KR101532471B1

KR101532471B1 - 바이오 리액션을 이용한 옥수수를 원료로 하는 사료곡물의 가공방법

Info

Publication number: KR101532471B1
Application number: KR1020120120815A
Authority: KR
Inventors: 이찬호; 강정선; 조원탁; 조경진; 유정진
Original assignee: (주)진바이오텍
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2015-07-01
Also published as: KR20140056582A

Abstract

옥수수를 원료사료로 하여 곡물 사료를 가공하는 방법으로서, (a) 원료사료로서 옥수수를 제공하는 단계; (b) 옥수수를 침지하는 단계; (c) 증자하는 단계; (d) 균주를 접종하여 발효하는 단계; (e) 효소처리를 행하는 단계; 및 (f) 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물 사료의 가공방법이 개시된다. 본 발명은 옥수수를 사료원료로 하는 단미사료를 제조함에 있어서 최적의 효소처리 및 발효처리 조건을 밝힌 것으로서, 호화도 및 유리당의 함량이 증가되고, 가축에서의 소화율 및 성장을 개선하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료에 관한 것이며, 이를 배합사료에 혼합하여 급이할 수 있다.

Description

바이오 리액션을 이용한 옥수수를 원료로 하는 사료곡물의 가공방법{THE MANUFACTURING METHOD FOR CORN-BASED FEEDSTUFF USING BIO-REACTION}

본 발명은 옥수수를 원료로 하는 곡물사료의 가공방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 옥수수를 원료로 하는 곡물사료의 가공방법으로서, 증자공정, 발효공정 및 효소공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 곡물사료의 가공방법에 관한 것이다. 더 나아가서는, 옥수수를 원료로 하는 곡물사료의 가공방법으로서, 최적의 발효조건 및 효소처리조건을 갖는 것을 특징으로 한 곡물사료의 가공방법에 관한 것이다. 또한, 이와 같은 가공방법에 의하여 제조된 옥수수 곡물사료로서 호화도 및 유리당의 함량이 증가되고, 가축에서의 소화율 및 성장을 개선하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료에 관한 것이다.

최근 곡물의 재배환경 및 기후 온난화에 의한 식량 수급 불안정 등으로 인한 곡물가의 상승으로 과거에 비해 생산성의 개선을 위한 보다 효율적 기능을 갖는 원료의 요구가 늘어나고 있다. 국내에서 생산되는 원료 중 에너지 공급원으로 사용되고 있는 곡류의 경우 수입의존도가 80%이상에 달하고 있으며, 특히 양돈 사료에 있어 가장 이상적인 에너지 원료라 할 수 있는 옥수수, 소맥, 귀리는 배합 사료 원료의 50~70%를 차지하는 곡물로서 원료의 이용성을 높일 수 있는 사료의 가공방법이 필요하다.

한편, 이 중, 옥수수는 주요한 에너지원으로 오래 전부터 널리 사용되어 왔다. 옥수수는 에너지원으로 풍부한 탄수화물 영양소를 함유하고 있어서 다른 식물성 사료원료에 비하여 그 영양학적 가치가 특히 높은 것으로 알려져 있으며 배합사료의 주요 원료로 사용되고 있다. 그러나, 우리나라에서는 이러한 원료의 대부분을 수입하고 있는 실정으로 최근 원료값의 증가로 인하여 양돈산업에 부담을 주고 있으며, 이러한 위기를 극복하기 위한 하나의 방안으로 옥수수 가공공정의 개선을 통하여 가축의 성장률과 사료의 이용성을 증가시켜 사료비용을 감소시키려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

한편, 사료를 제조하는 종래 기술과 관련하여서는, 사료원료에 특정 미생물을 접종해서 발효시키는 방법 또는 사료원료에 효소를 혼합하여 효소처리를 행하거나 특정 효소가 추가된 사료를 제조하는 방법등이 알려져 있었으나, 이들은 특정한 사료원료에 초점을 맞추었다고 하기보다는, 각종 곡물원료의 혼합물 또는 식품 찌꺼기등을 사료원료로 하는 것이었다.

그런데, 원료사료의 가공방법과 관련하여서는, 각 원료사료에 존재하는 특성이 모두 다르기 때문에, 이를 정확히 파악하여 그에 적합한 가공방법을 개발하는 것이 중요한데, 위에서 설명한 바와 같이, 종래 기술은 원료사료의 특성을 고려한 가공방법이라고 하기 보다는, 구체적인 원료사료를 특정하지 아니한 채, 다양한 종류의 원료들을 혼합한 상태에서 발효 또는 효소처리를 행하고 있었고, 따라서, 특정 원료사료, 보다 구체적으로는, 옥수수를 원료사료로 하여 곡물단미사료를 제조할 때에 있어서의 최적의 가공조건을 밝히는 문헌은 보고된 바 없다.

한국공개특허공보 제10-2010-0126849호 일본공개특허공보 특개평 08-256699호 일본공개특허공보 특개2005-130820호 일본공개특허공보 특개평11-514240호 일본공개특허공보 특개평06-70693호

이에, 본 발명에서는, 옥수수를 사료원료로 하는 곡물사료의 가공방법으로서, 사료원료의 특성을 반영하여 이에 최적화된 곡물사료의 가공방법을 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 한다. 세부적으로는, 옥수수에 포함되어 있는 난소화성 탄수화물을 분해할 수 있는 효과적인 수단 및 조건이 확립된 곡물사료의 가공방법이 제공되며; 효소처리공정과 고체발효공정을 활용하여 최적의 가공조건을 갖는 곡물사료의 가공방법이 제공되고; 대량생산 공정에 적합한 곡물사료의 가공방법이 제공된다.

나아가, 상기 방법에 의하여 제조된 곡물사료로서 원료사료의 영양소의 구성 및 생리적 기능물질을 최적화되어 포함된 것을 특징으로 하는 곡물사료를 제공하는 것을 또 다른 과제로 한다.

이와 같은 과제를 해결하기 위해서, 본 발명에서는 하기와 같은 해결 수단을 제공한다.

즉, 본 발명에서는, 옥수수를 원료사료로 하여 곡물 사료를 가공하는 방법으로서,

(a) 원료사료로서 옥수수를 제공하는 단계;

(b) 옥수수를 침지하는 단계;

(c) 증자하는 단계;

(d) 균주를 접종하여 발효하는 단계;

(e) 효소처리를 행하는 단계; 및

(f) 건조하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물 사료의 가공방법을 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 있어서, (a) 옥수수를 제공하는 단계는 옥수수의 입도를 1mm~4mm로 분쇄하여 제공하는 것을 특징을 하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 있어서, (c) 옥수수를 증자하는 단계는 80~150℃에서 20~60분간 증자하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료의 가공방법을 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 있어서, (d) 발효하는 단계는, Bacilluse subtilis 1-6CX, B. subtilis 1-12CX, B. subtilis 2-19CX, B. subtilis P11, Aspergillus oryzae GB-641, A. niger GB-124 및 A. niger GB-X2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료의 가공방법을 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 있어서, (d) 발효하는 단계는, 20~40℃에서 24~48시간 발효하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료의 가공방법을 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 있어서, (e) 효소처리를 행하는 단계는 Arabanase, Cellulase, Beta-glucanase, Hemicellulase, Xylanase, Endo-glucanase, Alpha-amylase 및 glucoamylase로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료의 가공방법을 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 의해서 제조한 옥수수 곡물사료로서, 유리당의 함량이 25.4mg/g 이상인 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료가 제공된다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 의해서 제조한 옥수수 곡물사료로서, 상기 옥수수 곡물사료는 알칼린 포스파타아제, 크리스틴아릴아미다아제, 트립신, 산성 포스파타아제, 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제, α-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, N-아세틸-β-글루코사민다아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료를 제공한다.

또한, 상기 옥수수 곡물사료의 가공방법에 의해서 제조한 옥수수 곡물사료로서, 상기 옥수수 곡물사료는 Bacilluse subtilis 1-6CX, B. subtilis 1-12CX, B. subtilis 2-19CX, B. subtilis P11, Aspergillus oryzae GB-641, A. niger GB-124 및 A. niger GB-X2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주가 원료표면에 존재하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료를 제공한다.

본 발명에 의하여, 가축의 에너지 이용성 증대를 위한 친환경 사료자원 개발을 위해 옥수수를 사료원료로 하는 고체발효 공정이 개시된다. 옥수수의 난분해성 다당류의 분해정도를 알 수 있는 간접지표로서 고체발효시 유리당을 최대한 생성할 수 있는 균주들이 선별되어 최적의 발효 조건이 확립된다. 본 발명의 가공방법으로 가공된 옥수수 곡물사료는 가공전의 사료원료에 비해 호화도 및 유리당의 함량이 증가하였으며 유용 미생물균수와 효소활성이 관찰 되어 생리적 기능이 개선된 원료로 전환되고, 가축의 이용성이 증대된 사료 자원으로 이용 될 수 있다. 또한 본 발명에 의한 옥수수 곡물사료는 원료의 표면에 존재하는 GRAS 균주들이 높은 개체수로 존재하기 때문에 probiotics로서의 기능도 기대할 수 있다. 또한, 배합사료에 있어서, 본 발명에 의한 옥수수 곡물사료로 옥수수를 대체하는 경우, 가수분해된 탄수화물, 단백질 등의 영양소를 가장 효율적으로 흡수할 수 있는 기회를 제공함과 동시에 발효과정에서 생성된 대사물질의 공급을 통해 돼지의 소화생리적 활성을 원활하게 함으로써 궁극적으로 성장을 개선하는 효과를 가져온다. 또한, 본 발명의 옥수수 곡물사료는 영양소의 소화율을 개선해주고, 장내 미생물 서식환경을 정상적으로 유지함으로써 이상 대사를 유도하지 않고 정상적인 균총을 유지함으로써 원활한 대사 과정을 유도할 수 있다. 또한, 배합사료에 있어서, 본 발명의 옥수수 곡물사료로 옥수수 첨가량의 일부 또는 전부를 대체하는 경우, 생산성이 향상되므로 대체가 가능하며, 이에 의하여 이유자돈 및 육성돈의 생산성이 향상되는 효과가 있다.

도 1은 침지시간에 따른 옥수수 수분함량의 변화를 나타낸다.
도 2는 증자온도에 따른 호화도 변화를 나타낸다.
도 3은 침지온도에 따른 원료옥수수의 수분함량의 변화를 나타낸다.
도 4는 옥수수의 최적 발표를 위한 균주선발을 나타낸다.
도 5는 초기 수분함량에 다른 B. subtilis 2-19CX 균주의 옥수수 발효특성변화를 나타낸다.
도 6은 B.subtilis 2-19CX 균주의 초기 접종 균수에 따른 옥수수의 발효특성을 나타낸다.
도 7은 옥수수의 최적발효를 위한 균주선발을 나타낸다.
도 8은 초기 수분함량에 따른 A. niger GB-124 균주의 옥수수 발효특성변화를 나타낸다.
도 9는 A. niger GB-124 균주의 초기 접종균수에 따른 옥수수의 발효특성을 나타낸다.
도 10은 발효시간에 따른 옥수수 생산공정중의 변화를 나타낸다.
도 11은 옥수수 원료와, 발효처리된 옥수수와 효소처리된 옥수의 전자현미경 사진이다.
도 12는 옥수수 원료와, 침지처리된 옥수수, 효소처리된 옥수수 및 효소처리 후 증자저리한 옥수수의 전자현미경 사진이다.
도 13은 옥수수 원료와, 발효처리된 옥수수와 효소처리된 옥수의 전자현미경 사진이다.
도 14는 옥수수에 대한 최적의 가공조건을 도시한 나타낸 도이다.
도 15는 옥수수의 대량 생산 공정을 나타낸 도이다.
도 16은 옥수수의 대량 가공생산 공정중의 변화를 나타낸 도이다.
도 17은 가공후 옥수수의 전자현미경 사진이다.

