KR101467250B1 - 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 고체 발효 생균제의 제조방법 - Google Patents

셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 고체 발효 생균제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 고체발효 생균제의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명은 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM11170P) 균주, 상기 균주를 고체발효하는 단계를 포함하는 생균제의 제조방법, 상기 방법으로부터 제조된 생균제 및 상기 생균제를 포함하는 가축용 사료에 관한 것이다.

Description

셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 고체 발효 생균제의 제조방법{Bacillus subtilis strain having improved ability of decomposing cellulose, and process for producing probiotics using solid state fermentation by using the smae}
본 발명은 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 고체발효 생균제의 제조방법에 관한 것으로, 셀룰로오스 분해능이 우수한 균주를 획득하여 이를 포함하는 우수한 가축용 사료를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
효소제 시장은 지속적으로 성장하는 분야로서 연간 20억 달러의 규모의 시장을 갖고 있다. 이러한 산업 효소는 지금도 매년 4 내지 5%의 증가율을 나타내고 있으며, 특히 동물 사료용 효소 시장은 피타아제(phytase) 효소와 함께 사료 자원의 이용성을 높이기 위한 NSP효소 등 효율성 개선을 위한 효소의 요구량이 증가함에 따라 매년 4%이상의 시장 성장이 예측되고 있다.
현재 효소의 생산은 주로 유전적으로 변형된 균주를 통해 액상발효(Submerged fermentation, SmF)로 이루어지고 있지만, 동물 사료용 효소의 측면에서는 여러 종류의 산업 효소 생산을 위한 방법으로 고체발효(Solid-state fermentation, SSF) 기술에 대한 관심이 증대되고 있다.
한편, 가축에 대하여 성장촉진제 또는 치료의 목적으로 많은 종류의 항생제, 항균 물질이 사용되어 왔는데 이들 물질이 축산물에 잔류하거나 또는 내성균을 출현시키는 등 여러가지 문제점이 대두되고 있다. 이에 따라, 최근 전세계적으로 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고, 대안으로서 비항생제적 방법으로 생균제가 주목받고 있다.
축산분야에서 생균제라 함은 미생물 자체를 가지고 만든 제제로서 가축의 장내에 정착하여 섭취한 사료의 소화와 흡수를 도와주며 가축의 성장을 촉진하고 사료 효율을 개선시켜주는 물질이다.
본 발명의 한 측면은 셀룰로오스 분해능이 우수한 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 셀룰로오스 분해능이 우수한 균주를 고체발효하여 생균제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 셀룰로오스 분해능이 우수한 균주를 고체발효하여 획득되는 생균제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 셀룰로오스 분해능이 우수한 생균제를 포함하는 가축용 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 11170P) 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 11170P) 균주를 고체발효하는 단계를 포함하는 생균제의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 방법에 의하면 상기와 같은 방법에 의해 제조된 생균제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 방법에 의하면 상기와 같은 방법에 의해 제조된 생균제를 포함하는 가축용 사료가 제공된다.
본 발명에 의하면, 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 균주를 획득할 수 있으며, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 내열성이 우수하므로 이를 생균제로 이용하는 경우 소화효율이 개선된 우수한 가공 사료를 획득할 수 있다.
도 1은 셀룰라아제 활성이 우수한 것으로 선발된 바실러스(Bacillus sp.) 6번 균주(NO6 균주)의 16S rRNA 서열을 계통분석 한 결과를 나타낸 것이다.
도 2 은 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 다양한 C/N 비율의 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 셀룰로오스 및 셀로비오스의 영향을 나타낸 것이다.
도 4은 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 질소원의 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 다양한 질소원의 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 발효 조건의 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 초기 수분량의 영향을 나타낸 것이다.
도 8는 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 인큐베이션 온도의 영향을 나타낸 것이다.
도 9은 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 초기 종균 접종수의 영향을 나타낸 것이다.
도 10는 NO6 균주의 고체발효에 있어서 셀룰라아제(CMCase) 생산량에 대한 발효 시간의 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 반추위 내 고체발효 산물에 있어서 인비트로(in situ) 건물 소화율을 나타낸 것이다.
도 12는 고체발효 산물에 따른 인큐베이션 배양 배지 내 pH의 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 고체발효 산물에 따른 인큐베이션 배양 배지 내 NH3-N 농도 변화를 나타낸 것이다.
본 발명에 의하면, 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)(KCCM 11170P) 균주가 제공된다.
상기 균주의 획득을 위해 먼저 조개젓에서 분리한 박테리아 균주(bacterial strains) 중 셀룰로오스 분해력을 보인 균주를 선발하였다. 총 15개의 균주 중 셀룰로오스 분해력을 보인 7개의 균주가 선발되었으며, 6번 균주의 경우 배양 속도가 빠르고 계대 배양에서도 일정한 셀룰라아제(CMCase) 활성을 보였기 때문에 최종적으로 선발하였다. 선발된 6번 균주로부터 16S rRNA를 추출하여 서열을 분석한 결과 이는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 99%의 유사성을 보였으며, 또한 MEGA 4 소프트웨어를 이용하여 진뱅크 데이터베이스(Gen Bank database)와의 비교를 통해 계통분석을 하여 이를 확인하였다(도 1). 이와 같이 획득한 6번 균주를 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하였으며, KCCM 11170P의 기탁번호를 부여 받았다.
