CN111607574A - 以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用 - Google Patents

以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用，其中培养得到以木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶为主，阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系复合酶制剂。黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉BAK200308，其保藏号为CGMCC No.19615。本发明产出的酶之间具有很好的补充和配合作用，对裂解植物细胞壁中的大分子化学键、松散致密有序的空间结构变得具有重要的协同作用。该筛选菌株能够一菌产多酶，具有生长稳定、产酶种类多、安全的特性。

Description

以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用
技术领域
本发明涉及酶制剂领域，特别是指一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用。
背景技术
传统畜牧养殖业都是以追求高饲料报酬、高生长速度，低成本提高经济效益，以牺牲环境和消耗资源作为代价而发展。我国的畜牧业在一定历史阶段内要在农业经济中占很大比例。作为畜牧业大国和销售大国，中国的动物饲养产业保持稳定的高水平。
2018年，我国畜牧业总产值主要产品产量保持平稳。根据国家统计局数据显示，牛肉产量644万吨，增长1.5％；羊肉产量475万吨，增长0.8％；禽肉产量1994万吨，增长0.6％。禽蛋产量3128万吨，增长1.0％。牛奶产量3075万吨，增长1.2％。同期，据农业农村部定点监测，国内1—10月产蛋鸡平均存栏同比增加2.1％，鸡蛋价格和淘汰鸡价格均维持相对高位，全年只鸡盈利再回较大利润区间，同比大幅上升；国际上，美国、日本等国家的蛋鸡存栏量均较上年增加2.2％以上。以上数据显示，畜牧业的行情看好，畜产品的需求量居高不下，在畜牧业的饲料养殖、禽畜医药等方向有巨大的增长空间。
传统养殖的粗放模式，以及秸秆等低营养饲料的选用，污染环境，产能低下。随着科技的发展进步，规模化养殖和处理型饲料成为主流。粉碎、酸碱或氨水浸泡等处理粗饲料的方式可以部分提高禽畜对营养的吸收效率，但同时带来了污染环境、高耗能、禽畜体内残留治病等严重问题。大众对食品安全的重视和监督逐年提高，“绿水青山就是金山银山”的概念也日益深入人心，对畜产品的生产和品质提出了更高的要求。效益与挑战并存，发展高效无公害养殖生产技术成了我国畜牧业发展的必然之路。生物发酵、酶水解为主的微生物处理饲料的方法，以其不产生残留、无抗药性、对环境友好等特点，为无公害饲料的生产提供了新途径新思路，是发展安全、高效、优质的绿色养殖业的有效技术。
酶制剂，作为饲料添加剂中重要的组成部分，主要通过微生物的发酵生产，是为了提高动物对饲料的消化、利用或改善动物体内的代谢效能而加入饲料中的酶类物质。主要功能包括但不限于：(1)饲料所含抗营养因子的消除，减少蛋白酶抑制因子、植物凝集素、水溶性非淀粉多糖、植酸、单宁等多种抗营养因子对禽畜的影响；(2)禽畜肠道菌群的改善，提高畜禽免疫机能，调节内分泌，促进生长，是饲用抗生素的有力替代品；(3)饲料消化及利用率的明显提高，禽畜内源分解酶的不足得到有效补充；(4)养殖业对环境的污染程度减轻，饲料中植酸酶的添加减少了单胃动物对磷酸盐吸收少而导致的排放。酶制剂水解底物的机理为：专一作用于底物的某一类连接键，使底物分裂为更易吸收利用的片段或小分子。例如，糖化酶主要作用于淀粉的非还原性末端，依次水解α-1,4糖苷键生成葡萄糖；蛋白酶是作用于蛋白质或多肽，催化肽键水解的酶类；木聚糖水解酶系(xylanolytic enzymesystems)是一类降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶。