본 발명은 옥수수를 사료원료로 한 곡물사료의 가공방법에 관한 것이다. 옥수수는 양돈에 있어서 사료원료로 널리 사용되고 있는 곡물이지만, 펜토산, 셀룰로오스, 펙틴등의 비전분성 다당류(Non Starch Polysaccharide)가 포함되어 있고, 이들 비전분성 다당류는 돼지 체내에서 거의 소화되지 않는 특성을 보인다. 또한, 전분, 단백질 및 지방의 소화율을 저하시키고, 증체량 감소 및 건강상태 악화등의 영향을 줄 수 있으므로, 항영양인자로서 작용하며, 소화기내의 점성을 증가시킬 수 있고, 이로 인하여 가축의 소화기관에서 생산된 효소들의 작용을 저해하고 영향소의 흡수를 감소시킨다. 따라서, 상기 NSP를 분해할 수 있는 단일 효소제 또는 복합제의 사용이 제안되어 오기는 왔지만, NSP는 다양한 사료원료, 즉, 옥수수, 귀리, 소맥, 대두박등의 식물성 사료원료에 따라서 그 종류와 함량이 각기 상이하므로, 특정한 원료사료에 따라서 보다 세밀하게 조절된 가공방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다. 이에, 본 발명자들은, 옥수수에 함유되어 있는 NSP의 종류 및 그 함량을 비롯하여 호화도 및 유리당의 함량등을 규명한 후, 이에 적합한 최적의 가공방법을 개발함으로서, 사료원료에 물리적, 화학적, 기능적 변화가 발생한다는 지견을 얻어 본 발명에 이르게 되었다.

즉, 본 발명자들은, 사료원료로 사용되는 때의 옥수수의 각종 특성을 규명한 후, 옥수수를 사료원료로 하여 곡물사료로 가공할 때에 미치는 여러 가지 요소들, 예를 들면, 입자도, 가수량, 침지시간 및 증자조건을 비롯하여, 최적의 효소처리공정, 최적의 발효처리공정을 개발함으로서, 호화도 및 유리당(released glucose)의 함량의 변화 및 유용 미생물 증가 및 효소활성의 보유등에서 뛰어난 곡물사료를 개시한다. 즉, 본 발명은, 다양한 사료원료들을 혼합하거나 또는 식품찌꺼기등을 대상으로 하여 범용적인 효소처리 또는 발효처리를 행하는 일반적인 사료의 제조방법이 아닌, 옥수수라는 특정의 사료원료를 대상으로 한 특정한 가공방법임에 유의하여야 한다.

본 발명의 가공방법은 옥수수를 원료사료로 하여 곡물 사료를 가공하는 방법으로서, (a) 원료사료로서 옥수수를 제공하는 단계; (b) 옥수수를 침지하는 단계; (c) 증자하는 단계; (d) 옥수수 발효에 적합한 균주를 접종하여 발효하는 단계; (e) 효소처리를 행하는 단계; 및 (f) 건조하는 단계를 포함한다. 이하, 각각의 단계에 대해서 설명한다.

원료사료로서 옥수수를 제공하는 단계에 대해서 설명한다.

본 발명에서는, 옥수수를 원료사료로 한 곡물사료의 가공방법을 세밀하게 조정하기 위해서, 옥수수의 일반성분, 생리적 항영양인자(Non starch polysaccharide, NSP), 총에너지(Gross energy, GE), 아미노산을 분석하였다. 특히 사료영양소의 이용률을 저해하는 세포막 구성을 성분별로 집중 분석함으로서 가축의 이용성이 높은 사료자원 가공기술 개발을 위한 기본 자료로 활용하고 사료자원내의 NSP 분석을 위한 재현성이 우수한 분석방법을 정립하였다. 또한, 옥수수 이외에도, 국내 배합사료에 주로 사용되는 원료로 소맥, 소맥피, 대두박, 귀리에 대해서도 분석을 행하였는데, 이는 각 사료원료에 따라 가공조건이 달라져야 함을 밝히기 위한 것이다. 그 결과는 후술하는 실시예 1의 표 1 및 표2에 나타내었는데, 이에 의하면, 곡물사료의 종류에 따라서, 존재하는 NSP의 종류 및 그 함량이 각각 다르며 또한 총 에너지도 각기 상이함을 알 수 있다. 따라서, 단일 사료원료로 제조하는 단미사료의 경우, 원료사료의 종류에 따라서 그 특성을 반영한 최적의 가공조건이 필요하게 됨을 이해할 수 있다. 본 발명은, 이와 같은 지견에 따라서, 옥수수를 사료원료로 할 때의 최적의 가공조건을 밝힌 것에 유의할 필요가 있다.

한편, 옥수수를 사료원료로 제공할 때에는, 옥수수를 분쇄하여 제공하는 것도 가능하다. 즉, 옥수수의 수분함량을 조절하는 침지공정 및 증자공정(열처리공정)에 의해서 옥수수의 호화도가 증가하는데, 옥수수 원료를 분쇄하여 제공하는 경우, 호화도가 보다 증가할 수 있다. 즉, 옥수수를 제공함에 있어서는, 이를 통옥수수로 제공할 수 있으며, 또는, 이를 분쇄하여 제공할 수 있다. 분쇄하는 경우, 옥수수의 입자의 크기를 1mm 내지 4mm로 조절하여 제공할 수 있다.

다음으로 침지공정 및 증자공정에 대해서 설명한다.

침지공정은 사료원료로 제공된 옥수수에 실온에서 물을 가하여 옥수수의 호화도를 증가시키는 공정이며, 증자공정은 침지공정 후 일정시간 열을 가하는 공정이다. 본 발명에서는, 침지공정과 증자공정을 동시에 채택하고 있으며, 실제의 대량생산공정에 있어서 상업적으로 이용가능한 최적의 조건을 제공한다. 침지공정에서의 물의 양 및 침지시간에 따라서 옥수수의 호화도가 변화하게 되는데, 이와 같은 침지시간이 길어질수록 호화도는 증가하지만 침지시간이 너무 길어지는 경우 공정이 지연되는 단점이 있다는 점을 고려하여 최적의 침지조건을 밝혀내었다. 또한, 침지공정은 주로 실온에서 행해지지만, 그 온도를 상승시키는 경우 침지시간을 단축할 수 있다. 도 1은 침지시간에 따른 옥수수 수분함량의 변화를 나타낸다. 이에 의하면, 옥수수의 수분함량은 침지 1시간 후 27%의 수준에서 24시간 후 40.4%까지 증가함을 알 수 있었다. 또한, 후술하는 실시예 2에 의할 때, 옥수수의 호화도는 침지 6시간 동안 약 90% 가까이 증가함을 알 수 있었다. 그러나, 실제 공정에 있어서 이와 같이 장시간 동안 침지공정을 행하기는 어려우므로, 침지공정에 증자공정을 추가함으로서, 본 공정에 있어서의 호화도 증가의 목표를 약 80%로 하여 보다 세밀한 가공조건을 탐색한 결과, 침지시간은 약 20분 시간 내지 4시간, 침지온도는 실온 내지 약 60℃, 증자시간은 약 30분 내지 60분 및 증자온도는 약 80℃ 내지 150℃로 하는 것이 바람직하다.

다음으로 발효공정에 대해서 설명한다.

사료원료의 발효를 위해 사용된 균주들은 xylanase, cellulase 활성이 우수하며 amylase와 protease를 발현하는 균주들로 Bacilluse subtilis 1-6CX[기탁번호 : KCCM 11091P ], B. subtilis 1-12CX[기탁번호 KCCM 11090P ], B. subtilis 2-19CX[기탁번호 KCCM 11089P ], B. subtilis P11[기탁번호 ], Aspergillus oryzae GB-641[기탁번호 KCCM 11190P ], A. niger GB-124[기탁번호 KCCM 11189P], A. niger GB-X2[기탁번호 KCCM 11127P]로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주일 수 있다. 이들 균주는 부숙된 호두과육, 과수원 토양, 낙엽토, 식당가 폐수, 염소 분변등에서 채취한 3000여개의 균주중 균주의 효소활성에 대한 기준으로 기질의 분해도에 기초하여 평가하여 최종적으로 선발한 것이다. 발효공정은 사료원료에 대한 침지공정 및 증자공정이 완료된 후, 35℃이하로 냉각시킨 후, 선발된 균주를 접종 후 초기 균수가 1.0X 10³~1.2×10⁶ cfu/g이 되도록 접종한다. 발효시간을 24~48시간으로 설정하고 배양온도 20~40℃, 습도 50~80%의 조건으로 원료 두께를 1~1.5cm가 되게 하여 호기발효를 진행할 수 있다. 사료원료로서의 가치를 증가시키기 위해서는 우선적으로 난소화성 물질인 NSP의 함량이 감소되어야 하는데 이를 위해서는 선별한 균주의 NSP를 분해하는 효소의 발현을 최대한 유도하여야 한다. 따라서 발효 공정 후의 NSP 분해 지수로서 유리된 당의 함량을 기준으로 위 발효조건을 확립한 것이다.

한편, 원료의 호화정도에 따라서도 가축에 급이 시 소화 및 영양소 이용성에 영향을 미치므로 증자 후 발효공정 중 원료의 수분함량에 따라 발효 과정 중 호화도 변화도 참작하여 위 발효조건을 확립하였다. 따라서 옥수수 발효공정 확립을 위해서는 초기 수분함량 역시 매우 중요하며, 이와 같은 초기 수분함량은 발효조건 뿐 아니라 곡류의 이용성의 지표가 되는 호화도에도 영향을 주는 요소로서 발효 및 건조공정에 따른 영향을 최소화 할 수 있는 최적 수분함량을 추가로 찾아야 한다. 이를 위해 발효 배지인 옥수수의 초기 수분함량을 30~70%로 달리하여 수분함량에 따른 호화도, 유리 당, xylanase 활성 및 미생물 균수를 분석한 바, 초기 수분함량이 높을수록 호화도는 증가하는 경향을 나타내었으며, 반면 xylanase 활성 및 유리당 함량은 초기수분함량이 45% 까지는 증가하였으나 그 이상의 조건에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 호화도 증가를 위해서는 수분 함량이 70% 수준까지도 처리하여 가공을 할 수 있으나 과도한 수분 첨가는 대량 생산 공정에 적용 시 원료의 점성 증가, 원료의 뭉침 발생, 원료 이송중 막힘등의 문제가 예상될 수 있어 발효공정을 통한 NSP 분해 능력이 최대로 나타나는 수분 함량을 최적의 수분 조건으로 선정하는 것이 바람직하며, 따라서, 초기 수분함량을 40~50%로 조절하는 것이 바람직하다.

또한, 고체발효에서 초기 균주 접종량 역시 발효에 있어서 중요한 요소이다. 초기 균수가 너무 낮을 때에는 원하지 않는 다른 균에 의한 오염의 빈도가 증가할 수 있으며 반대로 단일 면적당 너무 높은 개체수로 존재 시에는 경쟁관계로 되어 증식 및 효소발현 보다는 개체를 유지하는 대사활동으로 energy flux가 진행되며 또한 대량생산시 종균 수급문제가 발생한다. 따라서 최적 종균 접종량을 결정하기 위해 초기 균주 접종량의 범위를 다른 균의 성장 및 대량 생산시의 종균 공급량 등을 고려하여 최소 1.0 × 10³ cfu/g에서 최대 1.0 × 10⁶ cfu/g으로 종균 접종량을 달리할 수 있으며, 가장 바람직하게는 1.0 × 10⁴~10⁵ cfu/g일 때 가장 높은 xylanase 활성과 유리당 함량이 된다.

발효시간에 있어서는, 즉, 유리당의 함량과 xylanase의 활성을 고려하여 평가하였을 때, 24 시간 내지 48시간이 바람직하다.

이하, 효소처리공정에 대해서 설명한다.

