CN111607581B - 富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备及其菌株和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种富含β‑甘露聚糖酶的复合酶的制备及其制备和应用；培养的发酵产物含有β‑甘露聚糖酶、β‑葡聚糖酶、酸性蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶以及α‑半乳糖苷酶。黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉BAK200310，其保藏号为CGMCC No.19616。本发明发酵的复合酶经检测酶蛋白种类极其丰富，含有多种酶蛋白成分，几乎涵盖常规酶类中所有组分，不同酶类各司其职，同一酶类不同组分相互配合，共同发挥出更大的酶解作用。本发明的复合酶中β‑甘露聚糖酶酶系丰富，酶组分较全，且国标检测其酶活可达12170U/g。

Description

富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备及其菌株和应用
技术领域
本发明涉及复合酶领域，特别是指一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备 及其制备和应用。
背景技术
随着人民生活水平的日益提高，人们对畜禽产品的需求量逐年增大，带动 了养殖业和饲料业的迅猛发展。城市化建设和规模化养殖业的加快导致饲料资 源问题及畜牧养殖业的环保问题等日益突出。解决这类问题既要开发新的饲料 资源和充分利用现有资源，又要寻求提高养分利用率、减少环境污染问题的方 法。酶是一类具有生物催化活性的蛋白质，畜禽饲料以植物性原料为主，包括 玉米、小麦、豆粕、棉粕等，其中包含许多营养成分，除水分、矿物质、维生 素外，大多为机体难以吸收的大分子形式，例如抗消化的植物细胞壁。由纤维 素和果胶等组成的植物细胞壁化学结构复杂，是高度集成的结构。必须在消化道内经过酶的作用被水解为小分子营养物质，才能被动物吸收利用，而哺乳动 物体内缺乏或产生不足量的内源酶来消化这些成分。
应用物理或化学方法将生物体内产生的酶提取出来制成的产品即为酶制 剂。大量的试验结果表明，在日粮中添加饲用酶制剂是提高养分利用率应用较 为广泛和有效的技术之一。1975年，美国首次将酶制剂应用于配合饲料中，并 取得了显著效果，从此出现了商品饲用酶制剂，并日益受到世界养殖业的关注 和重视。20世纪90年代初，酶制剂开始在我国进行研究与应用，发展迅猛，产 品不断增加，质量不断提高，在短短十几年的时间里，就有了上百种酶制剂产 品，并逐步应用到猪、禽、水产及反刍动物等各个养殖领域。酶制剂作为一种 天然、绿色的饲料添加剂，日粮中添加饲用酶制剂不仅能消除饲料中抗营养因子，还能全面促进营养物质的消化和吸收，增进畜禽健康。饲用酶制剂作为饲 料添加剂的一种，得到饲料工业和养殖业的普遍认可。饲料中添加酶制剂可以 充分利用资源，增加各种非常规饲料资源的可利用性及现有常规饲料资源的可 利用率，提高饲料转化率；减少畜禽排泄物中的有机物、氮、磷等物质的含量， 从而大幅度减少对土壤和水体的污染。不仅如此，酶制剂在动物体内还发挥着 多种生物学功能，主要包括补充动物体内消化酶的不足；减少动物肠道内有害 微生物的数量，调节肠道菌群结构；降低动物肠道内食糜的黏稠度等。
酶制剂种类较多，按照酶制剂的类型来分，可分为单一酶和复合酶。单一 酶是指能够催化一种底物并具有指定来源的酶，例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、 甘露聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶和植酸酶等。复合酶是由一种或几种单一酶 制剂为主体，加上其他单一酶制剂混合而成，或者由一种或几种微生物发酵所 得。饲料由不同原料组成，其物理化学结构差异较大，由于酶具有专一性，要 获得酶解最佳效果，必须使用多酶系统。复合酶中存在多种酶类，各种酶起着 互相补充、相辅相成的作用，其效果往往优于单一酶制剂。在各种酶的共同作 用下，动物饲料中的一些抗营养因子被破坏，其抗营养作用消失，因而可以促 进动物生长，提高免疫力，增进健康。
