CN111593036A - 以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用，培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶制剂。黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉BAK200389，其保藏号为CGMCC No.19613。本发明所用菌株，可一菌产多酶，具有生长稳定、产酶种类较多、安全的特性；酶活可观，日常保持在9‑11万，最高可达12万左右。

Description

以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用
技术领域
本发明涉及酶制剂领域，特别是指一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用。
背景技术
随着日益增长的禽类产品需求，饲养业对于人们的重要性逐年上升，对禽畜饲养的安全性、高效性、环保性提出了更高的要求。“禽以食为天”，饲料作为饲养业关键环节之一，受到高度重视。形势上，近年来对抗生素的使用控制越来越严格，中国在2020年进入“禁抗”时代，饲料添加剂中禁止检出规定中的抗生素。双趋势下直接推动了饲料的制作工艺、添加剂等产品的质量优化热潮，其中就包括以酸性蛋白酶为主的酶制剂。专利CN110973371 A公开了一种畜禽蛋白酶饲料添加剂，酸性蛋白酶作为主要成分之一按百分比配置该添加剂。专利CN 109965084 A公开了一种固体发酵豆粕生产高蛋白饲料的方法，其中是以添加了酸性蛋白酶的发酵原料进行固体发酵。
酸性蛋白酶是蛋白酶大类的分支，是一种能在酸性(pH值2～5)条件下将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类，催化结构域活性中心为天冬氨酸蛋白酶。其相对分子量在30～45kDa之间，等电点为3.0～5.0。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。微生物蛋白酶一个显著特点是具有多样性和复杂性，通常一株菌株可分泌一种或多种酸性蛋白酶，主要生产菌种有黑曲霉、宇佐美曲霉等。良好的水解蛋白能力和耐酸性，使得酸性蛋白酶具有广阔的应用空间，包括食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。而上述饲料领域的变革，对酸性蛋白酶在饲料领域的应用发展起到积极促进作用。
在饲料工业中，添加酸性蛋白酶可以有效提高饲料中蛋白类营养物质的利用率，主要是幼龄动物自身的消化分泌不健全，添加酸性蛋白酶可以将大分子蛋白质降解为多肽类物质，有助于提高消化吸收，降低饲料对其消化道的刺激，减少营养障碍。酸性蛋白酶对禽畜的促生长作用，使其成为抗生素的良好替代品之一。郭建来等(2007)研究发现，在仔猪日粮中添加0.1％的酸性蛋白酶，可以显著提高仔猪的生长性能，并显著降低腹泻率。
在研究分析方向，酸性蛋白酶的分离纯化、分析鉴定、酶学性质等技术日益成熟。谢必峰等(2007)采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对该酶的氨基酸组分进行了分析。王云(2008年)通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对，鉴定为曲霉酸性蛋白酶后对该酶进行了分子生物学方面的研究。
在优化产能方面，提高酸性蛋白酶的活性和适应性是酸性蛋白酶优化中最主要的促进点，改良菌种和培养条件成为最常见的优化方式。王水顺等(2002年)通过紫外线和亚硝基胍复合诱变的方法获得一株复合酶高产菌株SL2-III，在此基础上，以酸性蛋白酶发酵酶活为响应值，采用单因素搜索和正交试验对变株SL2-III固体发酵工艺进行优化，优化后酶活达到6428U/g。专利CN 107760612 B公开了以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线(UV)与亚硝基胍(NTG)联合诱变技术，筛选出产酸性蛋白酶的黑曲霉yy07(Aspergillus nigeryy07)菌株，该菌株通过固体发酵生产饲用酸性蛋白酶的最高酶活达1646U/g。专利CN107586789 A中，公开了构建酸性蛋白酶的表达盒、导入黑曲霉表达宿主菌、获得高产酸性蛋白酶黑曲霉表达菌株的基因工程方法。该改造菌株液体发酵条件优化后酸性蛋白酶的表达水平可达25000-26000U/ml。CN 105199969 B公开了一种液体发酵酸性蛋白酶通过液体深层发酵配合补料工艺，产酶水平为21852U/mL。CN101948820 A公开了一种酸性蛋白酶及其制备方法，以黑曲霉CICC2238为产酶菌种，麦麸为主要原料生从的酸性蛋白酶最适pH2.5-3.5，最适作用温度40-50℃，采用固体发酵工艺制备的酸性蛋白酶酶活≥47000U/g，液体酶收率≥85％，固体酶收率≥80％。专利CN 110904083 A中，运用固体发酵产酸性蛋白酶，其酶活常规达到7万U/g，工艺设计优化后产出酸性蛋白酶酶活力为8-10万U/g。
