黑曲霉yy07菌株产酶的影响，在培养基中添加不同比例的豆粕，对黑曲霉yy07菌株产酶都有促进作用，随着豆粕含量的增加，产酶有上升的趋势，在9％时达到最高。
（6）铵盐对黑曲霉菌株产酶的影响试验
在固体发酵培养基中分别加入0、2%、4%、6%、8%、10%的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵在相同的条件下进行发酵培养试验，少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势。氯化铵的添加对产酶基本没影响。碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用。
（7）磷酸盐对黑曲霉菌株产酶的影响试验
在固体发酵培养基中分别加入0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的磷酸氢二铵、磷酸氢二钾，于33℃、pH值为6.5、含水量为68%条件下进行发酵培养，研究不同浓度磷酸盐对黑曲霉yy07菌株产酶的影响。添加磷酸盐能促进黑曲霉菌株产酶，且添加0.2%的磷酸氢二钾对黑曲霉菌株的产酶促进作用最大。
黑曲霉菌株发酵进程曲线试验
本试验固体发酵采用基础培养基，其中含水量为68%、pH值为6.5、添加0.2%的磷酸氢二钾和2%硫酸铵在33℃条件下进行发酵培养96h，研究黑曲霉yy07菌株发酵进程曲线。0～12h发酵产酶速度较缓；12～60h产酶迅速增加，60h后,进程曲线趋于平缓，酶活力增加不明显，因此，在进行产品产业化生产时，考虑到发酵成本和酶活力增加的关系，最经济的发酵培养时间为60h。
本发明的饲用酸性蛋白酶适用于畜禽及所有人工饲养的动物。
本发明的饲用酸性蛋白酶的使用量为全价配合饲料的0.01-0.05％。
本发明的饲用酸性蛋白酶的使用方法为先与少量饲料预混合，再添加到大批饲料中拌匀，制粒或直接饲喂。
并经对畜禽饲喂，取得了非常好的效果，有关试验资料如下：
本发明的饲用酸性蛋白酶对畜禽饲喂效果试验。
试验一 酸性蛋白酶对生长肥育猪生长性能的影响试验
1．材料和方法
1.1 酸性蛋白酶：河南省瑞特利生物技术有限公司提供，酶活力8000u∕g。
1.2 微生态制剂：河南省瑞特利生物技术有限公司提供，主要成分是枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母菌。
1.3 试验动物及试验设计：选体重、生长日龄相近的长大杜生长猪72头，随机分为4个处理组，每组18头。1组为对照组，饲喂日粮为基础日粮；2组为基础日粮中添加0.15％的微生态制剂；3组为基础日粮中添加0.02％酸性蛋白酶；4组为基础日粮中添加0.02％酸性蛋白酶和0.15％的微生态制剂。
1.4 试验日粮及饲养管理试验：日粮配方见表1。预试期5天。预试期内分别饲喂含4种不同的日粮。自由采食，自由饮水，常规免疫，在试验中观察猪的采食及健康情况，每天以组为单位记录采食量、健康情况；正试期期初、期末分别对猪只称重，每次称重均在早晨饲喂前空腹进行。计算平均日增重、饲料转化率、饲料成本，并对计算结果进行统计分析。
1.5 试验地点：武陟县城关镇尚武养殖场。
1.6 试验时间：试验期从2016年9月16日开始，共45天，其中预试期5天，正试期40天。
表1 试验猪日粮配方及营养水平（％）
日粮组成 1组 2组 3组 4组
玉 米 50.0 50.0 50.0 50.0
浓缩饲料 20.0 20.0 20.0 20.0
米 糠 18.0 18.0 18.0 18.0
麸 皮 12.0 11.85 11.98 11.83
微生态制剂 0.0 0.15 0.0 0.15
酸性蛋白酶 0.0 0.0 0.02 0.02
合 计 100.0 100.0 100.0 100.0
粗蛋白质（%） 15.5 15.5 15.5 15.5
钙（%） 0.60 0.60 0.60 0.60
有效磷（%） 0.30 0.30 0.30 0.30
赖氨酸（%） 0.80 0.80 0.80 0.80
饲料成本（元/吨） 1768.8 1780.8 1769.8 1808.8
2. 试验结果分析
2.1饲养试验结果
2.1.1 经过40天的饲养试验，各组平均日增重见表2
表2 试验各组平均日增重（单位：千克/头、克/头.日、％）
组别 头数 天数 平均始重 平均末重 平均日增重 相对比较
1组 18 40 76.6±0.54 105.5±1.59 750.7±27.1 100.0
2组 18 40 75.5±0.68 105.8±1.82 799.3±22.2 106.5
3组 18 40 76.2±0.62 106.8±1.43 802.3±29.3 107.5
4组 18 40 76.0±0.51 108.45±1.39 855.9±28.7 114.0
试验结果表明：在生长猪的日粮中添加微生态制剂、酸性蛋白酶能有效地提高生长猪的平均日增重，较对照组分别提高6.5％，7.5％。酸性蛋白酶与微生态制剂合用的4组极显著提高了生长猪的平均日增重，较对照组平均日增重提高14％。
2.1.2 对采食量及饲料转化率的影响
经过40天的饲养试验，试验各组采食量及饲料转化率如表3
表3 试验全期采食量及饲料转化率（单位：千克/头、克/头.日、％）
组别 头数 天数 总耗料量 日采食重 料肉比 料肉比比较
1组 18 40 1660 2565 3.41 100.0
2组 18 40 1740 2688 3.35 98.4
3组 18 40 1748 2700 3.33 97.8
4组 18 40 1826 2821 3.28 96.4
试验结果表明，三个试验组都显著提高了生长肥育猪的平均采食量，微生态制剂组、酸性蛋白酶组、微生态制剂与酸性蛋白酶合用组较对照组分别提高采食量4.82%，5.3%,10%.分别降低料肉比1.6%,2.2%,3.6%.