合理添加复合酶制剂能够不同程度地提高动物生产性能的结论已得到国内 外研究者的证实。敖翔等研究发现在低营养水平饲粮中添加单一非淀粉多糖酶 提高了前期干物质的消化率，而添加复合非淀粉多糖酶则提高了前期总能和氮 的消化率。刘伟等选用饲用复合酶制剂(低温淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、β-甘露 聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶和植酸酶)对肉鸡生产 性能、血清生化指标和肠道形态及消化酶活性等方面进行了研究，结果发现饲 用复合酶制剂能促进肉鸡肠道发育，增强消化酶活性，提高饲料转化率，并达 到改善血清生化指标的效果。杨飞来等研究发现在玉米-豆粕-稻谷型日粮中添加 复合酶制剂可以提高育肥猪的生长性能和营养物质表观消化率。王向荣等在断奶仔猪日粮中添加复合酶制剂，发现其提高了仔猪的平均日增重和降低了料重 比，表明在典型玉米-豆粕型日粮基础上添加复合酶制剂产品能够提高仔猪的生 产性能。在反刍动物研究中，赵连胜等研究饲粮中添加不同剂量的复合酶制剂 (果胶酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶和中性蛋白酶)对奶 牛瘤胃发酵、营养物质表观消化率、血清生化指标及生产性能的影响，结果发 现饲粮中添加复合酶制剂有助于提高饲料转化率、瘤胃发酵和生产性能。
但是目前市场上使用的复合酶制剂大部分均由人为地进行几种单一酶制剂 配合而成，其效果往往较天然形成的复合酶系差。天然代谢产生的复合酶系种 类繁多，由于产自同一体系，其相互之间的协同程度较高，配合更完善，能够 发挥出更大的酶解功能，具有极大的应用潜力。
发明内容
本发明提出一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备及其制备和应用，解决 了现有技术中的酶制剂由于单一配制导致的复合酶系差的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备，其中，
所用菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200310，保藏号CGMCC No.19616；
培养的发酵产物含有β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、木聚糖酶、 果胶酶以及α-半乳糖苷酶。
在一些实施例中，所述复合酶的制备包括固体发酵步骤；
将菌悬液接种固体培养基中，培养基初始水分控制在50-60％；曲房相对湿 度保持在50％以上，料温控制在28℃-32℃，培养6-8d；
所述固体培养基按下述比例配制：麸皮60-70％、豆粕粉10％-20％、棕榈粕 粉20-30％、玉米粉1％-6％、氯化钙0.5％-1％、硫酸铵0.5％-1％、硫酸镁 0.05％-0.1％、磷酸氢二钾0.2％-0.3％、初始水分60％-65％。
在一些实施例中，所述固体培养基按下述比例配制：麸皮70-80％、玉米芯 粉20％-30％、硫酸铵1-2％、硫酸镁0.05％-0.1％、碳酸钙0.5％-1％、磷酸氢二钾 0.2％-0.3％，初始水分60％-65％；
或，
麸皮60-70％、豆粕粉10％-20％、玉米芯粉5％-10％、碳酸钙1％-2％、氯化 铵1-2％、硫酸镁0.05％-0.1％、硫酸锰0.02％-0.03％、磷酸氢二钾0.2％-0.3％， 初始水分60％-65％。
在一些实施例中，所述菌悬液的制备如下：
(1)菌种活化
将黑曲霉BAK200310接种至经灭菌后的斜面上培养，28-32℃培养6-10d， 其培养基配方为：葡萄糖1-2％、土豆汁20-30％、琼脂粉1.2-1.8％；
(2)菌种扩培
将步骤(1)中得到的斜面种子接种至二级三角瓶固体培养基中培养；将斜 面孢子转移至150-200mL无菌水中，震荡混匀，使孢子充分悬浮于无菌水中； 再按2-3mL/瓶固体种子量接种至二级三角瓶固体培养基上发酵；28-32℃培养 4-6d；培养基配方为：麸皮100％、硫酸铵5％-10％，初始水分45％-55％，每瓶 培养基装量15-20g；用80-100mL无菌水/瓶三角瓶种子量将二级三角瓶固体培 养基种子制成菌悬液。
本发明还提供一种黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉BAK200310， 其保藏号为CGMCC No.19616。
本发明还提供一种畜禽饲料，包括上述的黑曲霉BAK200310的发酵产物。
本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明发酵的复合酶经检测酶蛋白种类极其丰富，含有多种酶蛋白成 分，几乎涵盖常规酶类中所有组分，不同酶类各司其职，同一酶类不同组分相 互配合，共同发挥出更大的酶解作用。
(2)本发明提供的复合酶不仅酶蛋白种类丰富，而且富含β-甘露聚糖酶。 由酶蛋白检测结果可知，本发明的复合酶中β-甘露聚糖酶酶系丰富，酶组分较 全，且国标检测其酶活可达12170U/g。
(3)本发明提供的复合酶制剂含有较为丰富的代谢产物及酶解产物，如阿 魏酸、功能性低聚糖、低聚木糖等产物。低聚糖、低聚木糖等可以被动物肠道 内的有益菌吸收利用，促进益生菌的增殖，抑制有害菌的生长，改善肠道菌群 组成，增进消化系统功能。