酶制剂的巨大市场，推动纷繁多样的酶制剂产品问世。酸性蛋白酶酶制剂大类中，液体深层发酵后分离纯化所得多为单一酸性蛋白组分的酶制剂；由酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等组分单一的纯酶按百分比等配比形式混合在一起的为组合式蛋白酶(部分产品称此类酶为复合酶)；一到两种蛋白酶为主酶、果胶酶、木聚糖酶等几十上百种辅酶在发酵代谢过程中自然产生、协同作用底物的多酶体系构成复合酶，一般固体发酵得到的产物即为真正意义上的复合酶式蛋白酶。针对不同的用途，选用相应的酶制剂。
环保和经济效益方面，随着集约化畜禽养殖业的发展，养殖动物氮的排放成为污染环境的主要物质。因而提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低氮排放就显得尤为重要。乔伟等(2017)综合分析后，发现运用酸性蛋白酶后，麸皮、秸秆等低蛋白发酵原料得到很好的消化降解，氮磷在禽畜体内的利用率提高，排放量下降，环境友好程度上升。饲养禽畜料肉比减小，健康状况得到改善，收益率增加，经济效益稳中有升。丹麦和瑞士研究人员研究了在肉鸡日粮中添加蛋白酶降低日粮蛋白含量对改善环境的影响，发现使用蛋白酶可以显著降低畜牧生产中的氮排放。
根据上述酸性蛋白酶的研究进展可知，目前的酸性蛋白酶发展趋势良好，市场需求大，生产技术逐步优化。但分析发现，依旧存在如下问题：
1.在应用效果及优化工艺上，酸性蛋白酶酶活依旧有较大上升空间，可以进一步提高酶解效率。
2.酶制剂的酶蛋白检测方法成熟，但应用相对单一，通常是针对某种蛋白质进行分析。处理蛋白组分多、分离提纯难度大的固体发酵产物，此种方法不适宜，需要找到更适合的方法。
3.目前未找到对固体发酵酸性蛋白酶的酶系进行系统研究的报道，模糊不清的粗放生产对后续深入研究菌种、多酶相互作用、优化发酵工艺思路的拓宽等均有不利影响。
4.基于发酵饲料的原料越来越趋向于麸皮、秸秆、棉粕等农业残渣，酶制剂中的酶系需与发酵原料的复杂结构相对应，才能起到良好的酶解效果。单酶或组和酶酶系与发酵原料的复杂结构的对应性较差，酶解效率受抑制。
5.液体发酵工艺成熟、过程可控，是一种可行的生产酶制剂的发酵工艺。但后续的分离纯化、冷冻干燥等后处理过程耗能大，对设备有较高要求，对厂家成本要求高。且液体发酵的产物较固态发酵少，酶系丰富程度低于固体发酵。
发明内容
本发明提出一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备及其菌株和应用，以解决上述技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其中，
所述菌株为黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389，保藏号CGMCC No.19613；
培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶制剂。
在一些实施例中，所述酶制剂的制备包括：一级斜面培养、二级液体种子制备、三级液体种子制备、扩大培养一级固体培养；
其中，(1)一级斜面培养
将菌种黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389接种至土豆汁葡萄糖斜面培养基上，28℃～31℃培养5～7d，得到萌发孢子的斜面；
(2)二级液体种子制备
取步骤(1)中斜面上的孢子菌丝混合物，接种至摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养；瓶内种子菌液呈粘稠状后终止培养，冷藏保存；
(3)三级液体种子制备
将步骤(2)中培养好的摇瓶打开，取液态种子接种至三级摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养；
(4)扩大培养
发酵罐内注入液态培养基，进行高压蒸汽灭菌60～80min；停止灭菌后温度降至20～35℃并保持；取步骤(3)中已培养好的液态种子，通过灭菌发酵罐口快速倒入发酵罐中，通无菌空气，搅拌培养；
(5)固体培养基的接种培养
将步骤(4)中培养好的液态培养基按5％～15％的重量比放入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，静置发酵培养；相对湿度80～90％，料温28℃～35℃，发酵周期3～5d；
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮85～95％，豆粕粉5～15％，硫酸铵0.5～1.5％，初始水分40～55％，pH自然。
在一些实施例中，所述液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