본 발명의 효소처리공정에는, Arabanase, Cellulase, Beta-glucanase, Hemicellulase, Xylanase, Endo-glucanase, Alpha-amylase 및 glucoamylase로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 사용할 수 있다.. 본 효소처리공정에서는, 이들 효소를 단독으로 사용할 수 있고, 또한, 조합하여 복합효소로 사용할 수 있다. 예를 들면, 예를 들면, Arabanase, Cellulase, Beta-glucanase, Hemicellulase, Xylanase등으로 포함하는 복합효소(이하 NSP-VS라 한다), Endo-glucanase를 포함하는 단일효소(이하 NSP-CE라 한다), Beta-glucanase, Cellulase, Alpha-amylase, Xylanase를 포함하는 복합효소(이하 NSP-VF라 한다) 및 Glucoamylase를 포함하는 단일효소(이하 NSP-SP라한다)로서 사용할 수 있다.

효소제의 사용을 위한 최적 온도로서는, 최적 온도범위는 NSP-CE가 50~60℃, NSP-VS 및 NSP-VF가 40~50℃, NSP-SP가 65~75℃이다. 효소처리 공정은 가수 후 침지공정을 효소반응공정으로 대체하고 효소반응 공정 이후 열처리 공정을 통해 옥수수 원료 가공조건을 설정하는 것도 가능하다. 즉, 옥수수의 침지공정을 효소처리 공정으로 대체하고, 효소반응공정 이후 열처리 공정을 행할 수 있다. 이 경우, 효소처리 조건은 초기 가수량을 조절한 후 효소반응을 위해 온도를 상기 효소반응에 최적한 온도까지 올린 후 효소제를 첨가수준별로 단독 혹은 복합으로 첨가하여 반응시킬 수 있으며, 효소반응의 종료후 증자를 실시할 수 있다.

이하 발효공정 및 효소처리 공정의 조합에 대해서 설명한다.

본 발명의 또 다른 일태는, 옥수수를 원료사료로 하여 곡물사료를 가공하는 방법에 있어서, 대량 생산에 적합한 최적의 가공방법을 제공한다는 점이다. 즉, 위에서 설명한 침지조건, 증자조건, 발효조건 및 효소조건에 있어서, 각각의 최적한 조건들이 있으나, 이를 실제의 생산환경에서 비용적인 면 및 설비를 포함하는 기술적인 면까지 고려하였을 때 이들을 서로 유기적으로 연관시킨 보다 최적화된 가공방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 특징은, 증자공정과 발효공정과 효소공정의 상관관계를 고려하여 이를 조합함으로서, 유리당의 함량이나 Xylanase의 활성 및 최종 제품에서의 미생물 균수등에 있어서 가장 우수한 제품을 제조할 수 있는 가공방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들의 연구에 의하면, 이와 같은 최적의 가공방법은 ‘증자공정, 발효공정 및 효소처리공정’(이하 ‘공정 1’이라 한다), ‘증자공정, 발효공정 및 효소처리공정’(이하 ‘공정 2’라 한다) 또는 ‘효소처리공정, 증자공정 및 발효공정’(이하 공정 3이라 한다)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 가공방법이다. 즉, 종래 기술에 있어서는, 원료사료에 대해서 효소처리를 하거나 발효시키는 방법이 알려져 있었는데, 본 발명에서는, 이 양자를 특정의 사료원료에 초점을 맞추어 조합한 후, 그 최적의 가공공정을 찾아 내었다는 점에서 특징이 있다. 예를 들면, 본 발명의 상기 공정 2에 있어서의 구체적인 조건은 다음과 같다. 즉, 사료원료인 옥수수의 수분을 40~50%로 조절한다. 수분이 조절된 옥수수를 약 30분~4시간 침지한 후, 80~150℃에서 20~60분간 증자한 후, 35℃ 이하로 냉각한 후, 초기균수가 1.0×10³~1.2×10⁶이 되도록 접종한다. 배양조건은 온도가 20~40℃, 습도가 50~80%, 발효시간을 24~48이 되도록 발효한다. 발효가 종료되었을 때, 효소를 0.1~0.45% 첨가하여 30분 ~1 시간 반응시킨다. 또한, 상기 효소처리공정을 발효공정 전에 하는 것도 가능하다. 이와 같이 가공된 최종 옥수수 단미사료는 옥수수 원료와 비교하였을 때, 호화도가 180%이상 증가하며, 유리당이 600%이상, 유용미생물이 증가하며 효소활성을 보유한 특성을 갖는다.

이하, 본 발명의 실시예를 설명한다. 다만, 이하의 실시예는 본 발명의 구체적인 한 태양을 보이는 것으로, 본 발명의 기술사상을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 : 사료원료의 제공

AOAC 및 Weende 방법을 이용하여 옥수수, 소맥, 소맥피, 대두박, 귀리를 대상으로 일반성분 및 사료자원에 대한 total pentosan, Pectin, Total NSP 함량을 분석하였다. Total pentosan은 Orcinol-iron 방법, Pectin은 Sadasivan 과 Manickam 방법, 그리고 Total NSP는 Englyst와 Cummings 방법들을 일부 수정하여 분석을 실시하였다.

사료자원인 소맥, 귀리, 옥수수, 대두박, 소맥피의 gross energy는 Mclean과 Tobin의 방법에 따라 bomb calorimetry로 분석하였으며, 아미노산 함량은 6 N HCl로 사료 샘플을 산 가수분해 후 ninhydrin 반응을 이용하여 측정하고, 황 함유 아미노산은 별도로 performic acid로 산 가수분해 후 ninhydrin반응을 이용하여 아미노산 자동분석기 (Hitachi L-8500)로 분석을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 1과 같다.

(%)	옥수수 ( USA )	소맥 ( EU )	귀리 ( Australia )	대두박 ( Domestic )	소맥피 ( Domestic )
수분	12.25	11.37	10.37	11.48	11.68
조단백질	7.57	9.2	10.88	49.17	14.43
조섬유소	3.1	2.77	2.43	3.81	8.2
조지방	3.69	0.5	9.04	1.57	2.7
회분	2.11	1.61	1.59	6.69	5.21
NFE^*	68.04	74.55	65.69	27.28	57.78

* NFE : (Nitrogen Free Extract)

이어서, 사료원료의 세포막 구성 물질을 이루고 있는 NSP 함량을 알아보기 위해 세포막 구성물질에 대한 분석은 Van Soest 방법과 Updegroff 방법을 이용하였으며, total pentosan, pentose 분석은 Frazer 등 (1956)의 분석방법을 이용하여 분석을 실시하였다. Pectin의 분석에는 Sadasivan 과 Annison (1996)의 분석방법(중량측정법)을 사용하였으며, total NSP함량은 Englyst와 Cummings 방법을 기초로 비색법을 이용하여 사료원료별 total NSP함량을 분석하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

(%)	옥수수	소맥	귀리	대두박	소맥피
펜토산	3.95±0.37	6.25±0.94	4.16±0.25	4.64±0.88	15.02±1.37
셀룰로오스	1.45±0.16	1.74±0.12	0.80±0.22	2.12±0.22	5.10 ±0.03
펙틴	2.56±0.75	3.72±1.08	3.95±0.11	2.20±0.46	8.15±4.31
총 NSP	16.60±0.73	14.90±2.96	25.68±2.32	12.59±0.14	36.65±0.61

이상의 결과로부터, 세포막의 총 NSP 함량은 소맥피에서 36%로 가장 함유량이 높았으며, 옥수수에서는 16%를 나타냄을 알 수 있었다. 세포막 구성성분 중 cellulose 함량은 소맥피에서 높게 나타났으며, pentosan 및 pectin 함량도 다른 사료자원에 비해 높은 함량을 나타내었다.

또한, 이상 사료자원의 총 에너지 분석결과를 하기 표 3에 나타냈다.

사료원료	총에너지 (Kcal/Kg)
옥수수	4,018
소맥	4,104
귀리	4,653
대두박	4,242
소맥피	4,164

이상으로부터, 곡물사료라고 하여도, 각각의 곡물사료에 존재하는 NSP의 종류 및 총 NSP의 양이 동일하지 않다는 사실을 확인할 수 있다.

실시예 2 : 침지조건 및 증자조건의 설정

옥수수 가공을 위해 분쇄되지 않은 통옥수수를 이용하여 침지조건을 먼저 결정하였다. 옥수수 침지를 위해 가수량은 원료량의 2배로 하여 실온에서 충분한 침지가 이루어지도록 하였다. 침지 시간에 따른 옥수수 원료의 수분함량 변화를 도 1에 나타내었다. 수분함량은 침지 1시간 후 27% 수준에서 침지 24시간 후 40.4%까지 증가하는 경향을 보였다. 옥수수 가공을 위해서는 침지시간을 최소화하기 위한 분쇄 옥수수의 사용이 적당할 것으로 판단되었다. 침지 시간별 호화도의 변화를 표 4에 나타내었다. 침지 6시간 후 28.9%로 원료의 호화도 대비 약 14%가 증가하였다.

침지 시간	호화도	증가율(%)
0시간	15.4
1시간	20.7	34.4
2시간	24.6	59.7
4시간	25.3	64.3
6시간	28.9	87.7

또한, 옥수수 원료를 1mm 분쇄스크린으로 분쇄한 원료를 대상으로 침지시간 별 호화도 변화를 조사하여 그 결과를 표 5에 나타내었다. 호화도는 통 옥수수를 사용했을 때보다 각 시간별로 약 4~6% 증가한 것을 알 수 있었다.

침지 시간	호화도(%)	증가율(%)
분쇄 옥수수(1mm)	15.8
1시간	26.2	65.8
2시간	26.8	69.6
4시간	29.3	85.4
6시간	33.5	112.0

옥수수 가공공정 개발을 위해 침지공정 후 121℃에서 15분간 열처리 공정을 추가 하여 가공한 옥수수의 호화도 변화를 표 6에 나타내었다. 호화도는 열처리 없이 가공한 옥수수에 통 옥수수의 경우 약 34%, 분쇄 옥수수의 경우 약 43% 증가하였다. 또한, 침지를 하지 않은 옥수수에 비해서는 약 30%의 증가효과를 보여 침지공정 역시 반드시 필요한 공정임을 나타낸다.

처리 공정	호화도(%)	증가율(%)
옥수수 원료	16.3
무 침지 후 증자 (121℃, 15분)	32.1	96.9
4시간 침지 후 증자 (121℃, 15분)	59.5	265.0
4시간 침지 후 증자 (1mm 분쇄, 121℃, 15분)	72.2	342.9

이어서, 적정 증자온도를 찾기 위해 분쇄 옥수수 4시간 침지한 후 60~120℃에서 30분간 증자를 통해 호화도 변화를 조사하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 60℃에서 30분간 열처리 시 약 53% 수준의 호화도가 121℃에서 30분간 열처리를 통해 82% 수준으로 증가하여 열처리 온도 및 가공시간이 가공을 위한 중요한 인자임을 확인하였다.

마지막으로, 옥수수 입도에 따른 증자공정을 조건을 설정하기 위해서, 3, 3.5, 4mm의 옥수수 원료를 대상으로 침지시간은 2시간을 기준으로 동일하게 처리하였고, 가수량을 원료량 기준으로 100~120%로 달리하고 열처리 시간도 121℃에서 30분, 60분으로 달리하여 가공조건에 따른 호화도 변화를 조사하였다. 그 결과를 표 7 및 8에 나타냈다.

입자도(mm)	가수량(%, w/v)	호화도(%)
3.0	100	86.3
	110	86.4
	120	85.0
3.5	100	84.7
	110	84.8
	120	84.2
4.0	100	84.4
	110	85.4
	120	83.6

입자도(mm)	가수량(%, w/v)	호화도(%)
3.0	100	87.4
	110	88.3
	120	86.8
3.5	100	85.4
	110	87.1
	120	86.4
4.0	100	85.0
	110	86.6
	120	87.9

또한, 4mm로 파쇄한 옥수수 가공시 침지 온도에 따른 옥수수 수분함량 변화를 도 3에 나타냈고, 이에 의하면, 침지 온도변화 증가를 통해 침지시간을 단축할 수 있을 것으로 판단된다. 특히, 침지온도를 60℃까지 올릴 경우 30℃에서 3시간 침지 시보다 수분함량이 높아, 침지시간을 1시간으로 하고 침지 수분함량을 70~90% 수준까지 낮춰 121℃에서 20분간 증자를 통해 호화도 변화를 조사한 결과를 표 9에 나타낸다.