이하 본 명세서에서 상기와 같이 최종적으로 선발된 본 발명의 균주를 "바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)" 또는 "NO6균주"라 한다. 본 발명의 바실러스 NO6 균주는 높은 셀룰라아제(CMCase) 생산량을 가지며, 내열성도 우수하여 생균제로 이용하는 경우 소화효율이 개선된 우수한 가공 사료를 획득할 수 있다.
본 발명의 균주를 이용한 생균제 제조방법은 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 11170P) 균주를 고체발효 하는 단계를 포함하여 수행된다.
고체발효는 낮은 수분 활력에 의해 오염균의 생장이 제한되므로 액상발효처럼 심각한 오염을 유발하지 않으며, 동일 균주로 액상발효와 고체발효로 효소를 생산하는 경우 기질 친화성이 높은 고체발효에 의한 효소가 높은 활성을 나타낸다. 또한, 고체발효 방법으로 생산된 효소는 액상발효에 의해 생산된 효소에 비해 별도의 공정이 필요하지 않아 안정성이 높고, 고체발효에서는 균주가 효소를 생산할 때 대사억제(catabolic repression)를 낮은 수준으로 제어 받아 더 많은 양의 효소가 발현이 된다. 나아가, 가공 중 폐수가 거의 발생하지 않고, 발효 잔여물들은 수분함량이 낮아 동물 사료나 비료로 활용이 가능하며, 고체발효에 이용되는 배지는 액상발효에 사용되는 인공합성배지에 비해 상대적으로 단순하고 가격이 저렴하다. 한편, 고체발효에서 요구되는 생산 설비는 액상발효에서 요구되는 생산설비에 비해 경제적이고, 고체발효 방법은 액상발효 방법에 비해 통기(aeration)나 온도를 조절하는데 사용되는 에너지도 비교적 낮게 요구된다.
상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지의 기질은 옥수수(Corn grain, CG), 밀기울(Wheat bran, WB), 및 대두박(Soybean meal, SBM)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 대두박, 또는 밀기울 및 대두박의 혼합물인 것이 바람직하다.
한편, 고체 원료 배지의 C/N 비율을 기준으로 고체 원료 배지의 조성을 선정하고 각 배지에서 균주 NO6에 대한 발효 특성 및 효소 활성을 평가한 결과, 상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지에 포함되는 최적 탄소(C)/질소(N)의 비율은 5.5 내지 10.5인 것이 바람직하다(도 2).
상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지에 포함되는 탄소원은 셀룰로오스 또는 셀로비오스인 것이 바람직하다(도 3).
본 발명의 NO6 균주의 경우 질소원으로 요소를 첨가하였을 때 셀룰라아제 활성이 현저하게 증가하는 효과를 확인할 수 있었으며(도 4), 따라서, 상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지는 요소를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
요소는 전체 배지의 총 중량을 기준으로 2 중량% 내지 8 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하며, 3 중량% 내지 5 중량%의 함량으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 약 4%의 요소 첨가 시 가장 현저하게 증가된 효소 활성을 확인할 수 있었으며, 요소 8%까지 첨가에서도 미생물적인 측면에서 발효에 불리한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 액상발효공정에서 질소원의 첨가량은 0.1% 수준(Lieckfeldt et al., 2000)이 보편적인 첨가수준이나, 본 발명에서는 고체발효의 경우 훨씬 더 많은 수준이 적절한 첨가수준인 것으로 나타났다.
사료에 단백질 원료로 가장 많이 사용되는 대두박(SBM)과 단백질 함량이 30% 수준으로 높은 루핀시드(LS)를 이용하여 셀룰라아제 활성 개선효과를 조사하였으며, 그 결과 대두박이 루핀시드에 비해 우수한 효소활성을 나타내었으나, 루핀시드는 기존 귀리, 옥수수 등에 비해 높은 효소활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 요소 첨가 시 기존 원료대비 최소 30% 이상의 효소활성 개선효과를 확인할 수 있었다(도 5).
본 발명의 NO6 균주는 p11균주의 혐기발효 공정에 비해 30%이상 높은 효소활성을 나타내어 혐기발효 공정에도 적합한 균주로서 혐기 조건에서도 높은 효소 활성을 나타내어 추후 대량생산 시 혐기발효 공정 개발에 사용될 수 있을 것이다(도 6).
고체배양 시 초기수분 함량은 미생물의 성장 및 관련 대사산물의 양을 결정하는 중요한 부분으로 초기 수분함량이 낮을 경우 미생물 성장에 저해를 받아 효소활성이 낮을 수 있으며, 너무 높을 경우 대량생산 시 원료이송 등의 문제가 발생될 수 있어 적정한 수분함량을 찾는 것이 중요하다.
이에 따라, 상기 본 발명의 고체 발효 단계에 이용되는 배지의 초기 수분 함량은 45% 내지 70%인 것이 바람직하고, 효소활성 분석결과 최적의 수분함량은 65%인 것으로 확인되었으나(도 7), 대량생산에서 초기 수분함량이 65%일 경우 원료배지의 공극이 없고 종균 접종 및 원료이송에 문제가 발생되어 공정지연 등 부수적인 문제가 발생될 수 있으므로 이를 고려하면 이보다 낮은 수분 함량을 적용할 수 있으며, 수분을 45~50%로 조정하는 것이 바람직하다.