在一些实施例中，所述摇床震荡培养条件：28℃～30℃，转速180～220r，培养周期1～3d；所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，40～60min；所述的冷藏保存的条件：4℃，5～8d。
在一些实施例中，所述发酵罐培养的要求：27℃～32℃，搅拌转速150～200r，培养周期1～3d；所述发酵罐的灭菌要求：121℃，0.1MPa，60～80min；
所述发酵罐罐口的灭菌要求：接种操作前酒精火圈灼烧3～5min，接种期间保持火不灭，接种完毕后关闭罐口，火圈撤离并熄灭。
在一些实施例中，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5～15％停止。
本发明还提供了一种黑曲霉(Aspergilus niger)，命名为黑曲霉BAK200389，其保藏号为CGMCC No.19613。
本发明还提供了一种畜禽饲料，包括上述黑曲霉BAK200389的培养产物。
本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明产出的酶之间具有很好的补充和配合作用，对裂解植物细胞壁中的大分子化学键、松散致密有序的空间结构、生成多种有益代谢产物具有重要的协同作用。
(2)本发明所用菌株，可一菌产多酶，具有生长稳定、产酶种类较多、安全的特性。
(3)本发明提供的酸性蛋白酶酶制剂，产酶经特定底物诱导更具有针对性，拥有7大类、38种酶蛋白。代表酶系包括：酸性蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶等。
(4)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶酶活可观。根据相关国家标准检测，日常保持在9-11万，最高可达12万左右，高于已知饲料酸性蛋白酶生产酶活。目前市面销售的酸性蛋白酶，均为液体发酵浓缩干燥而成，常规酶活为50000U/g，有少部分10万U/g或20万U/g，固体发酵酸性蛋白酶酶活在3-5万U/g左右。
(5)本发明中，采用现代固体发酵工艺和蛋白质组学检测理论的组合模式，以现代固体发酵理论指导下的生产工艺为基础：针对性底物诱导发酵，通过呼吸袋静置发酵，发酵期间较严格控制培养参数；以蛋白质组学检测方法进行研究：高效率检测酶制剂中的所有酶蛋白及有益于禽畜的代谢产物，依据检测结果可对固体发酵的各类优化进行针对性调整，两者相辅相成。
与传统的固液发酵工艺、检测单一或少量蛋白酶的检测方法相比，操作更简单，卫生指标有了改善，研究方向更全面深入，功能更明确，对后续各方面的优化的指导意义更直接。
(6)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶具有很强的稳定性，可以避免在运输、加工、贮存过程中的酶活损失。
(7)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶制剂可作为饲料添加剂添加到大部分禽畜的基础日粮中，包括但不限制于鸡，鸭，猪，兔子等禽畜。具有刺激免疫，提高机体健康水平等作用。
(8)本发明提供的多酶系酸性蛋白酶制剂可有效促进禽畜生产性能的提高，减少养殖成本的同时，增加收入。
(9)本发明的酸性蛋白酶工艺环保，耗能低，利用农业和工业残渣为生产原料，成本低，且工艺简单，较其他发酵方式更绿色环保。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389，于2020年4月8号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，邮政编码100101)，保藏编号：CGMCC No.19613。
ITS鉴定：
其ITSrDNA的区段序列(见序列表)比对结果如下。由结果可知，该菌株的基因序列与黑曲霉属有最高的相似度，故将其命名为黑曲霉CGMCC No.19613。
Figure BDA0002528296140000081
Figure BDA0002528296140000091
实施例1
一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，包括以下步骤：
1.一级斜面培养
将菌种黑曲霉(Asperijilus niger)BAK200389接种至土豆汁葡萄糖斜面培养基上，28℃～31℃培养5～7d，得到萌发孢子的斜面。
2.二级液体种子制备
于超净工作台中，刮取步骤1中斜面上的孢子菌丝混合物，接种至摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养。瓶内种子菌液呈粘稠状后终止培养，放入冰箱冷藏保存。
所述摇床震荡培养条件：28℃～30℃，转速180～220r，培养周期1～3d。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为250/500mL。