입자도 (mm)	가수량 (%, w/v)	호화도(%)		평균
입자도 (mm)	가수량 (%, w/v)	1차 테스트	2차 테스트	평균
3.0	70	80.4	79.5	80.0
	80	80.5	80.1	80.3
	90	80.8	80.5	80.6
3.5	70	81.3	81.6	81.4
	80	81.5	81.2	81.3
	90	81.4	82.0	81.7
4.0	70	77.1	80.6	78.9
	80	79.9	80.8	80.4
	90	80.7	80.7	80.7

본 실시예의 결과로부터, 적절한 침지조건 및 증자조건은 침지조건이 실온 내지 60℃에서 30분 내지 4시간, 증자조건이 80℃~150℃에서 20분 내지 60분이라는 사실을 확인하였으며, 이와 같은 구간에 있어서, 호화도를 80% 이상으로 할 수 있음을 확인하였다.

실시예 3 : 발효조건의 설정

옥수수에 적합한 발효 균주를 선별하고자 발효실험을 진행하였다. 사료원료의 영양소 이용성을 저해하는 성분으로 알려져 있는 NSP(Non starch polysaccharide)를 분해하는 지표로서 발효 후 유리되는 glucose 함량을 분석하여 상대적으로 높은 유리된 glucose 함량을 나타내는 균주를 최종 선발하였다. 선발된 균주들은 사료원료의 초기 수분함량, 초기 균주 접종량 별로 최적 조건을 확립하였다.

사료원료의 발효를 위해 사용된 균주들은 xylanase, cellulase 활성이 우수하며 amylase와 protease를 발현하는 균주들로서, Bacilluse subtilis 1-6CX, B. subtilis 1-12CX, B. subtilis 2-19CX, B. subtilis P11, Aspergillus oryzae GB-641, A. niger GB-124, A. niger GB-X2이다. 고체발효조건은 수분을 40%로 보정한 사료원료를 30분간 침지한 후 121℃, 30분간 증자하여 35℃이하로 냉각된 사료 원료에 선발균주를 접종 후 초기 균수가 1.2 X 10⁶ cfu/g이 되도록 접종하였다. 총 발효시간을 48시간으로 설정하고 배양온도 30℃, 습도 55%의 조건으로 원료 두께를 1~1.5cm가 되게 하여 호기발효를 진행하였다. 발효후 하기와 같은 방법을 사용하여 Xylanase 활성, 유리당 함량 및 호화도를 구하였다.

- Xylanase 활성 측정

Xylan은 xylanase에 의해 oligosaccharide와 monosaccharide로 분해된다. 이때, 산화기를 갖게 되는 oligosaccharide와 환원기를 갖게 되는 monosaccharide는 boiling bath에서 DNS 시약과 발색 반응을 일으키게 되는데 이 발색 정도를 spectrophotometer로 측정한다. Xylanase 1U는 37℃, pH5.5의 조건에서 5㎎/㎖의 xylan solution으로부터 1μmol의 환원당을 유리시키는 데 필요한 효소의 양으로 정의한다. 간략한 측정방법은 다음과 같다.

- 호화도 분석

호화도 분석은 식품공전 호화도 분석방법을 이용하여 분석을 실시하였다.

- 유리당 분석

효소처리 가공공정 개발을 위해 효소처리 곡물에 대한 released glucose 함량 분석은 megazyme glucose kit를 이용하여 분석하였다.

실험은 B. subtilis 1-6CX, B. subtilis 1-12CX, B. subtilis 2-19CX을 사용한 1차 실험 및 B. subtilis P11, B. subtilis 2-19CX aspegillus oryzae GB-641, niger GB-124, A. niger GB-X2을 사용한 2차 실험으로 나누어 실시하였다. 1차 실험에 있어서, 3가지 균주 모두 Bacillus 균주로서 옥수수 발효에 적합한 균주를 선발하는 과정에서 고체발효조건을 기준으로 효소 발현을 위한 최적 조건을 설정하였다. 이를 위해 초기 수분함량을 40%, 배양온도를 32℃, 배양시간을 48시간으로 설정하여 발효에 대한 지표로 미생물 균수 및 영양소 이용성 증대에 대한 간접지표인 옥수수에서 유리된 glucose 함량을 비교 평가하였으며, 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 있어서, 가장 효과가 우수한 것으로 여겨지는 B. subtilis 2-19CX 균주를 이용해서, 초기 수분함량 및 접종 균수별로 조건을 달리하여 최적의 고체발효 조건을 찾고자 고체발효실험을 진행하였다. 사료원료로서의 가치를 증가시키기 위해서는 우선적으로 난소화성 물질인 NSP의 함량이 감소되어야 하는데 이를 위해서는 선별한 균주의 NSP를 분해하는 효소의 발현을 최대한 유도하여야 한다. 따라서 발효 공정 후의 NSP 분해 지수로서 유리된 당의 함량을 기준으로 우선적으로 조건을 탐색하였다. 또한, 원료의 호화정도에 따라서도 가축에 급이 시 소화 및 영양소 이용성에 영향을 미치므로 증자 후 발효공정 중 원료의 수분함량에 따라 호화 후 노화정도에 영향을 미치므로 발효 과정 중 호화도 변화도 조사하였다. 따라서 옥수수 발효공정 확립을 위해 가장 우선시되어야 하는 발효 조건은 초기 수분함량으로 발효조건 뿐 아니라 곡류의 이용성의 지표가 되는 호화도에도 영향을 주는 요소로서 발효 및 건조공정에 따른 영향을 최소화 할 수 있는 최적 수분함량을 찾아야 한다. 이를 위해 발효 배지인 옥수수의 초기 수분함량을 30~70%로 달리하여 수분함량에 따른 호화도, 유리 당, xylanase 활성 및 미생물 균수를 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5에서 보는 바와 같이 초기 수분함량이 높을수록 호화도는 증가하는 경향을 나타내었으며, 특히 초기수분함량이 65% 이상에서는 급격한 호화도의 증가를 확인 할 수 있었다. 반면 xylanase 활성 및 유리당 함량은 초기수분함량이 50% 까지는 증가하였으나, 그 이상의 조건에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 호화도 증가를 위해서는 수분 함량이 70% 수준까지도 처리하여 가공을 할 수 있으나 과도한 수분 첨가는 대량 생산 공정에 적용 시 원료 이송공정 등에 문제가 예상될 수 있어 발효공정을 통한 NSP 분해 능력이 최대로 나타나는 수분 함량을 최적의 수분 조건으로 선정하고자 하였다. 옥수수의 NSP 분해의 지표인 유리당 함량은 xylansas 역가 변화와 같은 경향을 나타내었으며, xylanase활성과 동일하게 50%가 최적의 수분함량인 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 옥수수에서 B. subtilis 2-19CX 균주의 발효를 통해 최대 xylanase 활성 및 최대 유리 당 함량과 최적의 호화도를 얻을 수 있는 수분함량은 40~50%인 것으로 확인되어 고체발효를 위한 최적 수분조건으로 선정하였다.

또한, 고체발효에서 초기 균주 접종량은 발효에 있어서 중요한 factor로서 초기 균수가 너무 낮을 때에는 원하지 않는 다른 균에 의한 오염의 빈도가 증가할 수 있으며 반대로 단일 면적당 너무 높은 개체수로 존재 시에는 경쟁관계로 되어 증식 및 효소발현 보다는 개체를 유지하는 대사활동으로 energy flux가 진행된다. 따라서 최적 종균 접종량을 결정하기 위해 초기 균주 접종량의 범위를 다른 균의 성장 및 대량 생산시의 종균 공급량 등을 고려하여 최소 1.0×10³ cfu/g에서 최대 1.0×10⁶ cfu/g으로 종균 접종량을 달리하여 발효실험을 진행하하여 그 결과를 도 6에 나타냈다. 그 결과 접종 종균 수준이 낮을수록 xylanase 활성 및 유리당 함량이 증가하는 것을 확인하여 B. subtilis 2-19CX 균주의 초기 종균 접종수준을 1.0×10³~1.0X10⁶ cfu/g 으로 설정하였다.

B. subtilis P11, B. subtilis 2-19CX aspegillus oryzae GB-641, niger GB-124, A. niger GB-X2을 사용한 2차 실험에 있어서는, 고체발효 조건인 초기 수분함량 40%, 온도 33℃, 48시간동안 호기발효하여 비교하였고, 그 결과를 도 7에 나타냈다. 발효 후의 미생물 균수는 10⁸CFU/g 수준으로 유사하였으나 유리된 glucose 함량과 xylanase 활성에서는 A. niger GB-124 균주가 42.7 mg/g, 140 U/g으로 가장 우수한 결과를 나타내었다. A. niger GB-124 균주를 이용하여 초기 수분함량 및 접종 균수별로 조건을 달리하여 최적의 고체발효 조건을 찾고자 고체발효실험을 진행하였다. 사료원료로서의 가치를 증가시키기 위해서는 우선적으로 난소화성 물질인 NSP의 함량이 감소되어야 하는데 이를 위해서는 선별한 균주의 NSP를 분해하는 효소의 발현을 최대한 유도하여야 한다. 따라서 발효 공정 후의 NSP 분해 지수로서 유리된 당의 함량을 기준으로 우선적으로 조건을 탐색하였다. 또한, 원료의 호화정도에 따라서도 가축에 급이 시 소화 및 영양소 이용성에 영향을 미치므로 증자 후 발효공정 중 원료의 수분함량에 따라 발효 과정 중 호화도 변화도 조사하였다. 이를 위해 발효 배지인 옥수수의 초기 수분함량을 30~70%로 달리하여 수분함량에 따른 호화도, 유리 당, xylanase 활성 및 미생물 균수를 분석하여 도 8에 나타냈다. 도 8에서 보는 바와 같이 초기 수분함량이 높을수록 호화도는 증가하는 경향을 나타내었으며, 반면 xylanase 활성 및 유리당 함량은 초기수분함량이 45% 까지는 증가하였으나 그 이상의 조건에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 호화도 증가를 위해서는 수분 함량이 70% 수준까지도 처리하여 가공을 할 수 있으나 과도한 수분 첨가는 대량 생산 공정에 적용 시 원료의 점성 증가, 원료의 뭉침 발생, 원료 이송중 막힘등의 문제가 예상될 수 있어 발효공정을 통한 NSP 분해 능력이 최대로 나타나는 수분 함량인 40~50%를 최적의 수분 조건으로 선정하였다.

또한, 최적 종균 접종량을 결정하기 위해 초기 균주 접종량의 범위를 다른 균의 성장 및 대량 생산시의 종균 공급량 등을 고려하여 최소 1.0 × 10³ cfu/g에서 최대 1.0 × 10⁶ cfu/g으로 종균 접종량을 달리하여 발효실험을 진행하였고 그 결과를 도 9에 도시하였다.