广泛的适用范围、有效的水解底物功能，为酶制剂在饲料上的应用打下基础。安全可控的使用操作、部分替代抗生素的生物活性，更让酶制剂备受养殖业的青睐，针对生物产酶的研究与产业也进一步增加。饲料添加剂用的酶制剂产品有20余种，纤维酶、果胶酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶等单一酶制剂以及将几类酶按比例混合的复配酶制剂，是目前最常见的市售酶制剂。酶制剂的研究和生产，已发展到一定的规模，在实际应用中表现较好。
戚永跃等通过液体发酵及序列分析，筛选出一株高产木聚糖酶的拟盘多毛孢属菌株，粗酶液的木聚糖酶酶活在液体发酵第3天达到峰值49.3U/mL，SDS—PAGE及酶谱分析表明，该菌株至少能够分泌6种不同分子量的胞外木聚糖酶。李洪兵等人的专利中，公开了一种酶系全、酶活力高的含中性蛋白酶的饲料复合酶。该中性蛋白酶通过液体发酵制得，发酵液酶活可达5500-7000U/mL。含该中性蛋白酶的饲料复合酶则由浓缩麦芽酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性木聚糖酶、中草药提取物、保护剂、激活剂按比例复配而成。杨育才等对酶制剂产品溢多酶868B(其主要成分为：木聚糖酶≥6 000u/g、果胶酶≥400u/g、蛋白酶≥300u/g)进行了动物实验，发现对蛋鸡的产蛋性能有提高作用。文中推测，显著改善蛋鸡产蛋性能的原因有二：1)饲料添加木聚糖酶降低肠道食糜粘度，蛋白酶增加蛋白质吸收；2)在发酵过程中，微生物可能分泌一些维生素、蛋白质以及一些未知促生长因子。王海彦等的专利中，公开了一种和酵母产品复合的功能性甘露聚糖酶制剂，以豆粕和全株酵母为底物，通过固体发酵工艺制得，获得富含甘露聚糖酶、葡萄糖氧化酶的多酶谱体系。该酶制剂中，甘露聚糖酶酶活≥5000U/g、葡萄糖氧化酶酶活≥80U/g、酵母多糖含量≥20％。对禽畜的实际饲喂中，效果较好，对禽畜的繁殖、生长、免疫性能有一定的改善提高。
上述对酶制剂的研究和实际应用，均有较好表现。但也反应出部分未得到重视的问题。1)发酵工艺的选取。酶制剂生产运用液体发酵居多，固体发酵偏少。与液体发酵相比，固体发酵虽然存在发酵周期较长、天然原料成分复杂略不稳定的缺点，但微生物易生长、酶活力高、酶系丰富、不需严格无菌条件、设备构造简单、投资少、能耗低、易操作、后处理简便、污染少、基本无废水排放等优点更适合进行环保型多酶系复合酶制剂的生产；2)酶制剂配伍方式单一。目前市场上，复合酶制剂多以按重量占比搭配为主。饲料原料复杂多样，化学键链接交错复杂，空间结构稳定。盲目或简单得以降解单一底物的程度和降解酶系的种类复配，实际应用中无法将这些复杂的化学键全部打开，酶制剂功效不能最大化；3)成品酶活偏低：发酵或复配的复合酶制剂，因未经过分离纯化、冷冻干燥(高耗能高工艺要求)等浓缩手段处理，其酶活普遍偏低；4)复合酶制剂中的酶系模糊，协同作用机理不明确：少部分利用固体发酵工艺生产的复合酶制剂产品，只靠单纯检测部分酶种的酶活来推测成分，靠实际的禽畜饲喂摸索效果。酶活产生、酶系组成、不同酶系协同作用等机理没有明确，造成了“知其优，不知其所以优”的困惑局面，限制了酶制剂领域的深层次研究和养殖业的发展。
发明内容
本发明提出一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用，解决了现有技术中复配酶活低、酶系模糊的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其中：
所用菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200308，CGMCC No.19615；培养得到以木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶为主，阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系复合酶制剂。
在一些实施例中，所述酶制剂的制备包括：斜面培养步骤、种子制备步骤和固体培养基接种培养步骤；
其中，
(1)斜面培养步骤为：
将黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200308接种至改良察氏斜面培养基上，28℃～30℃培养5～7d，得到长满黑曲霉孢子的斜面；
(2)种子制备步骤：
将上述步骤(1)中斜面上的孢子于无菌室中接种至摇瓶中的麸皮培养基上，28℃～32℃，培养6～7d，得到大量黑曲霉孢子；