(4)本发明提供的固体发酵工艺，方法简单，操作便利，且大部分使用麸 皮、棕榈粕等为发酵原料，大大节约了饲料成本。发酵原料利用率高，废弃物 少，较环保。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实 施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为发酵产物LC-MS图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描 述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
生物保藏：
黑曲霉(Aspergillus niger)BAK200310，于2020年4月8号保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址为北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国微生物研究所，邮政编码100101)，保藏编号：CGMCC No.19616。
ITS鉴定：
该菌株ITSrDNA的区段序列(见序列表)比对结果：本发明使用的菌株与黑曲 霉属基因序列相似度最高。因此将其命名为黑曲霉BAK200310。
本发明中提供的黑曲霉BAK200310，是经过严格驯化培育得到的高产复合 酶菌株。驯化前的菌株发酵最高酶活为3798U/g。
实施例1
一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备，包括如下步骤：
1菌种活化
将公司保存的黑曲霉BAK200310菌株接种至经灭菌后的一级试管斜面上培 养，28-32℃培养6-10d，其培养基配方为：葡萄糖1-2％、土豆汁20-30％、琼 脂粉1.2-1.8％。
2菌种扩培
将步骤1中得到的一级试管斜面种子接种至二级三角瓶固体培养基中培养。 在超净工作台中将斜面孢子转移至150-200mL无菌水中，震荡混匀，使孢子充 分悬浮于无菌水中。再按2-3mL/瓶固体种子量接种至二级三角瓶固体培养基上 发酵。28-32℃培养4-6d。培养基配方为：麸皮100％、硫酸铵5％-10％，初始 水分45％-55％，每瓶培养基装量15-20g。
3固体发酵工艺
用80-100mL无菌水/瓶三角瓶种子量将步骤2中的二级三角瓶固体培养基 种子制成菌悬液，按每吨固体料10-15瓶二级三角瓶固体培养基种子量接种固体 培养基中，培养基初始水分控制在50-60％。曲房相对湿度保持在50％以上，料 温控制在28℃-32℃，培养6-8d。
固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮60-70％、豆粕粉10％-20％、棕榈 粕粉20-30％、玉米粉1％-6％、氯化钙0.5％-1％、硫酸铵0.5％-1％、硫酸镁 0.05％-0.1％、磷酸氢二钾0.2％-0.3％、初始水分60％-65％。
实施例2
实施例1中的固体培养基，可以选用下述比例配制：
麸皮70-80％、玉米芯粉20％-30％、硫酸铵1-2％、硫酸镁0.05％-0.1％、碳 酸钙0.5％-1％、磷酸氢二钾0.2％-0.3％，初始水分60％-65％；
或，
麸皮60-70％、豆粕粉10％-20％、玉米芯粉5％-10％、碳酸钙1％-2％、氯化 铵1-2％、硫酸镁0.05％-0.1％、硫酸锰0.02％-0.03％、磷酸氢二钾0.2％-0.3％， 初始水分60％-65％。
菌种活化也可以替换为如下培养基：
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物1％、葡萄糖4％、琼脂粉 1.2-1.8％，pH 5.4-5.8。
其余条件不变，均可实现本发明目的。
实施例3
复合酶中酶蛋白检测分析结果(针对实施例1发酵产物)
将固体发酵结束后的发酵产物烘干粉碎制成复合酶样品，加入8M尿素溶 液提取复合酶样品中蛋白组分，利用LC-MS对组分进行蛋白质鉴定，先对蛋白 进行定量，通过还原烷基化打开蛋白三维结构，酶解后抽提出肽段，运用质谱 技术得到这些肽段的质谱图，最后运用蛋白质鉴定软件，鉴定出样品中的蛋白 质。将所得结果在蛋白质库(黑曲霉库)中进行搜索比对，将比对结果进一步 进行分析。
经检测分析结果可知，本公司提供的复合酶样品中酶蛋白种类较多(近50 种)，酶系丰富，是一个复合酶系统。其中甘露聚糖酶种类多达10种、木聚糖 酶类9种以及其它各酶类较多种。各大酶类中不同酶组分构成齐全，协同发挥 作用。检测结果LC-MS图谱及部分酶蛋白列举如下：
