CN113502249A - 一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应用方法 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌HTGC‑10及其产β‑甘露聚糖酶的发酵方法，从而解决产β‑甘露聚糖酶菌株的安全隐患，满足饲料生产对益生菌的需要，方法是，将解淀粉芽孢杆菌HTGC‑10接入种子培养基，25‑30℃，培养18‑20h成种子液，然后，将种子液按发酵培养基体积3%的接种量接种到发酵培养基中，28‑30℃，190r/min摇床培养20‑22h，产酶活性达到85.35U/mL，即为产β‑甘露聚糖酶的发酵液，喷雾干燥，制备β‑甘露聚糖酶干粉，应用时，以β‑甘露聚糖酶干粉计，每1kg饲料中加入β‑甘露聚糖酶干粉500‑1000mg；本发明可有效用于发酵高产β‑甘露聚糖酶，可安全用于畜禽饲料，既开拓了β‑甘露聚糖酶高产菌株的种质资源，又为饲料的安全生产提供了所需的益生菌β‑甘露聚糖酶。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应 用方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应用方法。
背景技术
随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们对畜禽产品的需求数量和质量不断提高，从而带动了养殖业和饲料业的快速发展，同时也引起一系列诸如饲料资源短缺和畜牧养殖业的环境污染等问题。这就要求在畜禽养殖中既要提高现有资源的养分利用率、开发新的饲料资源，又要注重减少环境污染。
畜禽饲料多为玉米、小麦、豆粕、棉粕等植物性原料，其中的甘露聚糖（分为甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖四大类）是植物细胞壁的主要组分，也是除木聚糖外含量最高的半纤维素，在豆科植物产品（如豆粕）中，半乳甘露聚糖占碳水化合物总量的20％。甘露聚糖是一类抗营养因子，溶解后有很高的黏性，食物中的甘露聚糖在消化道中会增加食糜的黏度，从而降低食糜通过消化道的速度，影响养分的吸收；严重阻碍肠道机械混合内容物的能力，减少消化酶与饲料中营养物质接触的机会，影响钙、锌等离子和有机质养分的吸收；改变肠道微生物菌群的组成，增加畜禽腹泻率进而影响动物健康，抑制动物生长。
β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC3.2.1.78)是一类能够水解以β-1,4-D-甘露糖苷键连接的四类甘露聚糖的半纤维素酶类，水解产物为单糖以及2-10个单糖分子构成的甘露寡糖，是甘露聚糖水解的关键酶类。因此，β-甘露聚糖酶应用于饲料工业，可以显著降低肠道粘度，消除饲料中甘露聚糖对各种营养成分如能量、蛋白、纤维素、金属离子等消化和吸收的干扰，极大提高饲料的利用率；产生的甘露寡糖还可以促进动物肠道中的有益菌如双歧杆菌等的定殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌群的生长，改善肠道微生态及动物健康状况，从而减少抗生素等化学药物的使用，甘露寡糖还能够吸附真菌毒素；同时，β-甘露聚糖酶本身还是一种多功能促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，从而促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进动物生长；还能减轻畜禽排泄物对环境的污染。随着饲料全面限抗，β-甘露聚糖酶更是很有前途的抗生素替代产品，市场广阔，潜力巨大。
β-甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，微生物是其最主要的生产来源。虽然目前国内外已有很多通过分子技术手段使β-甘露聚糖酶异源表达水平大大提高的报道，但现有的微生物β-甘露聚糖酶因生物安全性问题，限制了其在饲料生产领域的应用。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有耐高温、耐酸碱、稳定性高、生长繁殖迅速、抗逆性强及对培养条件要求较低等特点，且安全无毒，能抑制多种致病菌的生长，保证宿主健康，因此在疾病防制、饲料生产、提高动物生产性能等方面有广阔的应用前景，是一种非常理想的生物饲料添加剂。筛选自然界中的解淀粉芽孢杆菌资源，寻找新的β-甘露聚糖酶高产菌株，获得安全性高的β-甘露聚糖酶生产菌株，从而实现生产菌株与代谢产物混合应用，简化酶的纯化过程，以较低的成本获得更大的工业效益并发挥额外的益生功能，是业界正在努力解决的技术问题，但至今还未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵方法，从而解决产β-甘露聚糖酶菌株的安全隐患，满足饲料生产对益生菌的需要。
本发明一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2021年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22074，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10在制备产β-甘露聚糖酶发酵液中的应用；