所述麸皮培养基按下述重量比例配制(％)：麸皮50～60％，氯化铵0.5～1.5％，含水量40～50％，pH自然；
(3)固体培养基接种培养步骤
取上述步骤(2)中得到的孢子培养基按1％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，静置发酵培养，曲房相对湿度保持在85％～95％，料温控制在30℃～45℃，发酵周期3～5天；
所述固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮30～40％，玉米芯30～40％，豆粕粉25～35％，轻质碳酸钙2～5％，初始水分55～65％，pH自然。
在一些实施例中，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5～15％停止。
在一些实施例中，所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，50～70min。
本发明还提供了一种黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉BAK200308，其保藏号为CGMCC No.19615。
本发明还提供了一种畜禽饲料，包括上述黑曲霉BAK200308的培养产物。
本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明产出的酶之间具有很好的补充和配合作用，对裂解植物细胞壁中的大分子化学键、松散致密有序的空间结构变得具有重要的协同作用。
(2)黑曲霉BAK200308由保安康固体发酵研发中心筛选，可一菌产多酶，具有生长稳定、产酶种类多、安全的特性。
(3)本发明提供的多酶系复合酶，产酶经特定底物诱导更具有针对性，酶蛋白种类更多，共14大类，105种酶蛋白。代表酶系包括：木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶、阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶等。
(4)本发明中，采用现代固体发酵工艺和蛋白质组学检测理论的组合模式，以现代固体发酵理论指导下的生产工艺为基础：针对性底物诱导发酵，通过浅盘静置发酵，发酵期间较严格控制培养参数，以蛋白质组学检测方法进行研究：高效率检测酶制剂中的所有酶蛋白及有益于禽畜的代谢产物。与传统的固液发酵工艺、检测单一蛋白质的检测方法相比，操作更简单，研究更深入明确，功能更明确。
(5)本发明提供的多酶系复合酶具有很强的稳定性，可以避免在运输、加工、贮存过程中的酶活损失。
(6)本发明的现代固体发酵工艺属于环境友好型工艺，节能减排更到位。在合理的培养条件把控下，设备投资减少，能耗降低；不产生废气废水废渣，环境污染小。该工艺符合政策导向，适合大规模推广应用。
(7)本发明提供的多酶系复合酶制剂可有效促进禽畜生产性能的提高，减少养殖成本的同时，增加收入。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：饲料原料溶胀度程度比较；A-市售复合酶、B-本发明酶制剂、C-对照组；
图2：酶制剂对母猪便秘的影响；
图3：对霉菌毒素降解的效果：a、b为使用前，c为使用后。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
生物保藏：
黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200308，于2020年4月8号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，邮政编码100101)，保藏编号：CGMCC No.19615。
ITS鉴定：
该菌株ITSrDNA的区段序列(见序列表)比对结果：该菌株的基因序列与黑曲霉属有最高的相似度，故将其命名为黑曲霉BAK200308。
本发明中提供的黑曲霉BAK200308，是经过严格驯化培育得到的高产复合酶菌株。驯化前的菌株发酵最高酶活为木聚糖酶3502U/g、酸性蛋白酶3198U/g。