상기 고체 발효 단계는 30 내지 45℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하고, 최적 발효온도는 약 35℃인 것으로 확인되었으며(도 8), 따라서 셀룰라아제 대량생산을 위한 최적 발효온도는 34~36℃이다.
고체 발효 단계의 초기 종균 접종량은 105 내지 107 CFU/g인 것이 바람직하며, 도 9를 참고하면 바실러스(B. subtilis) NO6 균주의 최적 종균접종 수준이 약 106 CFU/g에서 셀룰라아제 활성이 가장 높게 나타났다(도 9). 한편, NO6 균주의 경우 최적발효 시간은 60시간에서 가장 높은 효소활성을 보였다(도 10).
본 발명의 다른 견지에 의하면 상기와 같은 방법에 의해서 제조된 생균제가 제공되며, 본 발명에 따라 제조된 생균제는 기축용 사료 등에 적용될 수 있으며, 상기 생균제는 미생물 제제라고도 한다. 이에 따라 가축의 에너지 이용 효율을 최적화할 수 있는 안전하면서도 경제적인 사료의 제조가 가능하다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위를 하기 실시예로 한정하려는 것은 아니다.
I. 우수한 셀룰로오스 분해능을 갖는 미생물의 선발
1. 트리판 블루(Trypan blue)를 이용한 스크리닝 플레이트( screening plate ) 방법
조개젓에서 분리한 박테리아 균주(bacterial strains)를 트리판 블루(0.007%, w/v)를 첨가한 LB 아가(agar) 플레이트에서 배양하였다. 이 때 LB 배지는 0.4% (w/v)의 카르복시메틸셀룰로스(CMC)를 탄소원으로 포함하였다. 접종한 플레이트를 37℃의 배양기에서 하룻밤(overnignt) 동안 배양한 후 콜로니(colony) 주변에 트리판 블루의 색이 연해진 환이 형성된 균을 1차적으로 선발하였다. 총 15개의 균주 중 셀룰로오스 분해력을 보인 7개의 균주가 선발되었다.
선발된 균은 0.4% CMC를 함유한 영양액(nutrient broth)에서 배양하여 30% 글리세롤(glycerol)을 함유한 상태로 -80℃에 보관하였다.
2. DNS 시약을 이용한 셀룰라아제( CMCase ) 분석
1 차적으로 선발된 7개 균주의 정확한 셀룰라아제(CMCase) 활성을 측정하기 위해서 DNS 시약(reagent)(Miller, 1959; Ghose, 1987)을 이용하여 환원당의 양을 측정하였다. 선발된 균주를 0.4% 카르복시메틸셀룰로스(CMC)를 함유한 영양액에서 24시간 배양하였다. 이 배양액을 4℃에서 10분간 13000rpm으로 원심분리 하여 그 상층액을 세포 외 효소 조제(preparation)로 이용하였다. 준비된 효소를 0.05M 인산 칼륨 완충제(pH 6.6)와 혼합한 1% 카르복시메틸셀룰로스(CMC) 용액에 넣어 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 용액에 DNS용액을 첨가한 후 끓는 물에서 5분 동안 발색반응을 유도하였다. UV-VIS 분광광도계를 이용하여 540nm에서의 흡광도를 측정하였다. 포도당을 이용하여 표준곡선을 구하고 이를 이용하여 환원당의 양을 계산하였다. CMCase 활성 1U은 1분 동안 1μM의 환원당을 만들어내는 효소의 양으로 정의하였다.
6번 균주의 경우 배양 속도가 빠르고 계대 배양에서도 일정한 셀룰라아제(CMCase) 활성을 보였기 때문에 최종적으로 선발되었다.
3. 16S rRNA 서열 분석을 통한 균주의 동정( identification )
조개젓으로부터 분리한 그램-양성(Gram-positive) 박테리아인 6번 균주로부터 16S rRNA를 추출하여 서열을 분석하였고, 그 결과 6번 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 99%의 유사성을 보였으며, 나아가 MEGA 4 소프트웨어를 이용하여 진뱅크 데이터베이스(Gen Bank database)와의 비교를 통해 계통분석을 하였다 (도 1).
II . 고체발효를 통한 셀룰로오스 분해 효소의 생산 조건
1. C/N 비율에 따른 선발 균주의 고체발효 특성
고체 원료 배지의 C/N 비율을 기준으로 고체 원료 배지의 조성을 선정하고 각 배지에서 균주 NO6에 대한 발효 특성 및 효소 활성 평가를 통해 발효를 위한 기초 발효 배지를 선발하고자 하였다.
고체발효용 배지의 조성에 따른 C/N 비율 함량을 하기 표 1에 나타내었다. 고체발효용 원료로 사용한 원료의 C/N 비율은 5.5에서 21.1사이로, 이중 대두박과 소맥피를 혼합하여 C/N 비율 10.5를 구성하였다.