2.1.3 猪的发病率及健康状况
试验过程中，无死亡，无腹泻，猪仔有发热现象，各组的发病率情况见表4。
表4 试验各组的发病率（单位：％）
组别 头数 天数 饲养头数 发病头次数 发病率 发病率比较
1组 18 40 720 16 2.22 100.0
2组 18 40 720 8 1.11 50.0
3组 18 40 720 6 0.83 37.4
4组 18 40 720 0 0 0
发病率（％）＝累计发病头日数/累计饲养头日数×100
试验结果表明，微生态制剂组、酸性蛋白酶组均能有效降低猪的发病率，酸性蛋白酶与微生态制剂合用组能明显提高猪仔的抗病力。
2.2 经济分析
表5 试验各组猪的经济效益分析（单位：元/千克、％）
组别 头数 天数 饲料成本 增值成本 增重成本比较
1组 18 40 1.7688 6.032 100.00
2组 18 40 1.7808 5.983 99.18
3组 18 40 1.7968 6.000 99.40
4组 18 40 1.8088 5.951 98.65
试验结果表明，在生长肥育猪的日粮中添加微生态制剂组、酸性蛋白酶组、微生态制剂与酸性蛋白酶合用组较对照组均降低了猪的增重成本，分别提高经济效益0.82％、0.6％、1.35%。
．讨论与分析
本次试验结果表明，在生长猪日粮中添加微生态制剂、酸性蛋白酶、微生态制剂与酸性蛋白酶合用分别提高了生长肥育猪日增重6.5％、7.5％、14.0％，日采食量提高4.8％、5.3％、10％，料肉比分别下降1.6％、2.2％、3.68%，提高经济效益0.82％、0.6％、1.35％（本次试验只计算了饲料成本与增重的关系）。
．结论
酸性蛋白酶和微生态制剂合用，具有无污染、无毒副作用等特点，能显著提高猪的日采食量、日增重，提高抗病能力，增加经济效益。其组分来源于天然，应用效果显著，具有抗生素所不具有的特点，符合绿色环保饲料的要求。随着人们对绿色、安全和环保意识的增强，它产生的社会效益将得到更多有识之士的认可，应用前景更加广阔。
试验二 酸性蛋白酶对仔猪的影响试验
本试验旨在确定添加酸性蛋白酶对仔猪的增重、料肉比和腹泻率的影响。
材料和方法
1.1 试验动物
本试验于2017年4月9日在河南省正阳种猪场进行，试验期为35天。试验仔猪由正阳种猪场提供的杜长大仔猪，选取20窝杜长大仔猪，随机分为2组，每组10窝，7日龄饲喂开食料，21日龄断奶，仔猪料为常规饲料（含抗生素），由本场自配。试验组添加0.02%的酸性蛋白酶。试验猪采取高床饲养，进行有关资料的记录与收集，包括：初生重，7日龄、21日龄、35日龄窝重，仔猪腹泻头数，饲料量等。
1.2 样品来源
试验酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供，酶活力8000u∕g。
1.3 数据处理与统计分析
应用Excel对实验数据进行预处理，再用SPSS进行单因素方差分析，并用LSD进行多重比较。
结果与分析
2.1酸性蛋白酶对仔猪增重的影响
从试验开始到试验结束，试验组仔猪的初生重、7日龄、21日龄、35日龄平均体重与对照组比较，均无显著性差异（P＞0.05），就其各试验时间段平均日增重比较，添加酸性蛋白酶组仔猪在断奶前采食量少而导致日增重有低于对照组的趋势（243.60±21.83对248.00±42.46，P＞0.05）。断奶后经过断奶、免疫、去势的应激，添加酸性蛋白酶组的试验猪表现出高于对照组的趋势（试验组146.85±35.07，对照组142.17±46.80，P＞0.05）。
表1 酸性蛋白酶对仔猪生长性能的影响研究
项 目 对照组 试验组
带仔头数 11.65±1.03 10.78±1.63
初生重（㎏） 1.26±0.17 1.40±0.61
7日龄重（㎏） 2.35±0.31 2.41±0.31
21日龄重（㎏） 5.90±0.71 5.97±0.54
35日龄重（㎏） 7.82±0.61 7.96±0.77
0-7日增重（g） 139.83±42.46 140.49±27.36
8-21日增重（g） 248.00±45.25 243.60±21.83
8-35日增重（g） 142.17±46.80 146.85±35.07
8-35日增重（g） 196.08±22.35 196.27±21.89
0-35日增重（g） 185.85±21.30 186.14±20.21
2.2 酸性蛋白酶对仔猪料重比的影响
由表2所示：添加酸性蛋白酶组与对照组增重差异不明显，但添加酸性蛋白酶处理组8-21日龄采食量比对照组减少了35.29%（P＜0.05），8-35日龄饲料采食量比对照组减少了20.53%（P＜0.05）。饲喂酸性蛋白酶处理组8-21日龄饲料效率比对照组减少了34.62%（P＜0.05），8-35日龄饲料采食量比对照组减少了20.32%（P＜0.05）可见酸性蛋白酶具有明显的提高仔猪饲料利用率的优势，这对于养猪行业具有直接的经济效益。