内切-β-1,4-甘露聚糖酶A、多聚半乳糖醛酸酶E、β-半乳糖苷酶A、α-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶、葡萄糖激酶、β-甘露糖苷酶B、D-木酮糖还原酶A、α-半乳糖 苷酶B、α-半乳糖苷酶D、甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶、葡聚糖内切1,3-β-葡糖苷酶 eglC、果胶酯酶A、β-甘露糖苷酶A、木糖醛酸内切酶A、内聚半乳糖醛酸酶I、 内聚半乳糖醛酸酶A、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶xlnD、NAD(P)H依赖性D- 木糖还原酶xyl1、β-葡萄糖醛酸酶、过氧化氢酶/过氧化物酶、阿魏酸酯酶B、α- 木糖苷酶A、1,4-β-木聚糖内切酶C、葡糖淀粉酶、酸性α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶A、β-葡萄糖苷酶A、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶A、羧 肽酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶B、内切葡聚糖酶B、β-葡萄糖苷酶I、β- 葡萄糖苷酶A、β-葡萄糖苷酶M、天冬氨酸蛋白酶pepA、羧肽酶Y同源物A、 氨基酰脯氨酸氨基肽酶、枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶pepC、亮氨酸氨基肽 酶2、胞外菊粉酶、过氧化氢酶A等。
复合酶中主要酶类酶活检测分析结果
依据国标酶制剂检测方法，对经本公司提供的固体发酵工艺进行发酵得到 的复合酶中主要酶类酶活进行检测，由检测结果可知，本公司提供的复合酶制 剂产品中含有较高酶活的β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶以及木聚糖 酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶等。其中甘露聚糖酶酶活最高达12170U/g、β-葡聚 糖酶6252U/g、酸性蛋白酶8803U/g、木聚糖酶1504U/g、果胶酶831U/g、α- 半乳糖苷酶442U/g，结果如表1。
表1复合酶中主要酶类酶活汇总表
Figure BDA0002528296510000091
复合酶应用效果评估实例
(一)本发明提供的复合酶对肉鸡生产性能的影响
试验随机选取健康、体重相近6000只1日龄的肉仔鸡公雏，随机分配对照 组与试验组，各3000只，两组试验同时进行。试验鸡采用笼养方式，24h光照， 期间自由采食及饮水，第1周试验温度控制在35℃，之后每周温度下降2℃， 最终试验温度控制在26℃左右。严格按照肉仔鸡常规免疫程序和饲养管理进行 试验，每日观察鸡群状况，并记录数据。
结果发现，在日粮中添加本发明提供的复合酶(试验组)相比对照组，对 肉鸡生产性能有一定的改善作用，提高了肉鸡生长性能，降低料肉比，且肉仔 鸡存活率相对较高。
表2复合酶对肉鸡生产性能的影响
Figure BDA0002528296510000101
注：数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下表同。
(二)本发明提供的复合酶对断奶仔猪生产性能及免疫功能的影响
在江苏某大型养殖公司进行试验，试验随机选取健康、体重相近的28日龄 断奶仔猪200只，随机分配对照组与试验组，各100只，两组试验同时进行。 试验周期为30d。饲养期间仔猪自由采食及饮水，按照猪场常规免疫程序及饲 养管理进行试验，每日观察仔猪生长状况，并记录数据，于第30d随机从对照 组及试验组中选取6头仔猪，进行前腔静脉取血10mL，分离血清，利用比色法 测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA) 指标含量。
结果发现，在日粮中添加200g/t本发明提供的复合酶(试验组)相比对照 组，可以增加断奶仔猪日增重及料重比，有效预防断奶仔猪的腹泻，提高生长 性能。与对照组相比，显著提高了断奶仔猪的免疫球蛋白含量，增强其免疫功 能。
表3复合酶对断奶仔猪生产性能的影响
Figure BDA0002528296510000111
表4复合酶对断奶仔猪免疫功能的影响
Figure BDA0002528296510000112
序列表
<110> 杭州保安康生物技术有限公司
<120> 富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备及其菌株和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 568