또한, 위에서 얻은 결과를 기초로 하여, pilot scale (200 ~ 500kg) 에서의 최적 고체발효조건을 확립하기 위해 적정 발효 시간을 조사하고 제조된 고상 발효제품은 사양시험용 사료원료로 사용하여 개발품의 생리적 기능성을 조사하였다. 즉, B. subtilis 2-19CX를 이용하되, 수분을 50%로 보정한 옥수수원료 500kg을 30분간 침지한 후 121℃, 30분간 증자하여 35℃이하로 냉각하여 초기 균수가 1.2 X 10³ cfu/g이 되게 접종하였다. 배양조건은 온도 35~40℃, 습도 55%, 48시간 호기조건으로 발효하였다. 발효용 옥수수 원료의 두께는 2.5~3.0cm가 되게 하여 발효를 진행하였다. 이와 같이 얻어진 발효사료에 대해서, Xylanase 활성, Cellulase 활성, Amylase 활성, Protease 활성, 호화도 및 유리당 함량에 대해서 분석하였다. 그 결과를 도 10에 도시했다. 도 10에서 알 수 있는 바와 같이, xylanase 활성은 발효 시간이 경과함에 따라 55U/g까지 증가하였으며 효소활성 증가에 따라 유리 당의 함량도 20mg/g 수준까지 증가하였다. 하지만 발효 36시간째 이후로는 유리 당의 증가는 일정하게 유지되는 것으로 나타나 옥수수 500kg 규모의 최적 발효 시간은 36~40시간임을 알 수 있었다. 즉, 발효 옥수수 가공 시에는 초기 수분함량 50%, 배양 온도 35~40℃, 종균 B. subtilis 2-19CX의 초기 접종 수준 1.0×10³ cfu/g 조건에서 발효 시간을 36~40시간으로 하는 것이 바람직한 것으로 확인되었다. 옥수수 원료는 발효공정을 통해 기능성이 개선된 원료로 전환되었으며 최종 시제품은 호화도의 향상, 유리 당의 함량 증가, 유용 미생물 증가 및 효소활성(protease, amylase, xylanase, cellulase)을 보유한 특성을 가지므로 가축에서의 영양소 이용성이 증대될 수 있는 사료 자원인 것으로 판단된다 (하기 표 10).

	옥수수
	가공전	가공후	차이점 (비율 %)
호화도(%)	31.8	49.8	156.6
유리당(mg/g)	4.2	18.2	433.3
미생물 (Log cfu/g)	-	9.1
효소활성 (U/g)	-	Protease 1,500.0 Amylase 87.3 Cellulase 1,134.0 Xylanase 53.4

또한, 발효처리를 통한 물리적 특성변화를 전자현미경(SEM) 사진을 통해 확인하였으며, 이를 도 11에 나타냈다. 도 11에는 발효처리 뿐 아니라, 하기 실시예 4에서 시행한 효소공정처리후의 사료의 외관의 변화를 함께 나타내었고, 전분입자가 완전히 파괴되어 형태를 잘 알아보기 힘든 상태로 관찰되었으며, 가축에서의 이용성이 증가될 수 있다.

추가적으로, 발효가공전후의 화학적특성의 변화를 AOAC 및 Weende 방법을 이용하여 일반성분을 분석하였으며, 총에너지를 Mclean과 Tobin의 방법에 따라 bomb calorimetry로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 11 및 12에 나타냈다.

(%)	가공전	가공후
수분	8.34	9.16
조단백질	9.31 (9.14)^*	8.84 (8.76)
조섬유소	2.79 (2.74)	2.42 (2.40)
조지방	2.61 (2.56)	4.43 (4.39)
회분 (DM basis)	1.63	1.86
NFE^** (가용무질소물)	75.32	73.29

	총에너지 (Kcal/Kg)
가공전	3939
가공후	3948

실시예 4 : 효소처리조건의 설정

본 발명의 효소처리공정조건을 설정하기 위하여, Arabanase, Cellulase, Beta-glucanase, Hemicellulase, Xylanase, Endo-glucanase, Alpha-amylase 및 glucoamylase로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 사용하였다. 구체적으로, Arabanase, Cellulase, Beta-glucanase, Hemicellulase, Xylanase을 포함하는 효소제(이하 NSP-VS라 한다,), Endo-glucanase를 포함하는 효소제(이하 NSP-CE라 한다), Beta-glucanase, Cellulase, Alpha-amylase, Xylanase를 포함하는 효소제(이하 NSP-VF라 한다) 및 Glucoamylase를 포함하는 효소제(이하 NSP-SP라한다)를 사용하였다. 가공을 위해 사용한 효소제의 최적 온도범위를 NSP-CE (50~60℃), NSP-VS & NSP-VF (40~50℃), NSP-SP (65~75℃)로 단독 혹은 복합 처리를 위한 최적의 온도로 55℃를 설정하였다. 효소처리 조건은 초기 가수량을 원료대비 70% 수준에서 실시하고 효소반응을 위해 온도를 60℃까지 올린 후 효소제를 첨가수준별로 단독 혹은 복합으로 첨가하고 1시간동안 반응을 실시하였다. 반응 종료 후 110℃에서 40분간 증자를 실시하였다. 가공 샘플에 대한 건조 종료 후 호화도, 소화율 분석 및 외관변화의 확인을 통해 적정 효소처리 공정을 확립하였다. 효소제 첨가수준 및 처리조건을 표 13에 나타내었다.

효소제	첨가수준(%)	가수량(%, w/v)	반응온도, 시간	증자조건
NSP-CE	0.15, 0.3, 0.45, 0.6	70	60℃, 1hr	110℃, 40 min
NSP-SP	0.15, 0.3, 0.45, 0.6	70	75℃, 1hr	110℃, 40 min
NSP-CE + NSP-SP	각각 0.1, 0.2, 0.3	70	65℃, 1hr	110℃, 40 min

효소처리 가공샘플에 대한 소화율 및 호화도 분석결과를 표 14에 나타내었다. 소화율은 원료가 30% 수준인데 비해 효소 및 증자처리를 통해 73~75% 수준까지 증가하였으며, 호화도는 74~79.4%까지 증가하였다. 각 첨가수준 별 효소처리 시 단순 열처리 샘플에 비해 증가하였지만, NSP-CE 보다는 NSP-SP가 보다 효과적이었다.

처리	소화율 (%)	호화도 (%)
사료원료	30.81	31.8
증자	73.13	74.0
NSP-CE 0.15%	73.24	74.6
NSP-CE 0.30%	73.88	74.4
NSP-CE 0.45%	74.43	77.0
NSP-CE 0.60%	75.20	77.5
NSP-SP 0.15%	73.30	74.1
NSP-SP 0.30%	74.14	75.9
NSP-SP 0.45%	74.90	75.4
NSP-SP 0.60%	77.76	79.4
NSP-CE 0.1%+ NSP-SP 0.1%	73.27	75.2
NSP-CE 0.2%+ NSP-SP 0.2%	73.88	76.5
NSP-CE 0.3%+ NSP-SP 0.3%	75.82	76.8

처리 공정 이후 원료의 외관변화를 전자현미경(SEM)사진을 통해 확인하였다 (도 12). 단순 침지공정만으로도 전분입자의 팽윤으로 인해 입자 외부가 거칠게 변화되는 것을 확인할 수 있었으며, 효소처리를 통해 전분입자가 완전히 파괴되어 형태를 잘 알아보기 힘든 상태로 변화되었으며, 열처리를 통해 원료 전체의 전분입자가 완전히 변형된 것을 확인 할 수 있었다.

효소처리농도를 하기 표 15에서와 같이 각 효소제 별로 0.1~0.3%를 첨가하여 최적의 처리농도를 구하였다. 표 15에서와 같이 단독 효소처리에서 NSP-CE 및 NSP-VS은 0.3% 첨가 구에서도 released glucose 함량 및 호화도에서 낮은 값을 나타내었으나, NSP-VF 와 NSP-SP은 0.3% 첨가 시 유리당 함량 및 호화도에서 각각 11.7%, 81.2% 및 20.4%, 79.5%로 복합처리 시 시너지 효과를 기대할 수 있다.

	유리당 (mg/g)	호화도 (%)
사료원료	2.7	20.1
NSP-VF 0.1%	8.7	78.2
NSP-VF 0.3%	11.7	81.2
NSP-CE 0.1%	5.1	74.4
NSP-CE 0.3%	4.5	75.1
NSP-VS 0.1%	5.8	75.1
NSP-VS 0.3%	7.9	76.5
NSP-SP 0.1%	6.7	75.1
NSP-SP 0.3%	20.4	79.5

효소제 복합처리를 통한 효소 처리조건 설정은 각각의 효소를 0.1~0.2%까지 첨가하여 최적 조건을 설정하고자 하였다. 그 결과 표 16에서 보는바와 같이 NSP-SP 및 NSP-VF를 0.2%씩 첨가 시 유리당 함량 및 호화도가 각각 23.4% 및 87.5%로 가장 높게 나타났다. 효소처리 전, 후 외관 변화를 전자현미경으로 확인한 결과를 도 13에 나타냈다. 효소처리 가공 전 원료 입자 내부의 전분입자를 명확하게 확인 할 수 있으나, 가공 후 전분입자가 완전 변형되어 소화되기 쉬운 형태로 변화된 것을 확인 할 수 있었다

조성 (%)		유리당(mg/g)	호화도 (%)
효소 1	효소 2	유리당(mg/g)	호화도 (%)
NSP-SP	NSP-VF
0.1	0.1	11.6	78.2
0.1	0.2	12.1	83.2
0.2	0.1	10.3	80.1
0.2	0.2	23.4	87.5
NSP-SP	NSP-VS
0.1	0.1	9.8	76.1
0.1	0.2	10.3	78.1
0.2	0.1	12.4	78.9
0.2	0.2	13.6	80.5

실시예 5 최적의 가공조건의 설정

실시예 1 내지 4에서 얻어진 가공조건을 토대로 하여서, 옥수수를 가공하기 위한 최적의 가공조건을 설정하였다. 효소제로서 glucoamylase을 사용하였고, A. niger GB-124를 발효균으로 이용하였다. 상기 효소 및 발효에 의한 가공조건의 최적 기준은 다음과 같이 확립하였다. 일반적으로 사료원료의 영양소 이용성을 저해하는 성분으로 알려져 있는 NSP(Non starch polysaccharide)를 분해하는 지표로서 발효 후 유리되는 glucose 함량을 분석하여 상대적으로 높은 유리된 glucose 함량을 나타내는 공정을 조사하였다. 각각의 원료별로 효소처리와 발효처리 공정 순서를 달리하여 사료원료의 최적 가공조건을 확립하였다. 최적의 가공조건을 확인하기 위해서 표 17의 공정 순서대로 가공하였다.

공정 종류	Step 1	Step 2	Step 3	비교항목
공정 1	증자	효소반응	발효	Released glucose, Xylanase, 미생물 균수
공정 2	증자	발효	효소 반응
공정 3	효소반응	증자	발효

표 17에 있어서, 증자조건은 110℃에서 30분간, 효소반응조건은 0.2% 첨가 후 40℃에서 30분 반응 및 발효조건은 35℃에서 2 시간 또는 48시간으로 하였다. 수분을 40%로 보정한 사료원료를 30분간 침지한 후 110℃, 30분간 증자하여 35℃이하로 냉각된 사료 원료에 균주를 접종 후 초기 균수가 1.2 X 10⁶ cfu/g이 되도록 접종하였다. 총 발효시간을 48시간으로 설정하고 배양온도 33~35℃, 습도 55%의 조건으로 원료 두께를 1~1.5cm가 되게 하여 호기발효를 진행하였다. Xylanase 활성 및 유리당의 함량을 측정하였으며, 그 결과를 도 14에 나타냈다.

도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 유리된 glucose 함량과 xylanase의 활성을 고려하여 평가하였을 때 39.33 ± 0.1 mg/g, 106.31 ± 1.4 U/g으로 공정2의 48시간 발효조건이 가장 우수한 결과를 나타내었다.

실시예 6 : 대량생산에 있어서의 최적의 가공조건 설정

대량생산에서의(10ton) 최적 가공조건들을 확립하고자 하였다. 도 15와 같은 공정으로 대량 생산을 진행하였다. 사용균주로서 A. niger GB-124를 이용하였고, 발효조건으로서, 수분을 45%로 보정한 옥수수원료 10 ton을 30분간 침지한 후 110℃, 30분간 증자하여 35℃이하로 냉각하여 초기 균수가 1.0 X 10⁴~10⁵ cfu/g이 되게 접종하였다. 배양조건은 온도 30~35℃, 습도 55%, 48시간 호기조건으로 발효하였다. 이어서, xylanase 활성, cellulase활성, Amylase 활성, Protease 활성, 호화도 분석, 유리당 함량 등을 측정하였다. 도 16에 그 결과를 나타냈다.