表2 酸性蛋白酶对仔猪饲料利用率的影响
组别 Wg8-21 wg22-35 Wg8-35 Fi8-21 fi22-35 Fi8-35 Fcr8-21 fcr22-35 Fcr8-35
对照组 246.00 144.18 195.09 255a 205.77 455.67a 1.04a 1.38 1.23a
酸性蛋白酶组 241.61 148.96 195.28 165b 202.09 362.09b 0.68b 1.31 0.98b
差异％ -1.78 3.32 0.10 -35.29 -1.78 -20.53 -34.62 -5.07 -20.32
注：a,b同列比较，上标无字母相同者示差异显著（P＜0.05）
2.3 酸性蛋白酶对仔猪腹泻的影响
试验猪腹泻发生情况见表3。0天到7天，试验组仔猪的总腹泻率比对照组高1.43个百分点（高22.88％，P＞0.05）；7日龄至21日龄断奶期间，酸性蛋白酶组腹泻比对照组低0.45个百分点（低26.66%, P＞0.05）；断奶以后2周内，试验组仔猪的腹泻率更是比对照组低了0.82个百分点（低57.75%,P＜0.01）。可见，酸性蛋白酶具有明显的提高仔猪的抗病性能的作用。
表3 酸性蛋白酶对仔猪腹泻的影响
组别 0-7天 8-21天 22-35天 0-21天 0-35天
对照组 6.25 1.69 1.42A 4.25 3.18
酸性蛋白酶组 7.68 1.24 0.60B 4.44 2.95
差异 1.43 -0.45 -0.82 0.19 -0.23
％ 22.88 -26.66 -57.74 4.48 -7.23
注：A,B同列比较，上标无字母相同者示差异显著（P＜0.01）。
结论
本试验中，开始诱食前，试验组仔猪腹泻率比对照组有高出的趋势，但自7日龄开始，含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的腹泻率有低于对照组的趋势。断奶后，酸性蛋白酶增强仔猪抗应激能力的优势更加明显，添加含有酸性蛋白酶的试验组仔猪的抗病能力明显增强，腹泻发生率极显著地低于对照组（P＜0.01）。研究表明饲料中添加酸性蛋白酶能促进仔猪的生长，作用非常明显。同时可减少断奶后饲料对仔猪的应激，促进仔猪的健康，提高其抗病性能，降低仔猪腹泻率。
试验三 酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响试验
1 材料与方法
1.1 试验材料
本次试验的酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供, 酶活8000U/g。试验鸡品种为新罗曼鸡。
1.2 试验时间和地点
试验在河南省武陟县蛋鸡场进行，预试开始时鸡龄在11个月；试验时间为2016年9月19日，其中头11天为预试期，后60天为正试期。
1.3 试验设计
将1200只商品蛋鸡，随机分为6组，每组设4个重复，每个重复50羽；其中第一组为空白对照组、第二组为添加0.01%酸性蛋白酶组、第三组为添加0.015%酸性蛋白酶组、第四组为添加0.02%酸性蛋白酶组、第五组为添加0.025%酸性蛋白酶组、第六组为添加0.03%酸性蛋白酶组。
1.4 试验基础日粮配方
蛋鸡常规饲料配方为：玉米（62%）、豆粕（25%）、贝壳（8%）、预混料（5%）。预混料中除微量元素、维生素外，还添加了占大料中1%的鱼粉，并添加了蛋氨酸。
1.5 试验蛋鸡的饲养管理
本次试验中鸡只自由采食、饮水，光照时间为16小时。每只蛋鸡日平均饲喂料两次，第一次在上午8点，饲喂量为全天所需饲喂量的60%，第二次在下午4点，饲喂量为全天所需饲喂量的40%。饲养方式为三层阶梯式笼养，每笼3只鸡。
1.6 预试期鸡群调整方法
在预试期开始时，将鸡舍内各笼内的蛋鸡数均调整为每笼3只，然后按笼为单位每天记录各笼的产蛋数。记录11天后按各重复小组统计产蛋数，并根据统计结果进行适当调整，即将产蛋数高的小组内的鸡，按笼为单位调整到产蛋数较低的组内，以使各小组在正式试验开始时的产蛋数基本相等。
1.7 测定指标
试验期间每天下午3点分笼记录产蛋数、分重复组称测产蛋重，并记录每天的耗料量；并在试验结束时，选取试验效果明显的组及对照组作为蛋品质量测定组，每个重复组选取10枚蛋，进行常规蛋品指标测定。
1.8 统计分析方法
将试验原始记录资料输入到SPSS统计软件中，通过统计软件进行数据处理，多重比较采用LSD。
表1 酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响
项目 产蛋率（%） 产蛋总重/日 蛋重/枚（g） 料蛋比