所述的液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，40～60min。
所述的冰箱保存的条件：4℃，5～8d。
3.三级液体种子制备
将步骤2中培养好的摇瓶于超净工作台中打开，移液管移取液态种子接种至三级摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养。
所述摇床震荡培养条件：28℃～31℃，转速180～220r，培养周期1～3d。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为500/1000mL。
所述的液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，50～70min。
4.发酵罐扩大培养
发酵罐内注入液态培养基，进行高压蒸汽灭菌60～80min。停止灭菌后温度降至20～35℃并保持。取步骤3中已培养好的液态种子4～8瓶，通过灭菌发酵罐口快速倒入发酵罐中，通无菌空气，搅拌培养。
所述发酵罐培养的要求：27℃～32℃，搅拌转速150～200r，培养周期1～3d。
所述发酵罐容积为100～400L。
所述的液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
所述发酵罐的灭菌要求：121℃，0.1MPa，60～80min。
所述发酵罐罐口的灭菌要求：接种操作前酒精火圈灼烧3～5min，接种期间保持火不灭，接种完毕后关闭罐口，火圈撤离并熄灭。
5.固体培养基的接种培养
将步骤4中培养好的液态培养基按5％～15％的重量比通过管道放入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，等量分装于呼吸袋中，铺平后于培养室静置发酵培养。
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮85～95％，豆粕粉5～15％，硫酸铵0.5～1.5％，初始水分40～55％，pH自然。
所述培养室的培养要求：相对湿度80～90％，料温28℃～35℃，发酵周期3～5d。
6.发酵产物的烘干
发酵周期结束后，将发酵产物控温烘干，烘干温度45～50℃，烘干时间12～24h，至含水量5～15％停止。
7.物料微粉碎
将步骤6中得到的烘干物料进行微粉碎。粉碎后，粒径达到60～120目。按所需重量自动化装袋。
此方案下，该多酶系酸性蛋白酶制剂的代表性酶系酶活如下表所示：
种类 酸性蛋白 木聚糖 果胶 淀粉 纤维素 β-甘露聚糖
酶活 119784 710 696 9.3 38 60
酸性蛋白酶酶活检测标准：GB 1886.174—2019
实施例2
一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，包括以下步骤：
1.一级斜面培养
将菌种黑曲霉(Asperijilus niger)CGMCC No.19615接种至改良马丁斜面培养基上，28℃培养5～7d，得到出孢子的斜面。
所述培养基组分：蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，酵母浸出粉2.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖20.0g，水1000ml，pH调至6.8。
2.二级液体种子制备
于超净工作台中，刮取步骤1中斜面上的孢子菌丝混合物，接种至摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养。瓶内种子菌液呈粘稠状后终止培养，放入冰箱冷藏保存。
所述摇床震荡培养条件：28℃～30℃，转速180～220r，培养周期1～3d。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为250/500mL。
所述的液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，40～60min。
所述的冰箱保存的条件：4℃，5～8d。
3.三级液体种子制备
将步骤2中培养好的摇瓶于超净工作台中打开，移液管移取液态种子接种至三级摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养。
所述摇床震荡培养条件：28℃～31℃，转速180～220r，培养周期1～3d。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为500/1000mL。
所述的液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，50～70min。
4.发酵罐扩大培养
100～400L发酵罐内注入液态培养基，进行高压蒸汽灭菌60～80min。停止灭菌后温度降至20～35℃并保持。取步骤3中已培养好的液态种子4～8瓶，通过灭菌发酵罐口快速倒入发酵罐中，通无菌空气，搅拌培养。