도 16로부터 알 수 있는 바와 같이, 발효 시간이 경과함에 따라 xylanase 활성은 최대 184.2 U/g까지 증가하였으며 효소활성 증가에 따라 유리 당의 함량도 최대 20.2 mg/g 수준까지 증가하였다. 하지만 발효 30시간째 이후로는 유리 당의 증가는 일정하게 유지되는 것으로 나타나 옥수수 10ton 규모의 최적 발효 시간은 30~36시간임을 알 수 있었다. 즉, 옥수수 발효 가공 시에는 초기 수분함량 40%, 배양 온도 35~40℃, 종균 A. niger GB-124의 초기 접종 수준 1.0 X 10⁴~10⁵ cfu/g 조건에서 발효 시간을 30~36시간으로 하는 것이 바람직한 것으로 확인되었다. 발효 50시간째에 효소를 0.2% 첨가하여 2시간 반응하였을 때 유리당의 함량이 25.4 mg까지 상승하였으며 xylanase의 활성도 248 U/g까지 상승하였다.

또한, 최종 옥수수 가공물은 일반 옥수수 원료와 비교하였을 때, 최종 시제품은 호화도의 179.9%향상, 유리 당의 604.8%증가, 유용 미생물 증가 및 효소활성(protease, amylase, xylanase, cellulase)을 보유한 특성을 가지므로 가축에서의 영양소 이용성이 증대될 수 있는 사료 자원인 것으로 판단되었다.(표 18).

	옥수수
	가공전	가공후	차이 (비율 %)
호화도(%)	31.8	57.2	179.9
유리당(mg/g)	4.2	25.4	604.8
균주 (Log cfu/g)	-	7.1
효소활성 (U/g)	-	Protease 8,772.0 Amylase 1400.1 Cellulase 2200.2 Xylanase 248.5

또한, 최종 제품내에 발현되는 효소의 종류를 확인하였다. 효소의 종류를 apiZYM(Biomerieux, France)으로 조사하였는데, 이는 정제되지 않은 혼합시료에서의 효소의 활성을 검사할 수 있도록 제작되어 고체발효시 발현되는 여러 종류의 효소 활성을 조사하는데 적합하다. 실험방법은 제조사에서 제공되는 manual에 따라 진행하였다. 그 결과를 하기 표 19에 나타냈다.

No.	효소	기질	pH	결과
1	Alkaline phosphatase	2-naphthyl phosphate	8.5	+
2	Esterase(C4)	2-naphthyl butyrate	6.5	-
3	Esterase(C8)	2-naphthyl caprylate	7.5	-
4	Lipase(C14)	2-naphthyl myristate	7.5	-
5	Leucine arylamidase	L-leucyl-2-naphthylamide	7.5	-
6	Valine arylamidase	L-valyl-2-naphthylamide	7.5	-
7	Crystine arylamidase	L-cystyl-2-naphthylamide	7.5	+
8	Trypsin	N-benzoyl-DL-arginine-2- naphthylamide	8.5	+
9	α-chymotrypsin	N-glutaryl-phenylanine-2- naphthylamide	7.5	-
10	Acid phosphatase	2-naphtyl phophate	5.4	+
11	Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase	Naphthol-AS-BI-phosphate	5.4	+
12	α-galactosidase	6-Br-2-naphthyl-α D-galactopyranoside	5.4	+
13	β-glucuronidase	2-naphtyl-β D-galactopyranoside	5.4	-
14	β-glucosidase	Naphthol-AS-BI-β D-glucuronide	5.4	+
15	α-glucosidase	2-naphthyl-α D-glucopyranoside	5.4	-
16	β-glucosidase	6-Br-2-naphthyl-β D-glucopyranoside	5.4	+
17	N-acetyl-β-glucosaminidase	1-naphthyl-N-acetyl-β D-glucosaminide	5.4	+
18	α-mannosidase	6-Br-2-naphthyl-α D-mannopyranoside	5.4	-
19	α-fucosidase	2-naphthyl-α L-fucopyranoside	5.4	-

또한, 가공 전후의 외관변화를 전자현미경을 통해서 확인하였다. 그 결과를 도 17에 나타냈다. 이에 의하면, 최종적으로 발효 후 효소 반응 공정을 통해 가공된 사료원료들은 GRAS(Generally Recognized As Safe)인 균주들이 원료 표면에 높은 개체수를 이루고 있어 원료자체의 물리적 변화와 더불어 미생물의 대사 작용을 통해 복합 효소활성 및 고분자의 저분자화를 통한 원료 이용성 개선뿐만 아니라 probiotics으로서의 기능도 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 가공전후의 화학적특성의 변화를 AOAC 및 Weende 방법을 이용하여 일반성분을 분석하였다. 사료원료에 대한 gross energy는 Mclean과 Tobin의 방법에 따라 bomb calorimetry로 분석하였다. 그 결과를 하기 표 20에 나타냈다.

(%)	옥수수
(%)	가공전	가공후
수분	10.9	10.2
조단백질	8.43 (9.46)*	11.96 (13.32)
조지방	3.40 (3.82)	3.85 (4.29)
조섬유	2.15 (2.41)	3.27 (3.64)
조회분	1.25 (1.40)	2.01 (2.24)
NFE**	73.87	68.71
총에너지(Kcal/Kg)	4088	4221

표 20에서 알 수 있는 바와 같이, 발효 처리한 사료자원의 일반성분은 기존 사료업계에서 사용하고 있는 원료들의 일반성분 범위(Feedstuffs, 2009)에 들어가 정상적인 일반성분 수준을 나타내고 있다. 특히 발효공정을 거친 사료원료들은 일반 사료원료에 비해 조지방 함량이 높고, 조섬유소는 낮아져 어린 일령에 사용 시 효과적일 것으로 생각된다. 그리고 높은 조섬유소의 함량 때문에 사용량이 제한되는 원료들은 발효공정을 통해 조섬유소의 함량을 감소시키게 되면 사용량을 늘릴 수 있을 것으로 판단된다. 또한 귀리와 소맥에서는 발효 공정을 통해 조단백질 함량과 조지방의 함량이 높아져 가용무질소물(NFE)이 감소함을 확인하였다. 이는 미생물에 의해 조섬유소가 일부 단당류로 분해되고 미생물의 대사활동에 사용되어 사료 자원의 carbon flow가 이산화탄소로 소모됨으로서 조단백질의 함량이 증가한 것과 미생물의 지방 생산(polyunsaturated fatty acid)에 의한 것으로 생각된다.

실험예 1 : 발효처리된 옥수수 사료가 육성돈의 생산성에 미치는 영향

실시예 3에서 B. subtilis 2-19CX를 이용해서 발효처리된 옥수수 사료가 육성돈의 생산성에 미치는 영향을 알아보기 위해서 하기와 같은 실험하였다.

가. 재료 및 방법

① 시험동물 및 시험설계 3원 교잡종([Landrace×Yorkshire]×Duroc) 80두를 공시하였으며 시험 개시시의 체중은 24.37±1.06kg이었고, 6주간 사양시험을 실시하였다. 처리구는 1) T1 (basal diet내 옥수수 100% natural corn), 2) T2 (95% natural corn+5% fermented corn), 3) T3 (90% natural corn+10% fermented corn), 4) T4 (85% natural corn+15% fermented corn) 및 5) T5 (80% natural corn+20% fermented corn) 5개 처리를 하여 처리당 4반복, 반복당 4두씩 완전 임의 배치하였다.

② 시험사료 및 사양관리

사양시험은 단국대학교 시험농장에서 실시하였고, 시험에 사용된 사료배합비는 표 21에 나타내었다. 사료는 자유 채식토록 하였으며, 물은 자동급수기를 이용하여 자유로이 마실 수 있게 하였다.

③ 조사항목 및 방법

a. 생산성체중 및 사료 섭취량은 시험 개시 시 및 종료 시(6주)에 각각 측정하여 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율을 계산하였다.

b. 영양소 소화율

영양소 소화율을 측정하기 위하여 종료시 7일전에 표시물로서 산화크롬(Cr2O3)을 사료내 0.2% 첨가하였다. 크롬사료 급여 4일 후 분을 채취하였고, 채취한 분은 60℃ 열풍건조기에서 72시간 건조 시킨 후 Wiley mill로 분쇄하여 분석에 이용하였다. 사료의 일반성분과 표시물로 혼합된 Cr은 AOAC(1995)에 제시된 방법에 의해 분석하였다.

c. 분내 미생물 균수

돈분의 채취는 종료시 처리구별 8마리를 선발하여 항문 마시지법으로 분을 채취한 뒤, 실험실까지 －20℃에서 냉동보관 하였으며, 이후 멸균된 생리식염수에 현탁하여 균질화 시킨 다음 10³에서 10⁷까지 계단 희석하여 생균 수 측정용 시료로 사용하였다. 실험처리에 의한 돈분 내의 미생물 균수를 측정하기 위해 Lactobacillus에는 MRS agar, Coliforms에는 MacConkey agar (Difco, USA), Salmonella, Bacillis 에는 Nutrient broth를 사용하였고, 37℃에서 38시간 배양 후 균수를 측정하였다.

성분	%
옥수수	60.00
대두박	27.87
소맥	3.00
소맥피	2.83
당밀	3.50
동물성 지방	3.31
인산이칼슘	0.81
석회	0.72
소금	0.50
L-라이신-HCl (98%)	0.06
항생제	0.10
미네랄 premix1	0.10
비타민 premix2	0.20
합계	100.00
산출된 조성
ME, kcal/kg	3,400
조 단백질, %	18.00
라이신, %	1.00
메티오닌, %	0.30
칼슘, %	0.60
인, %	0.50

d. 분내 악취물질

분내 발생하는 유해가스물질 측정은 시험 종료시 각 처리구에서 동일한 시간 동안 배설된 분을 처리당 5마리로부터 채취한 후, 신선한 분 100g을 취하여 1000 mL의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 실온에서 24시간 동안 발효 시킨 후, 1일, 3일 및 5일 동안 실온에 보관하면서 Gastec(Model GV-100, GASTEC, Japan)을 사용하여 발생하는 ammonia, mercaptan 및 hydrogen sulfide을 측정하였다.

e. 분내 휘발성 지방산

분내 발생하는 유해가스물질 측정은 시험 종료시 각 처리구에서 동일한 시간 동안 배설된 분을 처리당 5마리로부터 채취한 후, 신선한 분 100g을 취하여 1000 mL의 밀봉된 플라스틱 용기에 넣고 실온에서 24시간 동안 발효 시킨 후, 1일, 3일, 5일 및 7일동안 실온에 보관하면서 Gastec (Model GV-100, GASTEC, Japan)을 사용하여 발생하는 acetic acid, propionic acid 및 butyric acid을 측정하였다.

④ 통계처리

모든 자료는 SAS (1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan’s multiple range test (Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다.

나. 사양시험 결과

① 생산성

사료 내 옥수수를 발효 옥수수로 0, 5, 10, 15, 20% 대체했을 때 생산성에 미치는 영향은 표 22에 나타난 바와 같다. 일당증체량은 T3 및 T4 처리구가 T1 및 T2 처리구에 비해 유의적으로 개선된 것으로 나타났고 (P<0.05), 사료효율은 T3 처리구가 T1 처리구에 비해 유의적으로 개선된 것으로 조사되었다 (P<0.05). 일당사료섭취량은 처리구간 유의적인 차이는 나타내지 않았다 (P>0.05).