고체발효를 위해 액상 종균은 영양액 배지에 2% CMC를 첨가하여 35℃에서 24시간 배양 후 종균으로 사용하였다. 고체발효 조건으로 초기 수분함량을 45%로 고정하고, 종균 접종량을 고체배지의 1%(v/w, 발효 초기 균수는 1.0X106 CFU/g)를 첨가하였으며, 발효온도는 35℃, 발효시간은 60시간을 기준으로 하였다.
셀룰라아제(Cellulase) 활성은 카르복시메틸 셀룰라아제(Carboxylmethyl cellulose, CMC)를 기질로 하여 효소를 작용시켜 기질이 분해되어 생성되는 환원당(reducing sugar)을 정량하여 활성도를 측정하였으며, 분당 포도당 1 μmol에 해당하는 당을 유리하는 효소량을 1unit로 정의하였다.
탄소원 및 질소원
원료 SBM* SW* (SBM/WB)(6:4) Oat WB* 옥수수
C/N 비율 5.5 10.5 14.7 18.1 21.1
* SBM: 대두박(Soybean meal)
* WB: 밀기울(Wheat bran)
* SW: SBM+ WB
* Oat: 귀리
NO6 균주의 원료 조성 별 발효 실험 결과 48시간 및 60시간 발효에서 각 C/N 비율 별로 효소 활성에 차이가 있었으며, 최적 C/N 비율은 5.5~10.5사이인 것으로 확인되었다(도 2).
특히, C/N 비율 10.5인 SW배지(대두박/소맥피의 혼합배지)에서 60시간 발효 후 1,221U/g으로 가장 높은 효소활성을 나타내었다. 또한, 60시간 발효 후 최종 균 수는 모든 처리구에서 109 CFU/g 이상의 균 성장을 보여 발효 중 미생물 균 수는 C/N 비율에 큰 영향을 받지 않았다
2. 탄소원의 종류에 따른 고체발효 특성
탄소원의 첨가 효과를 알아보기 위해 고체발효 예비 실험을 진행하였으며, 기초 배지로는 SW 배지를 사용하고 기본 배지에 셀룰로오스 및 셀로비오스(cellobiose)를 각각 2, 2.5%씩 첨가하여 탄소원 첨가에 대한 영향을 조사하였다. 탄소원의 첨가 방법은 SW 배지에 셀룰로오스 및 셀로비오스를 각각 2.5%씩 분말 상태로 혼합하였으며, 종균 접종 후 35℃에서 60시간 발효를 진행하였다.
예비실험 결과 2.5%의 셀룰로오스 첨가의 경우 1,399.1 U/g으로 대조구 대비 9% 개선 결과를 통해 균주 NO6에 대한 셀룰라아제 활성 증가가능성을 확인하였다 (도 3).
3. 질소원의 종류에 따른 발효특성
셀룰라아제의 생산을 위해 혼합(SW)배지에 질소원의 첨가가 균수 및 효소활성에 미치는 영향을 조사하였다. 질소원으로는 옥수수 침지액(corn steep liquor, CSL), 펩톤(peptone), 요소(urea), 질산 암모늄(ammonium nitrate), 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 테스트 하였으며 각각 4%(0.04g/g)씩 혼합(SW)배지에 첨가하여 발효특성을 평가하여 도 4에 나타내었다. 고체 발효 조건은 수분 45%, 35℃에서 60시간으로 배양하였다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 요소의 첨가를 통해 효소 활성의 개선효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다. 발효 종료 후 미생물 균수는 모든 처리구에서 109 CFU/g이상의 균수를 확인하여 고체발효 시 요소 첨가로 인한 균수 저하 등의 문제점은 없는 것으로 확인되었다.
나아가, 질소원의 종류별 효소활성 개선효과가 우수하여 단백질원의 종류에 따른 개선효과를 조사하기 위해 사료에 단백질 원료로 가장 많이 사용되는 대두박(SBM)과 단백질 함량이 30% 수준으로 높은 루핀시드(LS)를 이용하여 셀룰라아제 활성 개선효과를 조사하였다.
대두박이 루핀시드에 비해 우수한 효소활성을 나타내었으나, 루핀시드는 기존 귀리, 옥수수 등에 비해 높은 효소활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 요소 첨가 시 기존 원료대비 최소 30% 이상의 효소활성 개선효과를 확인할 수 있었다(도 5).
질소원으로서 요소의 명확한 첨가수준을 판단하기 위해 1, 4, 8%의 요소 첨가수준에 대한 각 원료배지인 SW(SBM(대두박)+ WB(밀기울)), SBM(대두박, Soybean meal), LS(루핀시드)에 대한 효소활성 개선효과 및 미생물 발효특성을 조사하였다.
그 결과 요소의 최적 첨가수준은 모든 원료에서 동일하게 약 4%의 요소 첨가 시 증가된 효소 활성을 확인할 수 있었으며, 요소 8%까지 첨가에서도 미생물적인 측면에서 발효에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(표 2). 액상발효공정에서 질소원의 첨가량은 0.1% 수준(Lieckfeldt et al., 2000)이 보편적인 첨가수준이나, 본 발명에서는 고체발효의 경우 훨씬 더 많은 수준이 적절한 첨가수준인 것으로 확인하였다.