所述发酵罐培养的要求：27℃～32℃，搅拌转速150～200r，培养周期1～3d。
所述发酵罐容积为100～400L。
所述的液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然。
所述发酵罐的灭菌要求：121℃，0.1MPa，60～80min。
所述发酵罐罐口的灭菌要求：接种操作前酒精火圈灼烧3～5min，接种期间保持火不灭，接种完毕后关闭罐口，火圈撤离并熄灭。
5.固体培养基的接种培养
将步骤4中培养好的液态培养基按5％～15％的重量比通过管道放入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，等量分装于呼吸袋中，铺平后于培养室静置发酵培养。
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮85～95％，豆粕粉5～15％，硫酸铵0.5～1.5％，初始水分40～55％，pH自然。
所述培养室的培养要求：相对湿度80～90％，料温28℃～35℃，发酵周期3～5d。
6.发酵产物的烘干
发酵周期结束后，将发酵产物控温烘干，烘干温度45～50℃，烘干时间12～24h，至含水量5～15％停止。
7.物料微粉碎
将步骤6中得到的烘干物料进行微粉碎。粉碎后，粒径达到60～120目。按所需重量自动化装袋。
此方案下，该多酶系酸性蛋白酶制剂的代表性酶系酶活如下表所示：
酶系 酸性蛋白酶 木聚糖酶 果胶酶 淀粉酶 纤维素酶 β-甘露聚糖酶
酶活U/g 102170 835 665 629 40 37
实施例3
蛋白质检测方法及测定种类：
运用蛋白质组学分析方法，利用LC-MS进行蛋白质鉴定，通过软件分析后，鉴定出酶蛋白38个，共7大类，以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶等酶类为辅。部分酶蛋白列举如下：
曲霉素1(天冬氨酸蛋白酶pepA)、曲霉菌素2(酸性蛋白酶A)、羧肽酶、丝氨酸型羧肽酶F、果胶酯酶A、内聚半乳糖醛酸酶A(果胶酶A)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶axhA、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A、α-木糖苷酶A、β-木糖苷酶A、阿魏酸酯酶B、酸酯酶A、1,4-β-木聚糖内切酶C(木聚糖酶C)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B、1,4-β-木聚糖内切酶A(木聚糖酶A)、1,4-β-木聚糖内切酶B(木聚糖酶B)、α-淀粉酶A型1/2、葡糖淀粉酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶A、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶B、β-葡萄糖苷酶A(纤维二糖酶A)、葡聚糖内切1,3-β-葡糖苷酶eglC、内切葡聚糖酶A(纤维素酶A)、β-葡萄糖苷酶A、β-半乳糖苷酶A、甘露聚糖1,4-β-甘露糖苷内切酶A、β-甘露糖苷酶A、α-半乳糖苷酶B、α-半乳糖苷酶D、α-半乳糖苷酶D、酸性磷酸酶
麦麸作为农副产物，其主要成分是纤维素、半纤维素、木质素等细胞壁物质，产量大但深加工和再利用较少，经济附加值低。豆粕中粗蛋白质含量高达30～50％，可作为动物的蛋白质饲料。但未经处理的豆粕中含有抗胰蛋白酶、尿毒酶、皂角苷、甲状腺肿诱发因子等，对动物健康及饲料的消化利用产生不良影响。
本公司运用现代固体发酵的工艺生产出的拥有天然酶系的酸性蛋白酶酶制剂，培养基成分的诱导作用和适应的培养条件下，其所含的各类酶被天然生成，进而降解底物。在酶制剂领域，真正明确了以麸皮、豆粕粉、硫酸铵等为诱导底物的黑曲霉BAK200389固体发酵产物所含的酶类。上述酶系的组成，直观反应出底物诱导对产酶的密切关联性，从蛋白组学层面体现了该酸性蛋白酶制剂易吸收利用、促进禽畜生长、提高免疫力的功能。为研究不同底物的诱导产酶机制、酶制剂在禽畜体内体外的应用机理、各酶类的协同作用、不同方向的针对性优化等，提出了基础模板和指导性参考。该酸性蛋白酶对底物针对性更强，酶系组成全面、合理，可以发挥出各类酶之间的良好协同性。
效果验证：酸性蛋白酶制剂选用实施例1制得的。
1、多酶系酸性蛋白酶对仔猪生产性能的影响
该实验以仔猪生产性能为指标，设计了不加该酸性蛋白酶制剂的对照组和加酸性蛋白酶的试验组。具体试验参数及得到的数据见表1。
表1酸性蛋白酶制剂的添加对仔猪生产性能的影响
Figure BDA0002528296140000151
由表1数据所示，与未加多酶系酸性蛋白酶的对照组相比较，每吨基础日粮添加300g多酶系酸性蛋白酶，经30d饲喂试验后，试验组仔猪较对照组增重0.64kg，料肉比由1.47降低至1.44。仔猪的生产性能有了较好提升。
2、多酶系酸性蛋白酶对肉鸡生产性能的影响