돼지의 육성돈 구간은 근육의 성장이 다른 영양소의 성장에 비해 다소 많이 나타나는 구간으로 체단백질의 합성이 가장 왕성한 시기이다. 따라서 체단백질을 구성하는 영양소의 소화와 이동, 합성이 가장 중요한 의미를 갖는다. 본 시험에서 사용한 발효 옥수수를 일반 옥수수를 대체함으로써 가져올 수 있는 효과는 가수분해 또는 전단계적 소화과정을 거친 곡류를 공급한다는 차원에서만 이해되어진다기 보다 발효과정에서 생성된 다양한 대사물질이 성장에 직접적인 영향을 미친다고 판단하는 것이 옳다고 판단된다. 결과에 제시된 바와 같이 돼지의 일당증체량은 발효 옥수수의 사료내 함량이 6% (10% 대체) 및 9% (15% 대체) 처리구에서 유의적인 우수한 성적을 나타내고 있다. 즉 육성장 (체단백질 성장)이 왕성한 구간에서는 원료 옥수수의 10~15% 정도를 발효한 옥수수로 대체함으로써 가수분해된 탄수화물, 단백질 등의 영양소를 가장 효율적으로 흡수할 수 있는 기회를 제공함과 동시에 발효과정에서 생성된 대사물질의 공급을 통해 돼지의 소화생리적 활성을 원활하게 함으로써 궁극적으로 성장을 개선하는 효과를 가져온 것으로 판단된다. 이는 발효된 옥수수 그 자체로 가지는 가수분해되어진 영양소뿐만 아니라 사료 내 대부분의 영양소의 소화, 흡수 전반에 영향을 미쳐 궁극적으로 성장을 개선하고 사료효율을 개선한 효과로 이해할 수 있다.

항목	T1	T2	T3	T4	T5	표준오차
ADG, g	501	512	540	533	523	7
ADFI, g	1,423	1,275	1,301	1,342	1,362	46
사료효율	0.355	0.403	0.415	0.399	0.389	0.015
ADG : 전체 평균 일당 증체 ADFI : 평균 일일 사료섭취량

② 영양소 소화율

사료의 영양소 소화율의 결과를 하기 표 23에 정리하였다. 건물의 경우 T3에서 가장 높은 소화율은 나타냈고, 단백질 및 에너지 소화율은 T1 대비 발효 옥수수를 사용한 모든 처리구에서 우수한 것으로 조사되었다. 영양소의 소화율은 발효 옥수수의 사용에 따른 생산성 개선효과에 비추어 볼 때 육성장으로 대표되는 육성기 성장의 특성에 부합하여 단백질 소화율 및 에너지, 건물 소화율 모두 유의적 사료효율 개선효과와 이에 따른 증체량 개선에 까지 연계되는 성장개선효과를 객관적으로 설명해준다.

항목, %	T1	T2	T3	T4	T5	표준오차
건물 (dryed matter)	78.78	80.17	83.21	82.16	80.55	1.24
질소	76.66	78.30	80.27	80.49	79.21	1.52
에너지	77.97	78.46	79.53	80.71	79.27	1.68

③ 분내 미생물 균수

발효 옥수수를 공급했을 때 분내 미생물 균총에 미치는 영향을 조사한 결과 Lactobacillus, Bacillus, Coliforms 및 Salmonella 모두 유의적인 변화를 가져오지는 않았다 (표 24). 옥수수의 발효에 사용된 생균을 포함하고 있는 원료를 사용했기 때문에 상당 부분은 소화기를 따라 이동했을 가능성이 있어 소화기내 Bacillus는 고르게 분포가 되어 있을 것으로 생각된다. 특히 돼지의 분 내에는 원료로부터 이행되었을 것으로 추측되는 생균 (Bacillus)의 균수가 유의적으로 증가되지 않았다는 결과로부터 분으로 이행되었다기 보다는 장내 잔류하고 있을 가능성을 더 높게 판단할 수 있다. 장 건강 및 위생의 지표로 활용할 수 있는 Coliforms 및 Salmonella 균수 조사결과 일정하게 유지되고 있으며 더욱이 Salmonella의 경우 매우 낮은 수준으로 조사되어 대사 이상증상이나 설사를 유발할 수 있는 확률은 매우 낮을 것으로 기대된다.

항목, log₁₀cfu/g	T1	T2	T3	T4	T5	표준오차
Lactobacillus
1 주	6.9	7.0	7.2	7.1	6.9	0.4
2 주	7.2	7.1	7.1	7.4	7.2	0.4
3 주	7.3	7.1	6.9	7.2	6.9	0.5
4 주	7.3	7.1	7.0	7.2	6.9	0.5
Bacillus
1 주	7.0	6.9	7.0	7.0	7.2	0.5
2 주	7.0	7.2	7.2	7.2	7.0	0.6
3 주	7.2	7.2	7.3	7.0	7.1	0.5
4 주	7.0	7.2	7.3	7.2	7.0	0.4
Coliforms
1 주	6.8	6.7	6.9	7.0	6.7	0.4
2 주	6.9	6.9	6.6	6.6	6.7	0.5
3 주	7.3	7.0	6.8	6.3	6.8	0.4
4 주	6.8	6.6	6.5	6.2	6.4	0.3
Salmonella
1 주	2.9	2.7	2.4	2.8	2.5	0.4
2 주	3.0	2.8	2.6	2.9	2.5	0.4
3 주	2.9	2.9	2.7	2.8	2.4	0.3
4 주	2.9	2.4	2.5	2.5	2.5	0.2

④ 분내 가스 생성량

분내 암모니아, 황화수소 및 멜캅탄 등의 가스 생성량을 조사한 결과 (표 25), 무첨가 T1 처리구 대비 가스의 발생이 감소하는 경향을 알 수 있다 (P>0.05).

이 결과를 분내 미생물 균총 조사 결과에 비추어 보면, 발효한 옥수수를 다량 사용함에 따라 0.1% 수준으로 사용되는 소량의 생균제 사용효과를 어느정도 반영할 수 있는 것으로 판단된다. 즉 발효 옥수수를 통해 공급된 생균 및 그 대사물질이 장내 미생물 균총을 안정적으로 유지하고, 병원균의 증식을 억제하여 균형된 균총을 나타내고 있으며 이에 따라 암모니아 등의 가스를 생성하는 세균류를 적절하게 제어함으로써 가스의 생성량을 안정되게 유지한 것으로 판단된다.

항목, ppm	T1	T2	T3	T4	T5	표준오차
NH₃
1 일	18.7	17.7	17.2	17.1	17.4	18.7
3 일	19.2	18.3	17.6	17.7	18.2	19.2
5 일	19.5	19.3	18.7	18.6	20.8	19.5
7 일	19.6	19.2	18.4	18.5	18.8	19.6
H₂S
1 일	ND	ND	ND	ND	ND	ND
3 일	16.7	14.7	13.9	13.8	14.4	16.7
5 일	23.4	22.4	21.9	21.5	22.3	23.4
7 일	28.1	27.8	26.6	26.6	27.1	28.1
Mercaptans
1 일	12.4	11.7	11.4	11.3	11.6	12.4
3 일	26.7	26.1	25.7	25.5	25.8	26.7
5 일	27.6	27.2	26.7	26.9	26.9	27.6
7 일	22.7	22.1	21.4	21.8	22	22.7

⑤ 분내 휘발성 지방산

분내 휘발성 지방산 (acetic acid, propionic acid 및 butyric acid) 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 (표 26), 모든 처리구에서 유의적인 차이가 나타나지 않아 (P>0.05) 발효 옥수수가 장내 특히 하부장기 (대장)에서 이상발효를 유도하지는 않는 것으로 판단된다. 즉, 장내 미생물 균총을 정상적인 범위 내에서 유지함으로써 이에 따른 영향으로 세균류들의 발효/대사 과정이 정상적으로 유지되어 휘발성 지방산의 생성이 일정하게 유지되고 있음을 알 수 있다.

항목, ppm	T1	T2	T3	T4	T5	표준오차
Acetic acid
1 일	19.6	18.9	18.6	19.0	18.2	1.4
3 일	22.5	21.4	21.2	21.6	21.4	1.7
5 일	26.2	24.7	24.5	25.7	25.6	1.8
7 일	24.5	22.0	23.9	25.2	22.4	1.3
Propionic acid
1 일	11.6	10.8	11.6	10.5	11.5	2.0
3 일	14.7	12.9	14.0	14.4	13.7	1.5
5 일	16.3	14.9	16.5	16.2	16.4	0.9
7 일	15.3	13.9	14.7	14.8	14.6	1.3
Butyric acid
1 일	13.9	14.3	13.8	14.0	13.3	0.8
3 일	20.0	20.2	21.1	20.6	20.4	1.1
5 일	22.2	22.4	22.9	22.5	22.4	1.0
7 일	15.1	16.5	17.3	16.8	16.1	1.0

실험예 2 : 효소처리된 옥수수 사료가 육성돈의 생산성에 미치는 영향

실시예 4(NSP-SP 및 NSP-VF를 각각 0.2% 첨가군)의 효소처리된 옥수수 사료가 육성돈의 생산성에 미치는 영향을 하기와 같이 실험하였다.

가. 재료 및 방법

① 시험동물 및 시험설계

3원 교잡종([Landrace×Yorkshire]×Duroc) 96두를 공시하였으며 시험 개시시의 체중은 24.37±1.06kg이었고, 6주간 사양시험을 실시하였다. 처리구는 1) CON (100% 미가공 옥수수), 2) C10 (효소처리옥수수로 10% 대체), 3) C20 (효소처리옥수수로 20% 대체) 및 4) C30 (효소처리옥수수로 30% 대체) 4개 처리를 하여 처리 당 6반복, 반복 당 4두씩 완전임의 배치하였다.

② 시험사료 및 사양관리

사양시험은 단국대학교 시험농장에서 실시하였고, 시험에 사용된 사료배합비는 표 27에 나타내었다. 사료는 자유 채식토록 하였으며, 물은 자동급수기를 이용하여 자유로이 마실 수 있게 하였다.

항목	기본 사료
성분	%
옥수수	57.05
대두박	27.82
소맥	3.00
소맥피	2.83
당밀	3.50
우지	3.31
인산이칼슘	0.81
석회	0.72
소금	0.50
L-라이신-HCl (98%)	0.06
항생제	0.10
미네날	0.10
비타민	0.20
합계	100.00
산출된 조성
ME, kcal/kg	3,400
조단백질, %	18.00
라이신, %	1.00
메티오닌, %	0.30
칼슘, %	0.60
인, %	0.50

체중 및 사료 섭취량은 시험 개시 시 및 종료 시(6주)에 각각 측정하여 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율을 계산하였다. 통계처리는, SAS(1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan’s multiple range test(Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다.

사료 내 옥수수를 효소처리 옥수수로 0, 10, 20, 30% 대체가 생산성에 미치는 영향은 표 28에 나타내었다.

미가공 옥수수, %	100	90	80	70	표준오차
가공옥수수, %	0	10	20	30	표준오차
ADG, g	766	744	750	759	31
ADFI, g	1,587	1,508	1,557	1,580	93
사료효율	0.483	0.493	0.482	0.480	0.023

실험예 3 : 효소처리 및 발효처리된 옥수수 사료가 육성돈의 생산성에 미치는 영향

실시예 5에서 제조한 효소처리 및 발효처리에 의해 가공된 옥수수 사료(이하 가공된 옥수수라고 약칭하는 경우도 있다)가 육성돈의 생산성에 미치는 영향을 하기와 같은 방법으로 실험하였다.

가. 시험동물 및 시험설계

3원교잡종 [(Landrace × Yorkshire) × Duroc] 육성돈 128두를 공시하였고, 시험 개시시 체중은 29.59 ± 1.34 kg이었으며, 사양시험은 6주간 실시하였다. 시험설계는 1) HCC (고영양소사료), 2) HCFC (고영양소사료 + 20% 발효/효소처리옥수수 대체), 3) LCC (저영양소사료) 및 4) LCFC (저양양소사료 + 20% 발효/효소처리옥수수 대체)로 4처리, 처리당 8반복, 반복당 4두씩 완전 임의 배치하였다. 시험에 사용한 사료배합비는 하기 표 29와 같다.