空白对照 84.00eCD±5.86 2.50dD±0.17 66.15bB±1.56 2.17dD±0.16
0.01%酸性蛋白酶 86.59eB±5.19 2.61bB±0.20 66.90aA±3.96 2.08bB±0.14
0.015%酸性蛋白酶 89.74aA±4.83 2.67aA±0.15 66.19bB±1.48 2.03aA±0.12
0.02%酸性蛋白酶 88.60bA±5.21 2.64aAB±0.16 66.40bB±1.46 2.05AB±0.12
0.025%酸性蛋白酶 85.23dC±5.52 2.54cC±0.16 66.27bB±1.71 2.13cC±0.14
0.03%酸性蛋白酶 83.90eD±5.94 2.46eD±0.17 65.35eC±1.51 2.21eE±0.16
注：以上同列不同字母表示差异，其中小写字母表示差异显著（P<0.05），大写字母表示差异极显著（P<0.01），下同。
结果与分析
2.1酸性蛋白酶对蛋鸡产蛋率的影响
经对各试验组间进行统计分析，试验各组在整个试验期的产蛋率分别为：84.00%、86.59%、89.74%、88.60%、85.23%、和83.90%。显著性分析检验表明，0.015%酸性蛋白酶组和0.02%酸性蛋白酶组的产蛋率均极显著高于其它各组（P<0.01）；0.01%酸性蛋白酶组的产蛋率极显著高于空白对照组（P<0.01）；0.025%酸性蛋白酶组的产蛋率显著高于空白对照组（P<0.05）。其中以0.015%酸性蛋白酶组的产蛋率为最高（表1）。
2.2 酸性蛋白酶对蛋鸡产蛋重的影响
由表1可见，0.015%酸性蛋白酶组和0.02%酸性蛋白酶组的每日平均产蛋总重均极显著高于其它各组的产蛋总重（P<0.01）；0.01%酸性蛋白酶组和0.025%酸性蛋白酶组的每日平均产蛋总重均显著高于对照组和0.03%酸性蛋白酶组（P<0.01）；对照组产蛋总重显著高于0.03%酸性蛋白酶组（P<0.05）。其中以0.015%酸性蛋白酶组每天平均产蛋重为最高。
2.3 酸性蛋白酶对蛋鸡平均蛋重的影响
由表1可见，0.01%酸性蛋白酶组的平均蛋重极显著高于其它各组的平均蛋重（P<0.01）；0.03%酸性蛋白酶组的平均蛋重极显著低于其它各组的平均蛋重（P<0.01）。
2.4 酸性蛋白酶对蛋鸡料蛋比的影响
由表1可见，0.01%酸性蛋白酶组、0.015%酸性蛋白酶组和0.02%酸性蛋白酶组的料蛋比极显著低于空白对照组、0.025%酸性蛋白酶组和0.03%酸性蛋白酶的料蛋比（P<0.01）；0.015%酸性蛋白酶组的料蛋比极显著低于0.01%酸性蛋白酶组的料蛋比；各组间以0.015%酸性蛋白酶的料蛋比为最低。
2.5 各组蛋品质分析结果
在试验结束前，选取试验效果比较显著的0.015%酸性蛋白酶和0.02%酸性蛋白酶组的蛋与对照组的蛋进行蛋品质量比较分析，结果表明：在蛋壳强度、蛋黄比色、蛋壳百分率、哈氏单位等指标上，0.015%和0.02%酸性蛋白酶组和空白对照组之间没有显著差异（P>0.05）；在蛋形指数（长径比横径）上，0.015%酸性蛋白酶组显著高于0.02%酸性蛋白酶组（P<0.05），但二组与空白对照组间没有显著差异（P>0.05）；在蛋壳厚度上，空白对照组极显著高于两个试验组的蛋壳厚度（P<0.01）；在蛋黄百分率上，0.015%酸性蛋白酶组显著高于对照组（P<0.05）（见表2）。
表2 酸性蛋白酶对鸡蛋常规品质的影响
2.6 酸性蛋白酶对蛋鸡饲养效益的影响
2.6.1 计算依据：
各试验组鸡数200只，平均日投放饲料0.120kg/只，本次试验期共进行了60天。以本次试验期60天计算毛利。鸡蛋8.00元/kg，饲料2.40元/kg，酸性蛋白酶按12元/kg计。
2.6.2 计算公式
计算时按试验期内各组实际产蛋重、饲料消耗量和酸性蛋白酶添加量，按下列公式计算毛利润（即包括劳动力工资在内的纯收入）：
毛利润（元）蛋重×8.00－饲料×2.40－酸性蛋白酶费用
2.6.3 试验期各组鸡的毛利润分析
现以在日粮中添加0.015%和0.02%酸性蛋白酶的结果进行各组鸡的毛利润分析，根据试验数据对三组的毛利润进行了分析。结果表明：在饲料中添加0.015%和0.02%的酸性蛋白酶可分别比对照组提高10.98%和8.92%饲养毛利。如采用在饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶，则每只蛋鸡每月可多获毛利0.17元，一个年养1000只蛋鸡的农户，如果将蛋鸡饲养10个月淘汰，则每年仅此一项就可多获毛利1770元，经济和社会效益十分可观（见表3）。
表3 试验期各组获毛利分析
项目 空白对照组 0.015%酸性蛋白酶组 0.02%酸性蛋白酶组
总蛋重（㎏） 157.39 168.08 166.53
蛋收入（元） 1101.73 1176.56 1165.71