本发明基于现有复配酶制剂的问题，进行深入探究。研发了现代固体发酵技术。现代固体发酵是指利用天然底物(多种饲料原料)作为碳源及氮源，将发酵原料严格灭菌，选用定向筛选的安全的高产酶菌株，在基本没有游离水的固态基质(培养基)上，在严格无菌的条件下发酵培养，诱导微生物产生天然酶系的发酵方式。该发酵技术具有底物诱导的特点，在多酶协同性和底物针对性上的优势和特色非常明显，在解决饲料原料结构复杂性方面具有较大的潜力。结合对产品中酶蛋白组成结构的研究，该技术在固体发酵领域表现出良好的发展力。
本公司提出了上述现代固体发酵的工艺概念，并加以实际应用：以黑曲霉为发酵菌种，以麸皮、玉米芯粉、豆粕等为固体培养基，在严格把控的培养条件下进行固体发酵培养，生产出拥有天然酶系的新一代高酶活复合酶制剂。该产品涵盖了14大类酶系、105种酶，在酶制剂领域，首次真正意义上的表明了以麸皮、豆粕等为底物的黑曲霉固体发酵产物所产酶类，为研究酶制剂在禽畜体内体外的应用机理、各酶类的协同作用、不同方向的针对性优化等，提出了基础模板和指导性参考。酶系的明确，结合已知的各大类酶的作用，也证实了此复合酶制剂具有有效降解饲料、调节动物消化道、提高饲养生产性能、替代抗生素等多种良好功效。
人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。
原料方面，由于饲料原料的多样性，饲料中存在多种抗营养因子。上述本公司的复合酶，是用特定的饲料原料作为产酶培养基，通过固体发酵方式产出。其所含的各类酶，是因培养基成分的诱导天然生成。所以，该复合酶对底物针对性更强，酶系组成全面、合理，可以发挥出各类酶之间的良好协同性。
环境保护方面，相对于传统发酵，本公司采用的现代固体发酵工艺在减排方面更到位。在合理的培养条件把控下，设备投资减少，能耗降低；不产生废气废水废渣，仅产生极少量清洗用水，环境污染小。该工艺属于环境友好型工艺，符合政策导向，适合大规模推广应用。
成本耗费方面，对于养殖专业户，本公司复合酶制剂产品的酶活较同类产品高，代表性的木聚糖酶12042U/g，酸性蛋白酶12003U/g。单位重量上消耗的酶制剂减少，整体养殖成本下降；禽畜生产性能提高，增收潜力佳。对生产厂家，该固体发酵所用底物为农产品加工后的“下脚料”，麸皮、玉米芯、豆粕等材料价格低廉，来源广泛，节省成本。“下脚料”的二次利用，即对自然资源的二次利用，有利于可持续的经济发展。
饲料安全方面，介于镰刀菌毒素等对禽畜产能的显著削弱，以及其代谢产物在禽畜产品中的残留，可通过食物链对人类健康带来极大的潜在危害，控制消减霉菌毒素一直是饲料生产重点把控的结点。此外，高锌高铜日粮的饲喂，加重禽畜体内残留的同时，对环境、对人类的健康必然带来不利影响。本公司所产复合酶的酶系中，含有的酯酶可以有效降解镰刀菌毒素(玉米赤霉烯酮、伏马毒素、呕吐毒素、T-2毒素)的酯键，从而消除或减轻毒素对禽畜的毒害作用，提高饲料的安全系数，提高牧场生产性能。同时，该复合酶产品在生产中无高锌高铜的添加，没有禽畜产品残留、环境污染和影响人类健康的风险。
本公司的酶制剂产品包含多种酶系、多种产物，从肠道微生物菌群、内分泌、免疫系统等各个方面协同调整禽畜的机体状态，促进其健康生长，提高其自身的免疫能力，从根本上消除对抗生素的依赖。
实施例1
一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，包括以下步骤：
1.一级斜面培养
将原始菌种黑曲霉(Asperijillus niger)BAK200308接种至改良察氏斜面培养基上，28℃～30℃培养5～7d，得到长满黑曲霉孢子的斜面。
2.二级种子制备
将步骤1中斜面上的孢子于无菌室中接种至摇瓶中的麸皮培养基上，28℃～32℃，培养6～7d，得到大量黑曲霉孢子。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为250/500/1000mL。
所述的麸皮培养基按下述重量比例配制(％)：麸皮50～60％，氯化铵0.5～1.5％，含水量40～50％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，50～70min。
3.固体培养基的接种培养
取步骤2中得到的孢子培养基按1％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，等量分装于底部有孔的浅盘中并铺平，静置发酵培养，曲房相对湿度保持在85％～95％，料温控制在30℃～45℃，发酵周期3～5天。