셀룰라아제 생산 및 미생물 성장에 있어서 요소 농도의 영향
배지 NO6 균주
셀룰라아제 활성(U/g) S. D. Log CFU/g
SW+요소(1%) 1,397.75 38.29 9.64
SW+ 요소(4%) 1,888.82 69.17 9.15
SW+ 요소(8%) 1,706.14 38.04 9.08
SBM+ 요소(1%) 1,168.23 69.17 9.15
SBM+ 요소(4%) 1,756.89 58.04 9.30
SBM+ 요소(8%) 1,687.54 58.29 9.18
LS+ 요소(1%) 1,342.75 82.02 9.36
LS+ 요소(4%) 1,635.67 95.77 9.32
LS+ 요소(8%) 1,508.57 87.21 9.04
4. 발효 형태에 따른 효소활성 변화
바실러스(B. subtilis) NO6 균주를 대상으로 대두박, 루핀시드, 혼합(SW)배지에 요소를 4% 첨가한 후 호기 발효 및 혐기 발효에 따른 발효특성을 조사하였다. 혐기 발효는 종균을 접종한 후 외부공기가 전혀 유입되지 않도록 완전 밀봉하여 35?에서 60시간 동안 진행하였다.
NO6 균주는 p11균주의 혐기발효 공정에 비해 30%이상 높은 효소활성을 나타내어 혐기발효 공정에도 적합한 균주로서 높은 효소활성을 나타내어 추후 대량생산 시 혐기발효 공정 개발에 사용될 수 있을 것으로 판단된다(도 6).
5. 고체배지의 초기 수분함량에 따른 발효특성
고체배양 시 초기수분 함량은 미생물의 성장 및 관련 대사산물의 양을 결정하는 중요한 부분으로 초기 수분함량이 낮을 경우 미생물 성장에 저해를 받아 효소활성이 낮을 수 있으며, 너무 높을 경우 대량생산 시 원료이송 등의 문제가 발생될 수 있어 적정한 수분함량을 찾는 것이 중요하다. 본 실험에서는 초기 수분함량을 30~75%수준으로 달리하고 배양온도를 35℃, 배양시간을 60시간으로 설정하여 고체발효를 수행였다(도 7).
효소활성 분석결과 최적의 수분함량은 65%인 것으로 확인되나, 대량생산에서 초기 수분함량이 65%일 경우 원료배지의 공극이 없고 종균접종 및 원료이송에 문제가 발생되어 공정지연 등 부수적인 문제가 발생될 수 있으므로 이를 고려하면 이보다 낮은 수분 함량을 적용할 수 있으며, 수분을 45~50%로 조정하는 것이 바람직하다.
6. 발효 온도에 따른 영향
바실러스(B. subtilis) NO6 균주 발효 시 최적의 발효온도를 설정하기 위해 30~45℃로 온도범위를 달리하여 60시간 발효를 통해 효소 활성 변화를 조사하였다.
발효 결과 NO6 균주의 최적발효 온도는 약 35℃인 것으로 확인되었으며(도 8), 따라서 셀룰라아제 대량생산을 위한 최적 발효 온도로는 NO6 균주는 34~36℃인 것으로 확인되었다.
7. 종균 접종량에 따른 효소활성 변화
초기 종균 접종수준을 104~107 CFU/g으로 달리하여 종균 접종수준이 셀룰라아제 효소활성에 미치는 영향을 조사하였다.
바실러스(B. subtilis) NO6균주의 최적 종균 접종 수준이 약 106 CFU/g에서 셀룰라아제 활성이 가장 높게 나타났다(도 9).
8. 최적 발효시간 설정
최적 발효시간을 설정하기 위해 바실러스(B. subtilis) NO6 균주를 혼합(SW) 배지에 접종하여 72시간까지 샘플링 및 분석을 진행하였다.
그 결과 NO6 균주의 경우 최적발효시간은 60시간에서 가장 높은 효소활성을 보였다(도 10).
V. 고상발효 생균제(미생물제제)의 인비트로 효능평가
1. 실험 재료 및 방법
건물 소화율과 여러 반추위 대사성상에 대해 알아보기 위하여 바실러스(B. subtilis) NO6 균주 고상발효(BS)와 대조구 고상발효를 배치 배양(batch culture)(Tilley and Terry, 1963) 방법으로 인비트로 배치 배지(batch culture) 건물 소화율 평가 및 성분 분석을 위한 실험을 진행하였다.
배양 시간 (0, 3, 6, 9, 12, 24, 48h) 에 맞춰 6: 4 비율의 일정한 양을 급여 받고 있는 홀스타인 거세우를 사용하였고, 8겹의 치즈클로스(cheesecloth)로 이물질을 걸러내고 반추위액을 채취하였다. 운반된 반추위액을 McDougall 완충제와 1:4 비율로 교반한 후 CO2 로 혐기 상태를 15분간 유지시켰다. 바실러스(B. subtilis) NO6 균주 고상발효물 1g의 시료가 들어간 60ml 세럼병(serum bottle) 안에 25ml의 교반된 반추위액과 McDougall 완충제를 넣고 곧바로 고무와 알루미늄 뚜껑으로 병을 봉하였다. 각 샘플마다 3번 반복으로 진행하였고, 0, 3, 6, 9, 12, 24, 48 h 으로 39°C 인큐베이터에 보관하였다.