饲料重（㎏） 340.2 340.2 340.2
饲料费（元） 476.28 476.28 476.28
酸性蛋白酶用量（克） 0 51 68
酸性蛋白酶费用（元） 0 0.61 0.82
毛利（元） 625.45 694.16 681.27
比对照组增毛利（元） - +68.71 +55.82
3 结论
3.1 添加0.015%的酸性蛋白酶能促进蛋鸡生产性能的提高
试验结果表明在蛋鸡饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶可极显著提高蛋鸡的日产蛋率和日产蛋总量和料蛋比，该组日产蛋率比对照组高6.83%，组日产蛋重比对照组高6.8%，组日均料蛋比比对照组下降6.45%。结果表明：在日粮中添加0.015%酸性蛋白酶不能使每枚鸡蛋的平均蛋重提高，但可以使组日产蛋量的提高和组日均料蛋比的下降。
3.2 添加酸性蛋白酶不会降低蛋的品质
试验结果表明，在日粮中添加0.015%的酸性蛋白酶，该组的蛋黄占整个蛋的百分比，比对照组提高了3.27%，提高幅度显著；该组的蛋壳厚度比对照组下降4.65%，且下降幅度显著；该组蛋的哈氏单位比对照组提高了2.24%，但差异不显著，其他常规指标间没有显著差异。
3.3 在饲料中添加酸性蛋白酶能提高蛋鸡的饲养效益
本试验结果表明，在饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶，比对照的饲养毛利提高10.98%，显著地提高了商品蛋鸡的饲养效益，增加了养殖户的收入。在饲料中添加0.015%的酸性蛋白酶后，虽然该组蛋鸡的产蛋率显著提高，但每日的采食量并未增加，酸性蛋白酶能提高蛋鸡对饲料的吸收率。
试验四 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡生长性能的影响研究
肠道微生物对肠组织的形态、代谢和功能有极大影响。建立良好的肠道微生物区系，充分发挥消化机能，有助于提高动物生产性能及饲料料转化率。饲料中添加抗生素、微生态制剂、酸性蛋白酶均能影响动物肠道微生物群落的组成。抗生素通过非选择性抑菌或杀菌，消除肠道有害微生物对动物生长的抑制作用。微生态制剂通过补充有益微生物，利用有益菌菌群优势竞争性抑制有害菌的增殖。酸性蛋白酶有助于提高动物生产性能及饲料料转化率。近年来，鉴于抗生素大量使用导致肠道菌群失衡、药物残留、耐药性及其传递和转移等负效应，微生态制剂、酸性蛋白酶或者两者配伍使用替代抗生素的研究和应用成为饲料添加剂热点之一。
材料与方法
1.1 试验材料
酸性蛋白酶由河南省瑞特利生物技术有限公司提供，酶活8000U/g。微生态制剂由河南省瑞特利生物技术有限公司提供，主要含嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。
1.2 试验动物及试验设计
选取1日龄健康AA肉鸡1200只，随机分成6组，每组8个重复，每个重复25只，6组肉鸡分别饲喂在基础日粮中添加抗生素（第1组，对照组）、0.02%酸性蛋白酶、0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂、0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂、0.005%酸性蛋白酶＋抗生素（同对照组）和0.01%酸性蛋白酶＋抗生素（同对照组）。
1.3 试验管理及试验日粮
试验在河南武陟县肉鸡场进行，预试期3天，正试期42天。试验鸡采用层叠笼饲养，自由饮水，自由采食，24小时连续光照，并按常规程序进行严格免疫。基础日粮配方及养分含量如表1。
表1 试验基础日粮配方及养分含量
原料（%） 0—21d 22—42d
玉米 62 68
豆粕 33 27
5%预混料 5 5
营养水平（%） / /
ME（Mcal/kg） 12.12 12.54
Cp 21 19
Ca 0.9 0.85
Ap 0.48 0.43
Lys 0.98 0.88
Met＋Cys 0.77 0.67
注：5%预混料含氨基酸、微量元素和维生素等。
1.4 测定指标与方法
1.4.1 生产性能测定
试验鸡于21龄和42龄晨分别进行空腹称重；记录每天耗料量、鸡只死亡数；计算体增重、饲料转化率和死亡率。
1.4.2 空肠微生物菌群测定
42日龄上午9：00从各处理中随机选取6只试验鸡屠宰后立即解剖，取出并结扎空肠，用酒精棉球消毒各结扎口，然后放入消毒容器内。空肠内容物运回试验室，称取0.5g内容物于10ml灭菌的离心管中，用0.9%的生理盐水4.5ml稀释，摇匀即为10-1稀释，依次进行梯度稀释到10-5-10-9，分别取0.1mL 内容物稀释液接种于MRS 琼脂培养基的厌氧管中（测定乳酸杆菌数量）和伊红美蓝培养基的平皿上（测定大肠杆菌的数量），各稀释度设3个重复，在37℃生化培养箱中培养48h 后进行菌落计数，求取平均值。菌群数量以每克内容物样中所含细菌的对数值(lg)表示（CFU/g)。