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮30～40％，玉米芯30～40％，豆粕粉25～35％，轻质碳酸钙2～5％，初始水分55～65％，pH自然。
4.发酵产物的烘干
发酵周期结束后，将发酵产物控温烘干，烘干温度50℃，烘干时间12～24h，至含水量5～15％停止。
5.物料微粉碎
将步骤4中得到的烘干物料进行微粉碎。粉碎后，粒径达到60～120目。按所需重量自动化装袋。
此方案下，该多酶系复合酶制剂的代表性酶系酶活如下表所示：
Figure BDA0002528244360000111
代表酶活测定标准：
木聚糖酶：GB/T 23874—2009
酸性蛋白酶：GB 1886.174—2016
实施例2
一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，包括以下步骤：
1.一级斜面培养
将原始菌种黑曲霉(Asperijillus niger)BAK200308接种至改良察氏斜面培养基上，28℃～30℃培养5～7d，得到长满黑曲霉孢子的斜面。
2.二级种子制备
将步骤1中斜面上的孢子于无菌室中接种至摇瓶中的麸皮培养基上，28℃～32℃，培养5～6d，得到大量黑曲霉孢子。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为250/500/1000mL。
所述的麸皮培养基按下述重量比例配制(％)：麸皮45～60％，氯化铵1.0～2.0％，含水量40～50％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，60～70min。
3.固体培养基的接种培养
取步骤2中得到的孢子培养基按1％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，等量分装于底部有孔的浅盘中并铺平，静置发酵培养，曲房相对湿度保持在85％～95％，料温控制在30℃～45℃，发酵周期3～5天。
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮40～50％，玉米芯30～40％，豆粕粉15～25％，轻质碳酸钙2～5％，初始水分55～65％，pH自然。
4.发酵产物的烘干
发酵周期结束后，将步骤3得到的发酵产物控温烘干，烘干温度50℃，烘干时间24～36h，至含水量5～10％停止。
5.物料微粉碎
将步骤4中得到的烘干物料进行微粉碎。粉碎后，粒径达到60～120目。按所需重量自动化装袋。
此方案下，该酶制剂的代表性酶系酶活如下表所示：
Figure BDA0002528244360000121
实施例3
蛋白质检测方法及测定种类：
运用蛋白质组学分析方法，利用LC-MS进行蛋白质鉴定，所用质谱仪器是Thermo公司Q-Exactive。主要流程是先对蛋白进行定量后，通过还原烷基化打开蛋白三维结构，酶解后再抽提出肽段，再运用质谱技术得到这些肽段的质谱图，最后运用蛋白质鉴定软件，鉴定出样品中的蛋白质。
通过Proteome Discoverer软件进行分析后，共鉴定到酶蛋白105个，共14大类，以木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶等酶类为主，阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶等酶类为辅。部分酶蛋白列举如下：
酸性蛋白酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、糖化酶I、β-1,4-木糖苷外切酶、β-葡萄糖苷酶A、β-1,4-木聚糖内切酶C、β-1,4-木聚糖内切酶A、β-半乳糖苷酶A、糖化酶、α-木糖苷酶A、β-甘露聚糖酶A、丝氨酸型羧肽酶F、β-1,4-木聚糖内切酶B、β-1,4-葡聚糖内切酶B、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、多聚半乳糖醛酸内切酶I、羧肽酶、阿魏酸酯酶B、β-1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶A、果胶裂解酶A、α-葡萄糖醛酸酶A、果胶裂解酶A、阿魏酸酯酶A、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