각 시간 별로 샘플을 꺼내어 원심분리기에 3000rpm으로 15분 동안 진행한 후 pH 미터(meter)(Delta 340, Mettler Toledo co.)를 이용해 pH를 측정하였다. 상등액은 NH3-N 나 VFA(Volatile fatty acid)를 분석하기 위해 1.5ml 튜브에 옮겼다.
NH3-N 분석은 (Chaney and Marbach, 1962) 비색(colorimetric) 분석 방법을 사용하였고, UV 분광광도계(spectrophotometer)(UV-1601PC, Shimadzu co.)를 농도 측정에 사용하였다. VFA 분석은 샘플 상등액이 담긴 1.5ml 튜브에 200ul 메타인산(metaphosphoric acid)을 첨가하고 실리카 모세관 컬럼(silica capillary column)(30 × 0.25mm × 0.25um, Supelco)을 사용한 기체 크로마토그래피(Agilent Tech. co.)로 분석하였다. 병 안에 있는 시료들은 필터 종이(filter paper)(110mm, 22um pore size)로 필터링을 하고 65°C 건조기에 48 시간 동안 건조시킨 후 각각의 샘플의 무게를 측정하여 건물 소화율을 도출하였다.
실시간(Real time) PCR 정량을 위해 고상발효 산물(Product)을 첨가한 인비트로(in vitro) 반추위 시료(rumen sample)를 액체 질소로 얼린 후 그라인더로 분쇄하고 CTAB 추출 완충제(extraction buffer)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다 (CTAB DNA extraction protocol from Quagen Corp. for higher plant DNAs를 참조).
분리된 DNA를 주형으로 하고, 표적 반추위 박테리아(target rumen bacteria)의 16s 리보좀(ribosomal) RNA 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 총 DNA 에 존재하는 미생물의 `탐지하였다. 그리고 KAPA SYBR mix. 와 LightCycler 480을 이용하여 PCR 증폭 산물의 형광 정도를 측정하고 이를 통하여 미생물 군집의 정량을 실시하였다.
정량을 실시할 표적 박테리아로는 피브로박터 숙시노겐( Fibrobacter succinogens ), 루미노코쿠스 알부스( Ruminococcus albus ), 루미노코쿠스 플라브펙신( Ruminococcus flavefaciens ), 유박테륨 루미난튬(Eubacterium ruminantium ), 메타노겐(Methanogen), 프리보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola), 루미노박터 아밀로필루스(Ruminobacter amylophilus ), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis)를 설정하였다.
검량선은 표적 미생물의 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(easy vector)에 삽입한 것을 DNA농도와 플라스미드 카피 수(copy number)를 고려하여 10배씩 단계 희석해서 사용하였다. 희석한 플라스미드 DNA에서 검출되는 형광물질의 교차 점(crossing point)을 기준으로 하여 총 DNA에 존재하는 각 표적 박테리아의 log 카피 수를 1ml 혹위액(rumen fluid)의 당량으로 표시하였다.
데이터 통계분석은 Statistical analysis system (SAS, 2002)의 ANOVA 로 분석하였고 평균간의 차이는 Tukey Test (Snedecor and Cocharn, 1967)로 분석하였다.
식이의 화학 조성(DM(dry matter) 기준%)
티모시(Timothy)(%) 농후사료(%)
건물(dry matter) 90.42 86.61
조질의 단백질 8.13 14.09
에테르 추출물 1.70 5.14
조질의 섬유질(fiber) 37.54 6.94
조질의 회분(ash) 6.02 4.77
ADF 41.82 10.29
NDF 71.49 20
헤미셀룰로오스 29.67 9.71
리그닌 0.48 0.44
실리카 1.02 0.05
Ca 0.90 0.75
P 0.66 0.35
상기 표 3에서 티모시를 섬유질 사료원료로 사용하였고, 농후사료를 단백질 사료원료로서 사용했으며 두 가지 사료를 혼합하여 실험용 사료원료로서 사용하였다.
Macdougall 완충제 조성
화합물 양 ( / 1.5L)
NaHCO3 11.76 g
Na2HPO4.2H2O 5.544 g
KCl 0.684 g
NaCl 0.564 g
MgSO47H2O 0.045 g
4% CaCl2 용액 1.2 ml
상기 표 4의 각 성분은 1.5L 당 들어가는 화합물의 양으로 나타내었다.
2. 결과
①건물 소화율
인비트로(In vitro) 건물 소화율의 곡선을 도 11에 도시하였으며, 전반적으로, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)가 대조구에 비해 10% 이상의 유의적으로 높은 소화율을 나타내었다.
② 반추위 내 발효 특성
도 12에 나타난 바와 같이 pH 농도는 12h부터 48h까지 유의적으로 차이를 보이면서 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)가 대조구에 비해 높은 결과를 나타내었다.
NH3-N 농도는 다음 도 13에 나타난 바와 같이 0h에서 3h까지 큰 변화가 없다가 6h에서 48h 동안 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)와 대조구에서 20% 이상의 현저한 차이를 나타내었다.