1.5 统计分析
试验数据采用SPSS11.0统计软件中One-Way ANOVA分析，并进行Duncan法进行多重比较，数据以平均数±标准误差表示。
结果与分析
2.1 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡生长性能的影响
酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡生长性能影响见表2。从前期来看，第4组、第5组和第6组的体增重显著高于第1组（对照组）（P<0.05），分别提高了10.4%、13.9%和15.1%，第2组、第3组的体增重与第1组差异不显著（P>0.05）。从后期来看，第3组、第4组、第5组、第6组体增重显著高于第1组（P<0.05），第2组体增重与第1组差异不显著（P>0.05）。从全期来看，各处理组的体增重均显著高于第1组（P<0.05），第4组、第5组、第6组体增重分别提高了15.6%、24%、16.3%。这说明酸性蛋白酶与微生态制剂或酸性蛋白酶与抗生素联用能提高肉鸡的体增重。
表2 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡体增重的影响
注：同一列大写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，大写字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同。
酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡转化率的影响见表3。
表3 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡饲料转化率、死亡率的影响
从前期来看，第4组、第6组料重比显著低于第1组（P<0.05），其它处理组与第1组相比差异不显著（P>0.05）。从后期来看，第4组、第5组、第6组料重比显著低于第1组（P<0.05），第5组料重比最低，饲料转化率最好。从全期来看，第5组料重显著低于其它各组（P<0.05），第2组、第3组、第4组、第6组与第1组差异不显著（P>0.05），数值上略低于第1组，其中第4组、第5组、第6组料重比分别降低了6.60%（P>0.05）、7.61%（P<0.05）、6.60%（P>0.05）。这说明酸性蛋白酶或酸性蛋白酶与微生态制剂和抗生素联用能完全或部分替代抗生素，用来提高肉鸡的生长性能和饲料转化率。综合各指标以添加0.005%酸性蛋白酶＋抗生素的效果为最佳。
2.2 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡空肠菌群的影响
由表4可见，第2组、第3组、第4组空肠大肠杆菌数量显著高于第1组（P<0.05），这说明抗生素的添加能更有效地抑制了空肠大肠杆菌的增殖；第5组空肠大肠杆菌数量显著低于第2组、第3组、第4组P<0.05），也低于第1组、第6组 (P>0.05)。这说明酸性蛋白酶与抗生素联用有协同抑菌作用。与对照组比，各试验组都显著提高了肉鸡空肠乳酸菌数量（P<0.05），分别增加了19.89%、9.17%、20.21%、13.98%和16.75%，各试验组之间乳酸菌数量差异不显著（P<0.05）。
表4 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡空肠菌群的影响
组别 大肠杆菌(CFU/g) 乳酸菌(CFU/g)
1.抗生素（对照组） 3.366±0.403B 5.671±0.226B
2.0.02%酸性蛋白酶 4.98±0.365A 6.799±0.421bA
3.0.005%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂 4.696±0.292A 6.191±0.115A
4.0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂 4.588±0.562A 6.817±0.231bA
5.0.005%酸性蛋白酶＋抗生素 3.251±0.234B 6.464±0.310A
6.0.01%酸性蛋白酶＋抗生素 4.024±0.377AB 6.621±0.219A
3 结论
3.1 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡生长性能的影响