<212> DNA
<213> 黑曲霉BAK200310(Aspergillus niger)
<400> 1
tatgatatgc ttaagttcag cgggtatccc tacctgatcc gaggtcaacc tggaaagaat 60
ggttggaaaa cgtcggcagg cgccggccaa tcctacagag catgtgacaa agccccatac 120
gctcgaggat cggacgcggt gccgccgctg cctttcgggc ccgtcccccc ggagaggggg 180
acggcgaccc aacacacaag ccgggcttga gggcagcaat gacgctcgga caggcatgcc 240
ccccggaata ccagggggcg caatgtgcgt tcaaagactc cactgaattc tgcaattcac 300
attagttatc gcatttcgct gcgttcttca tcgatgccgg aaccaagaga tccattgttg 360
aaagttttaa ctgattgcat tcaatcaact cagactgcac gctttcagac agtgttcgtg 420
ttggggtctc cggcgggcac gggcccgggg ggcagaggcg cccccccggc ggccgacaag 480
cggcgggccc gccgaagcaa cagggtacaa tagacacgga tgggaggttg ggcccaaagg 540
acccgcactc ggtaatgatc cttccgca 568

Claims (6)

1.一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备方法，其特征在于，
所用菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）BAK200310，保藏号CGMCC No.19616；
培养黑曲霉（Aspergillus niger）BAK200310的发酵产物含有β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶以及α-半乳糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备方法，其特征在于，所述复合酶的制备方法包括固体发酵步骤；
将菌悬液接种固体培养基中，培养基初始水分控制在50-60%；曲房相对湿度保持在50%以上，料温控制在28℃-32℃，培养6-8 d；
所述固体培养基按下述比例配制：麸皮60-70%、豆粕粉10%-20%、棕榈粕粉20-30%、玉米粉1%-6%、氯化钙0.5%-1%、硫酸铵0.5%-1%、硫酸镁0.05%-0.1%、磷酸氢二钾0.2%-0.3%、初始水分60%-65%。
3.根据权利要求2所述的一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备方法，其特征在于，所述固体培养基替换为按下述比例配制：麸皮70-80%、玉米芯粉20%-30%、硫酸铵1-2%、硫酸镁0.05%-0.1%、碳酸钙0.5%-1%、磷酸氢二钾0.2%-0.3%，初始水分60%-65%；
或，
麸皮60-70%、豆粕粉10%-20%、玉米芯粉5%-10%、碳酸钙1%-2%、氯化铵1-2%、硫酸镁0.05%-0.1%、硫酸锰0.02%-0.03%、磷酸氢二钾0.2%-0.3%，初始水分60%-65%。
4.根据权利要求2所述的一种富含β-甘露聚糖酶的复合酶的制备方法，其特征在于，所述菌悬液的制备如下：
（1）菌种活化
将黑曲霉BAK200310接种至经灭菌后的斜面上培养，28-32℃培养6-10 d，其培养基配方为：葡萄糖1-2%、土豆汁20-30%、琼脂粉1.2-1.8%；
（2）菌种扩培
将步骤（1）中得到的斜面种子接种至二级三角瓶固体培养基中培养；将斜面孢子转移至150-200 mL无菌水中，震荡混匀，使孢子充分悬浮于无菌水中；再按2-3 mL/瓶固体种子量接种至二级三角瓶固体培养基上发酵；28-32℃培养4-6 d；培养基配方为：麸皮100%、硫酸铵5%-10%，初始水分45%-55%，每瓶培养基装量15-20 g；用80-100 mL无菌水/瓶三角瓶种子量将二级三角瓶固体培养基种子制成菌悬液。
5.一种黑曲霉（Aspergillus niger），命名为黑曲霉BAK200310，其保藏号为CGMCCNo.19616。
6.一种畜禽饲料，包括权利要求1-4所述的黑曲霉BAK200310的发酵产物。
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