所述的β-甘露聚糖酶在饲料中的应用；
所述的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10产β-甘露聚糖酶发酵液的发酵应用方法是，将解淀粉芽孢杆菌HTGC-10接入种子培养基，25-30℃，培养18-20h成种子液，然后，将种子液按发酵培养基体积3%的接种量接种到发酵培养基中，28-30℃，190r/min摇床培养20-22h，产酶活性达到85.35U/mL，即为产β-甘露聚糖酶的发酵液，喷雾干燥，制备β-甘露聚糖酶干粉，应用时，以β-甘露聚糖酶干粉计，每1kg饲料中加入β-甘露聚糖酶干粉500-1000mg；
所述的种子培养基是由蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 5g加蒸馏水至1000mL制成；
所述的发酵培养基由质量计：魔芋粉2%、酵母粉2%、KH2PO4 0.4%、MgSO4 0.03%和余量为水混匀，121℃灭菌15min。
本发明是新筛选的一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10，可有效用于发酵高产β-甘露聚糖酶，可安全用于畜禽饲料，既开拓了β-甘露聚糖酶高产菌株的种质资源，又为饲料的安全生产提供了所需的益生菌β-甘露聚糖酶，有巨大的经济和社会效益。
附图说明：
图1为本发明的pH对β-甘露聚糖酶活力的影响曲线图；
图2为本发明β-甘露聚糖酶的pH稳定性曲线图；
图3为本发明的反应温度对β-甘露聚糖酶活力的影响曲线图；
图4为本发明β-甘露聚糖酶温度稳定性曲线图；
图5为本发明的EDTA和金属离子对β-甘露聚糖酶活力的影响标示图；
图6为本发明的碳源筛选标示图；
图7为本发明的氮源筛选标示图；
图8为本发明的发酵培养基初始pH对产β-甘露聚糖酶活力的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明。
本发明的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10，是从河南省南阳西峡县后塘沟村魔芋生产基地的土壤中，筛选出的一株高产β-甘露聚糖酶的解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2021年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22074，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该菌株具有发酵产β-甘露聚糖酶活力高之功能，菌株通过液体种子培养，再转接发酵液进行发酵培养，生产出高活力β-甘露聚糖酶，酶学性质好，安全性高，可直接用于饲料，其具体发酵方法是，所述的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10产β-甘露聚糖酶发酵液的发酵应用方法是，将解淀粉芽孢杆菌HTGC-10接入种子培养基，28℃，培养19h成种子液，然后，将种子液按发酵培养基体积3%的接种量接种到发酵培养基中，29℃，190r/min摇床培养21h，产酶活性达到85.35U/mL，即为产β-甘露聚糖酶的发酵液，喷雾干燥，制备β-甘露聚糖酶干粉，应用时，以β-甘露聚糖酶干粉计，每1kg饲料中加入β-甘露聚糖酶干粉800mg；
所述的种子培养基是由蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 5g加蒸馏水至1000mL制成；
所述的发酵培养基由质量计：魔芋粉2%、酵母粉2%、KH2PO4 0.4%、MgSO4 0.03%和余量为水混匀，121℃灭菌15min。
本发明的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10是从河南省南阳西峡县后塘沟村魔芋生产基地的土壤中，筛选出一株产β-甘露聚糖酶的解淀粉芽孢杆菌，具有产β-甘露聚糖酶高活力高的特性，可有效用于产β-甘露聚糖酶的发酵应用，及畜禽喂养饲料中应用，并经实验，取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
1、菌株的筛选：
2020年5月从河南省不同魔芋生产基地的土壤中筛选菌株，最终确定为从河南省南阳西峡县后塘沟村魔芋生产基地的土壤中，筛选出的一株高产β-甘露聚糖酶的解淀粉芽孢杆菌，具体情况是：
称取10g土壤样品于含有玻璃珠的富集培养基(100mL/250mL三角瓶)中，30℃，180r/min摇床30min，打散土壤，沸水浴5min，以杀死大多数不耐热细菌，流水冷却后，30℃，180r/min摇床培养24h，将富集培养液用无菌水梯度稀释，涂布于初筛分离培养基平板上，倒置于30℃培养箱中培养24-48h，记录透明圈直径与菌落直径之比（D/d），作为菌株产β-甘露聚糖酶能力的初步检测标准；将初筛得到的菌株接入种子培养基培养18h，后按3%的接种量转接到发酵培养基中，30℃、180r/min摇床培养24h，4℃、10000r/min离心10min，收集上清液，用DNS法测定上清液β-甘露聚糖酶活力，进行复筛，选取发酵液β-甘露聚糖酶活性最高的菌株HTGC-10。
菌株HTGC-10经ZYM和API 50CHB生理生化试验结果见表1和表2