外源蛋白酶的主要作用是补充幼畜、幼禽内源酶的不足，同时还能激活内源酶的分泌，从而提高蛋白质和氨基酸的吸收和利用。此外还可降解饲料中的抗营养因子，减少动物粪尿中氮、磷的排放，从源头上减少对环境的污染。郭建来等研究表明在日粮中添加酸性蛋白酶,仔猪日增重提高11.98%、采食量提高5.49%、料重比降低5.49%。王敬勉等用酸性蛋白酶产生菌种发酵酒糟蛋白饲料，以5%～8%加入到日粮中饲喂蛋鸡，结果试验组比对照组产蛋率提高1%～2%，饲料成本降低8%～9%。本试验研究表明，日粮中添加酸性蛋白酶或酸性蛋白酶与微生态制剂及抗生素的复合物，能提高肉鸡体增重，提高饲料转化率。这是由于酸性蛋白酶和微生态制剂都具有调整动物肠道微生态平衡的作用，有益微生物代谢产生大量的营养物质，参与动物机体的物质代谢，从而提高了动物的生产性能。
3.2 酸性蛋白酶、微生态制剂和抗生素对肉鸡空肠菌群的影响
酸性蛋白酶作用的最适pH 值一般在2～4，与动物胃肠道的酸性环境相接近，有利于胃肠道内乳酸菌的生长，抑制大肠杆菌等病原菌和腐败菌的繁殖，保持胃肠道微生物平衡，提高机体免疫力，减少动物腹泻。Stricking 等报道，芽孢杆菌可使胃肠道内有益菌如乳酸杆菌和链球菌的数量增多，这些细菌会产生大量的有机酸使肠道内pH下降，从而抑制胃肠道内病原菌的繁殖。本试验研究表明，在肉鸡日粮中添加酸性蛋白酶显著提高了肉鸡空肠乳酸菌数量，而且酸性蛋白酶与抗生素及微生态制剂联用均有效的促进了空肠乳酸菌的增殖，以添加0.01%酸性蛋白酶＋0.005%微生态制剂效果最佳。
本试验在抑制空肠大肠杆菌增殖上，微生态制剂和酸性蛋白酶的抑菌效果优于酸性蛋白酶，但酸性蛋白酶及微生态制剂和酸性蛋白酶略差于抗生素，0.005%酸性蛋白酶与抗生素联用具有更强抑制大肠杆菌增殖的趋势。本研究进一步表明，饲粮中添加酸性蛋白酶、微生态制剂，能有效地促进了肠道内乳酸菌在肠道内的生长，减少了有害菌大肠杆菌的生长，从而改善动物胃肠道微生物平衡。
酸性蛋白酶、酸性蛋白酶与微生态制剂及酸性蛋白酶与抗生素联合使用，改善了肉鸡的体增重，提高饲料转化率，调节肠道微生物平衡，是比较理想的抗生素替代品。关于酸性蛋白酶与抗生素及微生态制剂联用，以最大限度的替代抗生素或降低抗生素用量的最佳添加量组合的研究尚待进一步试验。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下突出的优点：
1.本发明固体发酵设备投资只是液体深层发酵工艺的20-30％；且固体发酵单位体积的酶产量比液体发酵高。
2.本发明产品生产培养基为麸皮、豆粕、玉米粉等，较液体发酵培养基具有原料来源广泛、价格便宜、生产成本低。
3. 本发明产品生产发酵培养周期短，省工、节能。
4. 本发明产品生产工艺操作简便，容易推广。
5. 本发明产品除富含酸性蛋白酶外，还含多种维生素、氨基酸和促生长的活性物质，有利于畜禽的健康和养殖效益提高。
6.本发明黑曲霉固体发酵生产酸性蛋白酶，发酵培养基含水量低，不需要进行废水处理，环境污染少。
7. 本发明产品推广应用，无污染物残留，符合绿色饲料添加剂的要求和国家大力发展生态农业和绿色食品的产业化政策，市场前景广阔。

Claims (5)

1.一种固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的菌株yy07，分类命名为黑曲霉（Aspergillus niger），2017年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14630，该菌株是由黑曲霉原始菌株经紫外线和亚硝基胍联合诱变获得。
2.权利要求1所述的固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的菌株yy07在生产饲用酸性蛋白酶中的应用。
3.权利要求2所述的固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的菌株yy07在生产饲用酸性蛋白酶中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、扩增培养：将黑曲霉（Aspergillus niger）yy07接种到斜面培养基中进行扩增培养，所述的斜面培养基为马铃薯培养基（PDA），其组分为去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000 mL，煮沸30分钟，过滤，取滤液，加水至1000mL，混匀，加葡萄糖20g、琼脂15g，溶解后，在1.1 kg/cm2压力下灭菌30分钟制成，接种量为每10mL培养基中接种一株黑曲霉（Aspergillus niger）yy07，在35-40℃下培养70-75h，置于斜面分离培养基中，所述的斜面分离培养基为察氏培养基，是由重量计的：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g，加蒸馏水1L，加热溶解，121℃灭菌20min制成，菌丝长满斜面分离培养基，作为斜面培养基种子；