인비트로 반추위 대사성상은 하기 표 5에 기재하였다. 대조구와 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)에서 아세트산과 프로피온산의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나 이소-부티르산(iso-butyric acid), 이소발레르산(iso-valeric acid)을 포함한 부티르산 발레르산에서 대조구에 비해 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)에서 유의적으로 높은 수치를 보였다. 이에 따라, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)의 총 VFA 함량에서도 대조구에 비해 유의적으로 높은 결과를 확인할 수 있었다.
고체발효 산물에 따른 인큐베이션 배양배지 내 반추위 pH, VFA 농도(mMol/L), 및 NH3-N(mg/100ml)
처리 SEM P 값
대조구 BS
VFA (mM)
아세트산(A) 47.04 48.86 0.61 0.151
프로피온산(P) 27.82 28.60 0.34 0.300
이소부티르산 0.57b 2.29a 0.39 0.001
부티르산 10.21b 10.79a 0.16 0.041
이소발레르산 0.90b 3.32a 0.54 0.001
N-발레르산 1.21b 2.09a 0.20 0.001
총 VFA 87.76b 95.96a 2.03 0.013
A : P 비율 2.26 2.25 0.01 0.532
PH 6.04b 6.52a 0.11 0.001
NH3-Nmg/100ml 8.21b 19.66a 2.58 0.0001
③ 소결
인비트로 소화율 실험의 결과 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS) 처리구가 상대적으로 대조구보다 월등히 유의적인 차이를 나타내었다(P<0.05). 뿐만 아니라 휘발성 지방산(VFA)에서도 많은 차이를 보였다. 이러한 이유는 고상발효 제조의 배양시간 동안 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS)를 첨가한 BS 처리구에서 섬유소 분해가 유도되고 기질 안에 많은 대사산물들을 생산하였기 때문이다.
그러나 pH 농도는 인비트로 건물 소화율과 반대의 결과를 보였는데 이러한 이유는 본 발명의 바실러스 서브틸리스 NO6 (Bacillus subtilis NO6)(BS) 처리구의 NH3-N 농도가 대조구에 비해 현저한 차이를 보였고, 이것이 알칼리성으로 pH 농도를 높이는데 작용을 했기 때문인 것으로 해석된다.
VI . 고상발효 생균제(미생물제제)의 인비보 효능평가
1. 육계사료 내 섬유소 분해활성이 우수한 미생물제제의 급여가 성장 성적, 도체중 및 장내균총에 미치는 영향
(1) 실험 재료 및 방법
실험에 사용한 공시동물은 로스(Ross) 종의 육계 수평아리이며, 총 5주 동안 NO6 균주의 고상발효물을 급이하였다. 실험 설계는 4 처리구씩 6 반복으로 하며, 반복 당 20수씩 급이하여, 총 480수의 실험 규모로 진행하였다. 처리구에 대한 설명은 표 6과 같다.
- 공시동물 : Ross 육계 수평아리
- 사육기간 : 총 5주
- 실험설계 : 4처리 × 6반복 × 반복당 20수 = 총 480수 공시
처리구 비 고
비교예 1 (음성대조구) 효소 무처리구(일반 사료)
비교예 2 (양성대조구) 시판되고 있는 사료용 셀룰라아제 (이두어자임, 광동 VTR 제조)
실시예 1 (0.1%) 셀룰라아제 1,500 unit/g, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis NO6) 10^6 cfu/g 제품
(2)결과
하기 표 7에 나타난 바와 같이 실험1에서 본 발명의 발효 효소(fermentation enzyme)(NO6 균주로 고체 발효한 고체발효물)를 0.1, 0.2% 첨가한 효과는 실험 개시 후 29일 내지 35일 사이의 증체량이 본 발명의 처리구에서 유의적인 증가를 보였고, 이로 인해 전체 실험기간 동안의 증체량이 처리구에서 증가함을 확인하였다.
Items 비교예 1 실시예 1 비교예 2 SEM P-value
체중, g/bird
29일 1693.23 1756.47 1700.90 20.20 0.1988
36 일 2169.44c 2327.84a 2255.13b 9.58 0.0001
Feed Intake, g/bird/day
22~28 일 168.70 180.43 178.28 3.92 0.1007
29~35 일 163.11 178.02 170.41 5.73 0.3522
22~35 일 165.90 179.25 174.35 3.41 0.0697
2~35 일 110.04 114.65 114.08 2.74 0.3833
Body Weight Gain, g/bird/day
22~28 일 102.51 103.57 100.09 2.98 0.8618
29~35 일 68.03b 81.62a 79.18a 2.34 0.0150
22~35 일 85.27 92.60 89.64 2.34 0.2619
2~35 일 62.60c 67.26a 65.12b 0.50 0.0013
Feed Conversion Ratio
22~28 일 1.65 1.74 1.78 0.04 0.0935
29~35 일 2.42 2.18 2.15 0.13 0.5266
22~35 일 1.95 1.94 1.94 0.04 0.8254
2~35 일 1.76 1.70 1.75 0.03 0.3073
1비교예 1: 기초 사료
비교예 2: 기초 사료 + 0.1% 시판 효소
실시예 1: 기초 사료 + 0.1% 본 발명의 발효 효소
2각 수치는 평균 값을 나타낸 것(각 그룹 당 n = 3).