B、α-半乳糖苷酶B、多聚半乳糖醛酸内切酶II、乙酰木聚糖酯酶A、果胶酯酶A、多聚半乳糖醛酸内切酶B、β-1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶B、核糖核酸酶M、葡聚糖内切酶A、甘露糖基低聚糖α-1,2-甘露糖苷酶1b、果胶酯酶、过氧化氢酶R、鼠李糖半乳糖醛酸酶B、果胶裂解酶F、3-植酸酶B、鼠李糖半乳糖醛酸酶A、木葡糖醛酸内切酶A、3-植酸酶B、酸性α-淀粉酶、阿拉伯半乳聚糖β-1,4-半乳聚糖内切酶A、β-1,4-木聚糖内切酶A、果胶裂解酶B、α-葡萄糖苷酶、葡聚糖β-1,3-葡糖苷内切酶eglC、β-1,4-木聚糖内切酶C、β-1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶A、α-岩藻糖苷酶A、木葡聚糖特异性β-1,4-葡聚糖内切酶A、α-淀粉酶A型1/2、甘露聚糖β-1,4-甘露糖苷内切酶A、β-1,4-葡聚糖酶内切酶D、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶A、β-1,4-木糖苷外切酶、多聚半乳糖醛酸内切酶D、α-半乳糖苷酶D、枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、胞外菊粉酶、半乳聚糖α-1,4-半乳糖醛酸酶C、β-葡萄糖苷酶M、β-半乳糖苷酶B、多聚半乳糖醛酸外切酶x、α-半乳糖苷酶A、β-半乳糖苷酶A、多聚半乳糖醛酸内切酶E、β-1,3-葡聚糖糖基转移酶、多聚半乳糖醛酸内切酶A、多聚半乳糖醛酸外切酶C、果胶裂解酶D、α/β-葡萄糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶C、鼠李糖醛酸酶A、阿拉伯聚糖α-1,5-L-阿拉伯糖苷内切酶C、蛋白二硫键异构酶、α-半乳糖苷酶D、β-葡萄糖醛酸酶、酸性蛋白酶-2、果胶裂解酶2、β-1,4-木聚糖内切酶A、酸性磷酸酶、α-1,5-L-阿拉伯聚糖内切酶A、羧肽酶Y同源物A、β-1,4-葡聚糖内切酶B、非还原性聚酮合成酶、果胶裂解酶E、α-半乳糖苷酶C、α/β-葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶2、3-植酸酶A、糖苷酶crf1、果胶酯酶A、β-1,4-葡聚糖酶内切酶B、酸性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶F、β-葡萄糖苷酶E、吲哚-异戊烯基转移酶、β-1,4-木聚糖内切酶B。
除上述酶系外，本发明中的复合酶制剂代谢产物丰富，其中包括：阿魏酸、核黄素、低聚糖、氨基肽氮、免疫多糖、寡糖等等。
本公司运用现代固体发酵的工艺生产出的拥有天然酶系的新一代高酶活复合酶制剂，其所含的各类酶，是因培养基成分的诱导天然生成。在酶制剂领域，首次真正意义上的明确了以麸皮、玉米芯、豆粕粉等为诱导底物的黑曲霉固体发酵产物所含的酶类，为研究不同底物的诱导产酶机制、酶制剂在禽畜体内体外的应用机理、各酶类的协同作用、不同方向的针对性优化等，提出了基础模板和指导性参考。该复合酶对底物针对性更强，酶系组成全面、合理，可以发挥出各类酶之间的良好协同性。
效果验证：应用实施例1培养的酶制剂。
本实施例涉及本发明生产工艺得到的酶制剂对不同畜禽的饲喂效果和生产性能的验证。上述酶制剂的适用禽畜范围包括但不限于：鸡，鸭，猪，兔子等禽畜的饲喂。
1、固体发酵的酶制剂(即多酶系复合酶)对仔猪生产性能的影响
该实验以仔猪生产性能为指标，设计了不加该酶制剂的对照组和加酶制剂的试验组。具体试验参数及得到的数据见表1。
表1 酶制剂的添加对仔猪生产性能的影响
Figure BDA0002528244360000151
由表1数据所示，与未加酶制剂的对照组相比较，每吨基础日粮添加1000g酶制剂，经30d饲喂试验后，仔猪的生产性能有了提升。其中，单头仔猪的平均体重增长了1.5kg，料肉比由1.48降低至1.40。
2、固体发酵的天然酶制剂对肉鸡生产性能的影响
该实验以肉鸡生产性能为指标，设计了不加该复合酶制剂的对照组和多加酶系复合酶制剂的试验组。具体试验参数及得到的数据见表2。
表2 酶制剂的添加对肉鸡生产性能的影响
Figure BDA0002528244360000161