（2）、配制固体发酵培养基：固体发酵培养基是由重量计的麦麸800-900g、豆粕80-100g、玉米粉18-22g和硫酸铵18-22g混合，搅拌均匀，加水至含水量为65-70%，调节pH为6.5，在蒸汽压力1.1kg/cm2压力下灭菌30分钟；
所述的麦麸为新鲜小麦麸皮，其中质量含量包括：粗蛋白＞13％，粗纤维＜10％，粗灰分＜6.0％，水分＜13％；
所述的玉米粉为新鲜玉米粉，其中质量含量包括：粗蛋白＞8％，粗纤维＜5.0％，粗灰分＜26％，水分＜14.0％；
所述的豆粕为新鲜豆饼，其中质量含量包括：粗蛋白＞40.0％，粗脂肪＜8.0％，粗纤维＜6.0％，粗灰分＜7.0％，水分＜13.0％；
（3）、接种：将斜面培养基种子接种于固体发酵培养基中，接种量为固体发酵培养基重量的0.3%；
（4）、发酵培养：将接种斜面培养基种子的固体发酵培养基在35-40℃，培养22-26小时，第一次摇动，继续培养22-26小时，第二次摇动，经过48-60小时待菌丝布满培养基表面，孢子全部变黑为止，低温保存备用；将孢子全部变黑的黑曲霉每1kg菌种接种到装有300kg固体发酵培养基中，在35-40℃下培养22-26小时，第一次翻曲，继续在35-40℃下培养22-26小时，第二次翻曲后，继续培养11-13小时，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，低于60℃进行干燥，当含水率10%以下，粉碎成过60目筛的粉状物，即为饲用酸性蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的菌株yy07在生产饲用酸性蛋白酶中的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、扩增培养：将黑曲霉（Aspergillus niger）yy07接种到斜面培养基中进行扩增培养，所述的斜面培养基为马铃薯培养基（PDA），接种量为每10mL培养基中接种一株黑曲霉（Aspergillus niger）yy07，在35-40℃下培养70-75h，置于斜面分离培养基中，所述的斜面分离培养基为察氏培养基，是由重量计的：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g，加蒸馏水1L，加热溶解，121℃灭菌20min制成，菌丝长满斜面分离培养基，作为斜面培养基种子；
（2）、配制固体发酵培养基：固体发酵培养基是由重量计的麦麸870g、豆粕90g、玉米粉20g和硫酸铵20g混合，搅拌均匀，加水至体积含水量为68%，调节pH为6.5，在蒸汽压力1.1kg/cm2压力下灭菌30分钟制成；
（3）、接种：将斜面培养基种子100g接种于10个装有固体发酵培养基的三角玻璃器皿中，接种量为固体发酵培养基重量的0.3%，
（4）、发酵培养：将接种斜面培养基种子的固体发酵培养基在38℃，培养24小时，第一次摇瓶，继续培养24小时，第二次摇瓶，经过48-60小时待菌丝布满培养基表面，孢子全部变黑为止，低温保存备用；将孢子全部变黑的黑曲霉每1kg菌种接种到装有300kg固体发酵培养基中，在38℃下培养24小时，第一次翻曲，继续在38℃下培养24小时，第二次翻曲后，继续培养12小时，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，将其送入沸腾流化床干燥干燥箱中，低于60℃进行干燥，当含水率10%以下，粉碎成过60目筛的粉状物，即为饲用酸性蛋白酶。
5.根据权利要求3所述的固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的菌株yy07在生产饲用酸性蛋白酶中的应用方法，其特征在于，所述的发酵培养是，将接种斜面培养基种子的固体发酵培养基置于发酵室的竹帘子上，发酵室要求通风、透光、可恒温，每次使用前1天，用高锰酸钾、甲醛进行全室包括发酵室所有用品统一消毒处理；竹帘子长宽尺寸为90cm、200cm,每根竹片宽4mm,厚2mm,每片之间间隔2mm,用棉线串在一起；帘子放置在架子上，架子长宽高分别为250cm、70cm、200cm,共设5层，接种子的斜面培养基在竹帘子上的摊铺厚度为50cm,在35-40℃下培养55-65小时，期间不需要翻动培养基，待在培养基上长出的白色菌丝将要变化成黑色孢子时，然后将其送入沸腾流化床干燥干燥箱中，在低于60℃进行干燥，当含水率10%以下，输入粉碎机中粉碎成过60目筛粉状物。
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