表1.HTGC-10的ZYM生化反应表
接触酶Contact enzymes HTGC-10 strain 接触酶Contact enzymes HTGC-10 strain
碱性磷酸酶 + 萘酚-AS-BI-磷酸水解酶 +
酯酶（C4） + <i>α</i>-半乳糖甙酶 -
类脂酯酶（C8） + <i>β</i>-半乳糖甙酶 -
类脂酶（C14） - <i>β</i>-糖醛酸甙酶 -
白氨酸芳胺酶 - <i>α</i>-葡萄糖甙酶 +
缬氨酸芳胺酶 - <i>β</i>-葡萄糖甙酶 +
胱氨酸芳胺酶 - N-乙酰-葡萄糖胺酶 -
胰蛋白酶 - <i>α</i>-甘露糖甙酶 -
胰凝乳蛋白酶 + <i>β</i>-岩藻糖甙酶 -
酸性磷酸酶 + 　
+表示阳性或生长，-表示阴性或不生长。
表2 HTGC-10的API 50CHB生化反应表
碳水化合物carbohydrate HTGC-10 strain 碳水化合物carbohydrate HTGC-10 strain
丙三醇（GLY） + 水杨苷（SAL） +
赤藻糖醇（ERY） - 木糖醇（XLT） -
D-阿拉伯糖（DARA） - D-麦芽糖（MAL） +
L-阿拉伯糖（LARA） + D-乳糖（LAC） +
D-核糖（RIB） + D-密二糖（MEL） +
D-木糖（DXYL） + D-蔗糖（SAC） +
L-木糖（LXYL） - D-海藻糖（TRE） +
D-核糖醇（ADO） - D-来苏糖（LYX） -
山梨醇（SOR） + D-松三糖（MLZ） -
D-半乳糖（GAL） - D-棉子糖（RAF） +
D-葡萄糖（GLU） + 淀粉（AMD） -
D-果糖（FRU） + 糖原（GLYG） -
D-甘露糖（MNE） + D-岩藻糖（DFUC） -
L-山梨醇（SBE） - L-岩藻糖（LFUC） -
L-鼠李糖（RHA） - 2-酮基葡萄糖酸钾（2KG） -
肌醇（INO） + D-甘露醇（MAN） +
N-乙酰葡萄糖胺（NAG） - 5-酮基葡萄糖酸钾（5KG） -　
+表示阳性或生长，-表示阴性或不生长。
16S rDNA测序鉴定：
提取菌株HTGC-10的基因组DNA，用16S rDNA基因通用引物PCR扩增；得到的PCR产物进行测序，其测序结果如下：
cggctggctc ctaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt 180
gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420
cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg 480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600
agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca 720
gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac 780
acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctcccc 840
ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca 900
ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960
gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt tgaacggcac ttgttcttcc1020
ctaacaacag agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag1080
actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc1140
tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc1200
cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca1260
ccttttatgt ctgaaccatg cggttcagac aaccatccgg tattagcccc ggtttcccgg1320
agttatccca gtcttacagg caggttaccc acgtgtt 1357
经16S rDNA Blast分析，结合ZYM和API 50CHB生理生化试验结果（表1、2），确定HTGC-10为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2021年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22074，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2、本发明对HTGC-10所产β-甘露聚糖酶相关条件及酶学性质进行研究、实验，有关资料如下：