由表2数据所示，与未加酶制剂的对照组相比较，每吨基础日粮添加800g酶制剂，经饲喂试验后，肉鸡的生产性能有了提升。其中，单只肉鸡的平均体重增长了150.09g，料肉比由1.65降低至1.58，成活率提高了2％，欧指(EPI)增加了47.72。饲喂试验验证了本公司的酶制剂对肉鸡生产性能的促进作用，体现了增收的良好潜力。
3、固体发酵的天然酶制剂对蛋鸡生产性能的影响
该实验以蛋鸡生产性能为指标，设计了不加该复合酶制剂的对照组和多加酶系复合酶制剂的试验组。具体试验参数及得到的数据见表3。
表3 酶制剂的添加对蛋鸡生产性能的影响
Figure BDA0002528244360000171
由表3数据所示，与未加酶制剂的对照组相比较，每吨基础日粮添加800g酶制剂，经35d饲喂试验后，蛋鸡的生产性能有了提升。其中，蛋鸡的平均蛋重增长了0.27g，平均日采食量减少0.72g/天，产蛋率提高了1.4％。饲喂试验验证了本公司的酶制剂对蛋鸡生产性能的促进作用，体现了增收的良好潜力。
4、固体发酵的酶制剂对饲料原料溶胀度的影响
在饲料原料中加入等量市售的复合酶和酶制剂，在37℃条件下水浴30min。试验结果如图1所示。与市售复合酶组和对照组相比，酶制剂对饲料原料的溶胀度明显提高，体积变大，粒度变细。说明固体发酵的酶制剂将饲料原料的空间结构和化学键部分打开后，使饲料原料的结构变得松散。
5、固体发酵的天然酶制剂对母猪便秘的影响
在母猪日粮中添加2000g/t的酶制剂，显著改善母猪便秘情况。
6、固体发酵的天然酶制剂对霉菌毒素降解的效果
在饲料中添加800g/t酶制剂后，鸡的霉菌毒素中毒情况得到有效控制。如图3所示，解剖饲喂复合酶前后鸡的胃部，饲喂后的胃部黑变现象明显改善。天然的酶制剂中含有酯酶，能有效降解镰刀菌毒素(玉米赤霉烯酮、伏马毒素、呕吐毒素、T-2毒素)的酯键，从而降解镰刀菌毒素。
实施例2
一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，包括以下步骤：
4.一级斜面培养
将原始菌种黑曲霉(Asperijillus niger)BAK200308接种至改良察氏斜面培养基上，28℃～30℃培养5～7d，得到长满黑曲霉孢子的斜面。
5.二级种子制备
将步骤1中斜面上的孢子于无菌室中接种至摇瓶中的麸皮培养基上，28℃～32℃，培养5～6d，得到大量黑曲霉孢子。
所述麸皮培养基的摇瓶容积为250/500/1000mL。
所述的麸皮培养基按下述重量比例配制(％)：麸皮45～60％，氯化铵1.0～2.0％，含水量40～50％，pH自然。
所述的麸皮培养基的灭菌要求：121℃，60～70min。
6.固体培养基的接种培养
取步骤2中得到的孢子培养基按1％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，将固体发酵培养基混合均匀后，等量分装于底部有孔的浅盘中并铺平，静置发酵培养，曲房相对湿度保持在85％～95％，料温控制在30℃～45℃，发酵周期3～5天。
固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮40～50％，玉米芯30～40％，豆粕粉15～25％，轻质碳酸钙2～5％，初始水分55～65％，pH自然。
4.发酵产物的烘干
发酵周期结束后，将步骤3得到的发酵产物控温烘干，烘干温度50℃，烘干时间24～36h，至含水量5～10％停止。
5.物料微粉碎
将步骤4中得到的烘干物料进行微粉碎。粉碎后，粒径达到60～120目。按所需重量自动化装袋。
此方案下，该酶制剂的代表性酶系酶活如下表所示：
Figure BDA0002528244360000191
序列表
<110> 杭州保安康生物技术有限公司
<120> 以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂及其菌株和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 黑曲霉BAK200308(Aspergillus niger)
<400> 1
cctgcggaag gatcattacc gagtgcgggt cctttgggcc caacctccca tccgtgtcta 60
ttataccctg ttgcttcggc gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg cgcctttgcc 120