该实验以肉鸡生产性能为指标，对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂酸性蛋白酶和基础日粮的混合饲料。具体试验参数及得到的数据见表2。
表2酸性蛋白酶制剂的添加对肉鸡生产性能的影响
Figure BDA0002528296140000161
由表2数据所示，与饲喂基础日粮的对照组相比，饲喂每吨基础日粮添加800g多酶系酸性蛋白酶的混合饲料后，肉鸡的生产性能有了较好提升。实验组单只肉鸡的平均体重较对照组增重120.51g，料肉比由1.64降低至1.59，成活率提高了1.7％，欧指(EPI)增加了37.17，体现了该酸性蛋白酶制剂对肉鸡生产性能的促进作用，结合养殖企业养殖数量大，提高效益的潜力良好。
3、多酶系酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的影响
该实验以蛋鸡生产性能为指标，设计了饲喂基础日粮的对照组和添加本发明中酸性蛋白酶的混合饲料的试验组。具体试验参数及得到的数据见表3。
表3酸性蛋白酶制剂的添加对蛋鸡生产性能的影响
Figure BDA0002528296140000171
由表3数据所示，与未加多酶系酸性蛋白酶的对照组相比较，每吨基础日粮添加100g多酶系酸性蛋白酶，经35d饲喂试验后，蛋鸡的平均蛋重增长了0.24g，平均日采食量减少0.78g/天，产蛋率提高了3.52％。饲喂试验验证了本公司的多酶系酸性蛋白酶对蛋鸡生产性能的促进作用。
4、多酶系酸性蛋白酶对母猪腹泻的影响
在母猪日粮中添加300g/t的多酶系酸性蛋白酶，显著改善断奶仔猪的腹泻情况，与众多文献中表现一致，结果较好。
Figure BDA0002528296140000172
Figure BDA0002528296140000181
由上表可知，实验组的母猪腹泻率低于对照组，腹泻减少0.84％。饲喂试验验证了本公司的多酶系酸性蛋白酶对母猪腹泻的抑制作用。
序列表
<110> 杭州保安康生物技术有限公司
<120> 富含酸性果胶酶的复合酶的制备及其菌株和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1360
<212> DNA
<213> 黑曲霉BAK200389(Aspergillus niger)
<400> 1
gcttctgggg cttgaggccg atagtccccc taagaagcca gcggcccgca aatgcggacc 60
gggctattta agggccgagg tctcgttcgt tatcgcaatt aagcagacaa atcactccac 120
caactaagaa cggccatgca ccaccatcca aaagatcaag aaagagctct caatctgtca 180
atccttattt tgtctggacc tggtgagttt ccccgtgttg agtcaaatta agccgcaggc 240
tccacgcctg gtggtgccct tccgtcaatt tctttaagtt tcagccttgc gaccatactc 300
cccccagaac ccaaaaactt tgatttctcg taaggtgccg aacgggtcat aatagaaaca 360
ccgtccgatc cctagtcggc atagtttatg gttaagacta cgacggtatc tgatcgtctt 420
cgatccccta actttcgttc cctgattaat gaaaacatcc ttggcgaatg ctttcgcagt 480
agttagtctt cagcaaatcc aagaatttca cctctgacag ctgaatactg acgcccccga 540
ctatccctat taatcattac ggcggtccta gaaaccaaca aaatagaacc gcacgtccta 600
ttctattatt ccatgctaat gtattcgagc aaaggcctgc tttgaacact ctaatttttt 660
cacagtaaaa gtcctggttc cccccacagc cagtgaaggc catgagattc cccagaagga 720
aaggtccagc cggaccagta ctcgcggtga ggcggaccgg ccagccagac ccaaggttca 780
actacgagct ttttaactgc aacaacttta atatacgcta ttggagctgg aattaccgcg 840
gctgctggca ccagacttgc cctccaattg ttcctcgtta agggatttag attgtactca 900
ttccaattac gagacccaaa agagccccgt atcagtattt attgtcacta cctccccgtg 960