성분, %	HCC	HCFC	LCC	LCFC
옥수수	58.00	46.40	56.00	44.80
가공된 옥수수		11.60		11.20
대두박	27.87	27.87	27.19	27.19
소맥	3.00	3.00	4.22	4.22
소맥피	2.03	2.03	3.53	3.53
당밀	3.50	3.50	4.00	4.00
동물성 지방	3.21	3.21	2.60	2.60
인산이칼슘	0.81	0.81	0.90	0.90
석회	0.72	0.72	0.70	0.70
소금	0.50	0.50	0.50	0.50
L-라이신-HCl (98%)	0.06	0.06	0.06	0.06
미네랄	0.10	0.10	0.10	0.10
비타민	0.20	0.20	0.20	0.20
합계	100.00	100.00	100.00	100.00
산출된 조성
ME, kcal/kg	3,328	3,328	3,277	3,277
조단백질, %	18.00	18.00	17.90	17.90
라이신, %	1.00	1.00	1.00	1.00
메티오닌, %	0.30	0.30	0.30	0.30
칼슘, %	0.60	0.60	0.60	0.60
인, %	0.50	0.50	0.50	0.50

나. 시험사료와 사양관리

사양시험은 단국대학교 시험농장에서 실시하였다. 시험사료는 NRC (1998) 요구량에 따라 배합한 옥수수-대두박 위주의 가루형태 사료를 자유 채식토록 하였으며, 물은 자동급수기를 이용하여 자유로이 먹을 수 있도록 조절하였다.

다. 조사항목 및 방법

(1) 일당증체량, 일당사료섭취량 및 사료효율증체량은 개시시 및 종료시 (6주)에 처리구 별로 체중을 측정하였다. 사료섭취량은 체중측정시 사료급여량에서 잔량을 제하여 계산하였고, 사료효율은 증체량을 사료섭취량으로 나누어 산출하였다.

(2) 영양소 소화율은 종료시 (6주)에 산화크롬 (Cr₂O₃)을 표시물로서 0.2% 첨가하여 7일간 급여 후 항문 마사지법으로 분을 채취하였다. 채취한 분은 60℃의 건조기에서 72시간 건조시킨 후 Willey mill로 분쇄하여 분석에 이용하였다. 사료의 일반성분과 표시물로 혼합 된 Cr은 AOAC (2000)의 방법에 준하여 분석하였다.

(3) 혈액 채취는 개시시 및 종료시 (6주)에 각각 경정맥 (Jugular vein)에서 K₃EDTA Vacuum tube(Becton Dicknson Vacutainer Systems, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 혈액을 2 mL 채취하여 분석하였고, 자동혈액분석기 (ADVID 120, Bayer, USA)를 이용하여 WBC (white blood cell), RBC (red blood cell) 및 lymphocyte 조사하였다. 혈청 생화학적 검사는 시험 개시시 및 종료시 (6주)에 각각 경정맥에서 Vacuum tube (Becton Dickinson Vacutainer Systems, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 혈액 5mL 채취 후 4℃에서 3,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 얻은 혈청을 자동 생화학 분석기 (HITACHI 747, Japan)를 이용하여 혈액내 glucose를 측정하였다.

(4) 분내악취물질 분석을 위해 종료시 (6주)에 각 처리구에서 동일한 시간 동안 배설 된 분을 채취한 후, 신선한 분 100g을 취하여 1,000mL의 밀봉된 플라스틱용기에 넣고 실온에서 24시간 동안 발효시킨 후 1, 3, 5 및 7일동안 실온에 보관하면서 Gastec (Model GV-100, GASTEC, Japan)을 사용하여 분으로부터 발생하는 암모니아 (Ammonia, NH₃),황화수소 (hydrogen sulfide, H₂S)및 총 메캅탄 (Total mercaptans, RSH)을 측정하였다.

라. 통계처리

모든 자료는 SAS (1999)의 General Linear Model procedure를 이용하여 Duncan’s multiple range test (Duncan, 1955)로 처리하여 평균간의 유의성을 검정하였다. 또한, 처리간의 평균을 orthogonal contrast를 이용하여 1) 고저 영양소 차이 및 2) Raw 와 Fermented 원료 차이의 요인분석을 검정하였다.

실험결과는 다음과 같다.

사료내 가공된 옥수수의 대체가 육성돈의 생산성에 미치는 영향을 표 30에 나타내었다. 일당증체량에 있어서는 HCFC 처리구가 LCC 처리구에 비해 유의적으로 높게 나타났고 (P<0.05), 고저 영양소 사료내 가공된 옥수수 대체 급여 처리구가 유의적으로 증가하였다 (P<0.05). 일당사료섭취량 및 사료효율에 있어서 처리구간 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (P>0.05).

항목	HCC	HCFC	LCC	LCFC	표준오차
ADG, g	673	694	662	682	8
ADFI, g	1,676	1,692	1,663	1,692	20
사료효율	0.401	0.410	0.398	0.403	0.006

사료내 가공된 옥수수 대체가 육성돈의 영양소 소화율에 미치는 영향은 표 31에 나타내었다. 건물 소화율에 있어서는 LCFC 처리구가 HCC 및 LCC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났고 (P<0.05), 질소 소화율에 있어서 또한 LCFC 처리구가 HCC 및 LCC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.05). 에너지 소화율에서는 HCFC 및 LCFC 처리구가 LCC 처리구보다 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.05). 고저 영양소 사료내 발효옥수수 대체 급여시 일반옥수수 급여 처리구보다 건물, 질소 및 에너지 소화율이 높게 나타났다 (P<0.05).

항목, %	HCC	HCFC	LCC	LCFC	표준오차
건물 (Dry matter)	77.16	78.42	76.68	80.20	0.90
질소	77.40	78.49	77.73	80.71	0.87
에너지	79.31	80.84	77.96	81.37	0.89

사료내 가공된 옥수수의 대체가 육성돈의 혈액특성에 미치는 영향은 표 32에 나타내었다. 개시시 혈액내 WBC, RBC, Lymphocyte 및 glucose 함량에 있어 처리구간 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (P>0.05). 종료시 혈액내 WBC, RBC 및 Lymphocyte 함량에 있어 처리구간 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 (P>0.05), 혈액내 glucose 함량에 있어서는 HCFC 처리구가 유의적으로 가장 높게 나타났고 LCC 처리구가 가장 낮게 나타났다 (P<0.05). 또한 영양소 차이에서는 고영양소 처리구가 저영양소 처리구보다 높게 나타났고 (P<0.01), 가공된 옥수수 대체 급여시 일반옥수수 급여 처리구보다 혈액 내 glucose 함량이 증가하였다 (P<0.01).

항목	HCC	HCFC	LCC	LCFC	표준오차
0 주
WBC, 10³/ul	17.49	17.68	18.84	17.76	0.96
RBC, 10⁶/ul	6.46	6.68	6.50	6.48	0.21
Lymphocyte, %	49.0	50.9	48.0	49.6	1.5
Glucose, mg/dL	106.8	105.4	103.6	109.2	2.0
6 주
WBC, 10³/ul	16.34	17.75	16.28	16.39	0.55
RBC, 10⁶/ul	7.31	7.52	7.45	7.55	0.08
Lymphocyte, %	56.6	57.8	55.6	56.0	1.2
Glucose, mg/dL	88.2^b	93.2^a	83.6^c	89.0^ab	1.4

사료내 가공된 옥수수의 대체가 육성돈의 분내 악취물질 발생에 미치는 영향은 표 33에 나타내었다. 분내 ammonia발생에 있어서는 보관 후 1일차에서 처리구간 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 (P>0.05), 보관 후 3일차에서 LCC 및 LCFC 처리구가 HCC 및 HCFC 처리구보다 유의적으로 낮게 나타났고 (P<0.05), 보관 후 5일차에서 LCFC 처리구가 HCC 및 HCFC 처리구에 비하여 유의적으로 낮게 나타났으며 (P<0.05), 7일차에서 LCFC 처리구가 HCC 처리구에 비하여 유의적으로 낮게 나타났다 (P<0.05). 영양소 차이에 따라 저영양소 사료 급여시 3일차 (P<0.001) 및 5일차 (P<0.01)에 감소되어 나타났고, 가공된 옥수수 급여시 7일차에 감소하여 나타났다 (P=0.05).

분내 hydrogen sulfide 발생에 있어서는 보관 후 1일차에서 처리구간 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 (P>0.05), 보관 후 3일차에서 LCFC 처리구가 HCC, HCFC 및 LCC 처리구에 비하여 유의적으로 낮게 나타났으며 (P<0.05), 5일차에서 LCFC 처리구가 HCC, HCFC 및 LCC 처리구에 비하여 유의적으로 낮게 나타났다 (P<0.05). 7일차에서 LCFC 처리구가 HCC 및 HCFC 처리구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다 (P<0.05). 3일. 5일 및 7일차에서 저영양소 사료 및 가공된 옥수수 급여에도 감소하여 나타났다 (P<0.05). 분내 Total mercaptans의 발생에 있어서 보관 후 1일차에서 처리구간 유의적인 차이를 나타내지 않았지만 (P>0.05), 3일차에서 LCFC 처리구가 HCC, HCFC 및 LCC 처리구에 비해 낮게 나타났고 (P<0.05), 저영양소 사료 및 가공된 옥수수 급여에도 감소하였다 (P<0.05). 그러나 보관 후 5일차 및 7일차에서는 처리구간 유의적인 차이가 나타나지 않았다 (P>0.05).

Items, ppm	HCC	HCFC	LCC	LCFC	표준오차
NH₃
1 일	12.6	12.6	12.4	12.2	0.3
3 일	16.8	16.2	15.1	15.2	0.3
5 일	19.4	19.0	18.5	17.9	0.3
7 일	17.2	16.6	16.7	15.6	0.4
H₂S
1 일	0.4	0.7	0.7	0.8	0.2
3 일	15.7	14.0	14.0	12.9	0.3
5 일	25.0	23.7	22.7	20.7	0.4
7 일	28.7	27.7	27.0	25.9	0.5
Total mercaptans
1 일	9.9	10.4	11.1	9.9	0.6
3 일	25.0	24.2	23.5	22.2	0.3
5 일	27.8	28.2	27.3	27.9	0.5
7 일	21.6	21.2	21.6	21.1	0.7

본 발명은 옥수수를 사료원료로 하는 단미사료를 제조함에 있어서 최적의 효소처리 및 발효처리 조건을 밝힌 것으로서, 호화도 및 유리당의 함량이 증가되고, 가축에서의 소화율 및 성장을 개선하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료에 관한 것이며, 이를 배합사료에 혼합하여 급이할 수 있으므로, 사료분야에 있어서의 산업상 이용가능성이 있다.

Claims

가축에서의 소화율 및 성장을 개선하는 옥수수 곡물사료를 가공하는 방법으로서, 상기 방법은 고체발효를 이용하며, 하기의 (a) 내지 (f) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료의 가공방법.
(a) 원료사료로서 수분함량 40~50%의 옥수수를 제공하는 단계;
(b) 옥수수를 침지하는 단계;
(c) 증자하는 단계;
(d) Bacilluse subtilis 1-6CX, B. subtilis 1-12CX, B. subtilis 2-19CX, B. subtilis P11, Aspergillus oryzae GB-641, A. niger GB-124 및 A. niger GB-X2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하여 발효하는 단계;
(e) Arabanase, Cellulase, Beta-glucanase, Hemicellulase, Xylanase, Endo-glucanase, Alpha-amylase 및 glucoamylase로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 사용하여 효소처리를 행하는 단계; 및
(f) 건조하는 단계
제 1항에 있어서, (a) 옥수수를 제공하는 단계는 옥수수의 입도를 1mm~4mm로 분쇄하여 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, (c) 옥수수를 증자하는 단계는 80~150℃에서 20~60분간 증자하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 발효하는 단계는, 20~40℃에서 24~48시간 발효하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 의하여 제조된 옥수수 곡물사료로서, 유리당의 함량이 25.4mg/g 이상인 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료.
제 7항에 있어서, 상기 옥수수 곡물사료는 알칼린 포스파타아제, 크리스틴아릴아미다아제, 트립신, 산성 포스파타아제, 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라아제, α-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, N-아세틸-β-글루코사민다아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료.
제 7항에 있어서, 상기 옥수수 곡물사료는 Bacilluse subtilis 1-6CX, B. subtilis 1-12CX, B. subtilis 2-19CX, B. subtilis P11, Aspergillus oryzae GB-641, A. niger GB-124 및 A. niger GB-X2으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주가 원료표면에 존재하는 것을 특징으로 하는 옥수수 곡물사료.