ccccgggccc gtgcccgccg gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc gtgcagtctg 180
agttgattga atgcaatcag ttaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ccggcatcga 240
tgaagaacgc agcgaaatgc gataactaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgag 300
tctttgaacg cacattgcgc cccctggtat tccggggggc atgcctgtcc gagcgtcatt 360
gctgccctca agcccggctt gtgtgttggg tcgccgtccc cctctccggg gggacgggcc 420
cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg tcacatgctc 480
tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt ttttccaggt tgacctcgga 540
tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaat 577

Claims (7)

1.一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，
所用菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200308，保藏号CGMCC No.19615；
培养得到以木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、糖化酶为主，阿魏酸酯酶、植酸酶、羧肽酶、磷酸酶、过氧化氢酶多种伴生酶为辅的富含天然复杂酶类的多酶系复合酶制剂。
2.根据权利要求1所述的一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，所述酶制剂的制备包括：斜面培养步骤、种子制备步骤和固体培养基接种培养步骤。
3.根据权利要求2所述的一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，
(1)斜面培养步骤为：
将黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200308接种至改良察氏斜面培养基上，28℃～30℃培养5～7d，得到长满黑曲霉孢子的斜面；
(2)种子制备步骤：
将上述步骤(1)中斜面上的孢子于无菌室中接种至摇瓶中的麸皮培养基上，28℃～32℃，培养6～7d，得到大量黑曲霉孢子；
所述麸皮培养基按下述重量比例配制(％)：麸皮50～60％，氯化铵0.5～1.5％，含水量40～50％，pH自然；
(3)固体培养基接种培养步骤
取上述步骤(2)中得到的孢子培养基按1％～15％的重量比接入固体发酵培养基中，静置发酵培养，曲房相对湿度保持在85％～95％，料温控制在30℃～45℃，发酵周期3～5天；
所述固体发酵培养基按下述比例配制：麸皮30～40％，玉米芯30～40％，豆粕粉25～35％，轻质碳酸钙2～5％，初始水分55～65％，pH自然。
4.根据权利要求2或3所述的一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，还包括发酵产物的烘干步骤和粉碎步骤；其中，烘干至含水量5～15％停止。
5.根据权利要求4所述的一种以木聚糖酶和酸性蛋白酶为主的酶制剂的制备，其特征在于，所述的固体发酵培养基的灭菌要求：121℃，50～70min。
6.一种黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉BAK200308，其保藏号为CGMCCNo.19615。
7.一种畜禽饲料，包括权利要求1所述的黑曲霉BAK200308的培养产物。
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