tcgggattgg gtaatttgcg cgcctgctgc cttccttgga tgtggtagcc gtttctcagg 1020
ctccctctcc ggaatcgaac cctaattccc cgttacccgt tgccaccatg gtaggccact 1080
atcctaccat cgaaagttga tagggcagaa atttgaatga accatcgccg gcgcaaggcc 1140
atgcgattcg ttaagttatt atgattcacc aaggagcccc gaagggcatt ggttttttat 1200
ctaataaata caccccttcc gaagtcgagg ttttcagcat gtattagctc tagaattacc 1260
acaggtatcc atgtagtaag gtactatcaa ataaacgata actgatttaa tgagccattc 1320
gcagtttcac agtataaagt gccttatact tagacccgac 1360

Claims (7)

1.一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，
所述菌株为黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389，保藏号CGMCC No.19613；
培养得到以酸性蛋白酶为主，果胶酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、阿魏酸酯酶、羧肽酶、磷酸酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系酸性蛋白酶制剂。
2.根据权利要求1所述的一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，所述酶制剂的制备包括：一级斜面培养、二级液体种子制备、三级液体种子制备、扩大培养一级固体培养。
3.根据权利要求2所述的一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，(1)一级斜面培养
将菌种黑曲霉(Aspergilus niger)BAK200389接种至土豆汁葡萄糖斜面培养基上，28℃～31℃培养5～7d，得到萌发孢子的斜面；
(2)二级液体种子制备
取步骤(1)中斜面上的孢子菌丝混合物，接种至摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养；瓶内种子菌液呈粘稠状后终止培养，冷藏保存；
(3)三级液体种子制备
将步骤(2)中培养好的摇瓶打开，取液态种子接种至三级摇瓶中的液态培养基，摇床震荡培养；
(4)扩大培养
发酵罐内注入液态培养基，进行高压蒸汽灭菌60～80min；停止灭菌后温度降至20～35℃并保持；取步骤(3)中已培养好的液态种子，通过灭菌发酵罐口快速倒入发酵罐中，通无菌空气，搅拌培养；
(5)固体培养基的接种培养
将步骤(4)中培养好的液态培养基按5％～15％的重量比放入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，静置发酵培养；相对湿度80～90％，料温28℃～35℃，发酵周期3～5d；
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮85～95％，豆粕粉5～15％，硫酸铵0.5～1.5％，初始水分40～55％，pH自然。
4.根据权利要求3所述的一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，所述液态培养基按下述重量比例配制(％)：麦芽糊精4.0～8.0％，葡萄糖2.0～3.5％，蛋白胨0.5～2.0％，细麸皮1.0～3.0％，pH自然；
所述摇床震荡培养条件：28℃～30℃，转速180～220r，培养周期1～3d；所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，0.1MPa，40～60min；所述的冷藏保存的条件：4℃，5～8d；
所述发酵罐培养的要求：27℃～32℃，搅拌转速150～200r，培养周期1～3d；所述发酵罐的灭菌要求：121℃，0.1MPa，60～80min；
所述发酵罐罐口的灭菌要求：接种操作前酒精火圈灼烧3～5min，接种期间保持火不灭，接种完毕后关闭罐口，火圈撤离并熄灭。
5.根据权利要求3所述的一种以酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5～15％停止。
6.一种黑曲霉(Aspergilus niger)，命名为黑曲霉BAK200389，其保藏号为CGMCCNo.19613。
7.一种畜禽饲料，其特征在于，包括权利要求1所述黑曲霉BAK200389的培养产物。
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