2. 섬유소 분해활성이 우수한 미생물 제제의 강제급여를 통한 소화율 측정
(1)실험 방법
Hy-Line 갈색 수컷 산란계를 실험동물로 공시하여 절식구를 포함하여 처리구별 6수, 반복 당 1수씩을 완전임의 배치하여 시험하였다. 배합한 사료를 하기와 같은 각 처리구별로 30g씩 강제 급여하였다.
실시예 1: 기초 사료 + 0.1% 본 발명의 발효 효소
비교예 1: 기초 사료
비교예 2: 기초 사료 + 0.1% 시판 효소
비교예 3: 절식구
(2)사양 관리
공시계는 가로x세로x높이가 각각 45×62×66 cm인 3단 철제 케이지에 케이지당 1수씩 배치하여 실험을 실시하였다. 실험 전 24시간 동안 절식시킨 후 강제급여를 실행한 후 24 시간 동안 나오는 배설물을 채취하였다. 니플의 숫자는 반복구별로 동일하게 배치하였다. 점등은 16L: 8D로 일정하게 유지하였다.
(3) 진정 대사 에너지(TME, TMEn)
TME 측정을 위해 Sibbald(1976)가 제안한 강제 급여 방법을 사용하여 실시하였다. 강제 급여를 시작하기 직전에 24 시간 동안 절식시켰다. 그 후 배합된 사료를 각각 30g씩 강제 급여시킨 후 24 시간 동안 배설된 모든 배설물을 채취하였다. 또한 기초 대사량 측정을 위하여 절식구를 배치하였다. 채취된 모든 배설물은 깃털과 이물질 등을 제거한 후 60도℃에서 24시간 동안 건조시키고 분쇄하여 분석에 이용하였다.
각 사료와 배설물을 건조 후 bomb calorimeter를 사용하여 gross energy를 측정하여 대사에너지를 계산한 후 사료에 기인되지 않은 대사성분에너지와 마멸된 장점막, 담즙, 소화액 등의 에너지를 포함한 내인성 뇨에너지를 보정하여 TME 값을 계산하였다. TMEn 값은 질소가 체내에서 0인 상태로 보정하여 체내 축적에 의한 배설물의 변이를 줄여 준 것이다.
TME(kcal/g)의 계산식은 Sibbald 방법에 준하였고 질소 보정 상수는 8.73(Titus 등, 1959)을 사용하였다.
TME의 계산식은 다음과 같다.
TME(kcal/g)=[(GEi * X)-(EEf - EEe)]/x
GEi = 섭취한 총 사료 에너지(kcal/g)
EEf = 사료를 섭취한 배설물 에너지(kcal/g)
EEe = 대조구의 배설물 에너지(endogenous) (kcal/g)
X = 사료 급여량(g)
TMEn의 계산식은 다음과 같다.
TMEn(kcal/g)={GEi -[EEf + (Ni - Ne)*8.73] + [EEe + (Ni - Ne)*8.73]}/X
GEi = 섭취한 총 사료 에너지(kcal/g)
EEf = 사료를 섭취한 배설물 에너지(kcal/g)
EEe = 대조구의 배설물 에너지(endogenous) (kcal/g)
Ni - Ne = Nitrogen balance (N 섭취량 - N 배설량)
X = 사료 급여량(g)
(4)결과
표 9에 나타난 바와 같이 스타터(Starter) 와 피니셔(Finisher) 사료에 있어서 진정 대사에너지는 대조구와 처리구 사이에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 하지만 그 이용효율에 있어서 처리구에서 증가하는 경향을 보였고, 특히 본 발명의 발효 효소를 0.1%를 첨가한 처리구에서 가장 큰 폭의 증가를 나타냈다.
kcal/g 비교예 1 실시예 1 비교예 2
Starter 2513.7 2554.65 2539.84
79.8% 81.1% 80.63%
Finisher 2546.56 2588.8 2578.24
79.58% 80.90% 80.57%
1비교예 1: 기초 사료
비교예 2: 기초 사료 + 0.1% 시판 효소
실시예 1: 기초 사료 + 0.1% 본 발명의 발효 효소
한국미생물보존센터 KCCM11170P 20110208

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 셀룰로오스 분해능이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(KCCM 11170P) 균주를 배지의 초기 수분 함량 45% 내지 65%의 조건에서 고체발효하는 단계를 포함하는 생균제의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지의 기질은 대두박 또는 밀기울과 대두박의 혼합물인 생균제의 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지에 포함되는 탄소/질소의 비율은 5.5 내지 10.5인 생균제의 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지에 포함되는 탄소원은 셀룰로오스 또는 셀로비오스인 생균제의 제조방법.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계에 이용되는 배지는 요소를 추가로 포함하는 생균제의 제조방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 요소는 전체 배지의 총 중량을 기준으로 2 중량% 내지 8 중량%의 양으로 포함되는 생균제의 제조방법.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계는 혐기 조건에서 이루어지는 생균제의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계는 30 내지 45℃의 온도에서 수행되는 생균제의 제조방법.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 고체 발효 단계의 초기 종균 접종량은 105 내지 107 CFU/g인 생균제의 제조방법.
  12. 제 2항 내지 제8항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 의해서 제조된 생균제.
  13. 제 2항 내지 제8항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 의해서 제조된 생균제를 포함하는 가축용 사료.
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