β-甘露聚糖酶活力测定，按照国标GB/T 36861—2018《饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法》。β-甘露聚糖酶活力单位：在37℃、pH值为5.5条件下，每分钟从质量浓度为3mg/mL甘露聚糖溶液中释放1µmol还原糖所需要的酶量，为1个酶活力单位（U）。
1）、反应pH对β-甘露聚糖酶活力的影响：采用不同缓冲体系配成一系列浓度0.1mol/L的缓冲液，缓冲体系和pH范围分别为：甘氨酸-HCl缓冲液（pH3.0）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.0、5.0）、磷酸钠缓冲液（pH6.0、7.0、8.0）、甘氨酸-NaOH缓冲液（pH9.0、10.0）。底物甘露聚糖（Sigma）分别用上述不同pH的缓冲液配制后，在pH3.0-10.0反应体系下，37℃保温30min，测定β-甘露聚糖酶活力。
酶反应pH对β-甘露聚糖酶活力的影响见图1。由图1可知，在pH3.0～6.0时，随着pH值的升高，酶活力迅速升高，并在pH为6.0时其酶活达到最高，为54.94U/mL；而在pH6.0～10.0时，酶活力随着pH的升高则逐渐下降，在pH10.0时的酶活力仅为pH6.0时的2.7%，说明该酶的最适反应pH值为6.0，偏酸性，适合在弱酸性的条件下发挥作用。
2）、β-甘露聚糖酶pH耐受性：将酶液分别与不同pH缓冲液混合，37℃下保温2h后，在37℃、pH值5.5条件下，反应30min，测定β-甘露聚糖酶活性，以不与缓冲液混合保温的样品酶活性为对照，测定β-甘露聚糖酶剩余相对酶活力。结果见图2，由图2可知，在pH3.0、5.0-9.0保温后，剩余相对酶活力均在60%以上，表明酶在该pH范围内时，活性相对稳定，即菌株HTGC-10所产β-甘露聚糖酶pH稳定性较好，可耐受一定的酸性和碱性环境。
3）、不同反应温度对β-甘露聚糖酶活力的影响：在pH5.5的反应体系中，分别在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70℃）下反应30min，测定β-甘露聚糖酶活力，结果见图3。由图3可知，当反应温度在30～55℃时，随温度的升高，酶活力逐渐升高，并在温度55℃时β-甘露聚糖酶活力达到最高；而当反应温度＞55℃时，酶活力随温度的升高迅速下降，70℃时的酶活力仅为55℃的15.1%。因此，菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶的最适反应温度为55℃。
4）、β-甘露聚糖酶温度耐受性：酶液在pH5.5 0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液体系中，分别在不同温度（40、45、50、55、60、65、70℃）下，保温30min后，立即冰水浴冷却，后按GB/T 36861—2018的方法，测定不同温度处理后的剩余相对酶活力（用未经温度处理的酶液作对照）。结果见图4，由图4可知，该酶在40℃时相对稳定，保温30min后剩余酶活力为原酶活力的82.1%，但随着温度的升高，酶活力迅速下降，在45℃条件下保温30min后，活力为原酶活力的24.3%，后随着温度的升高，酶活力继续下降，在温度达到55℃以上保温30min后，β-甘露聚糖酶几乎完全失活。因此，本试验筛选菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶的热稳定性相对较差。
4）、金属离子和乙二胺四乙酸(EDTA)对酶活力的影响：在GB/T 36861—2018方法的酶反应体系中，分别加入金属离子（Na+、K+、Mn2+、NH4 +、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Li+、Ca2+、Co2+）和EDTA溶液（使终浓度为2.5mmoL/L），测定样品的β-甘露聚糖酶活力，对照不添加任何金属离子和螯合剂（见图5），由图5可知，EDTA对酶活有显著的抑制作用，与对照组相比，酶活力下降了24.3%；金属离子Li+和Co2+对酶活力基本没有影响；其余金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4 +、Mg2 +、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著，加入Cu2+后，酶活力仅为对照组酶活力的11.9%。
5）、本发明对HTGC-10产β-甘露聚糖酶的生产工艺进行了优化，具体实施方法如下：
不同碳源、氮源、金属离子、发酵pH对产β-甘露聚糖酶的影响：
a、碳源对酶产量的影响：在含有蛋白胨8g/L，pH7.2的培养基中,分别加入10g/L魔芋粉、瓜儿豆胶、刺槐豆胶、玉米淀粉，灭菌，按3%的接种量转接到发酵培养基中，29℃、190r/min摇床培养24h，测定β-甘露聚糖酶活性，结果见图6。
从图6.可知，魔芋粉效果最好。
b、氮源对酶产量的影响，在含有魔芋粉10g/L，pH7.2的培养基中，分别加入8g/L的蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、豆粕粉、氯化铵、硝酸铵，灭菌后按3%的接种量转接到发酵培养基中，29℃、190r/min摇床培养24h，测定β-甘露聚糖酶活性，结果见图7。
从图7可知，酵母粉效果最好。
c、碳氮源和金属离子对产酶的影响采用正交试验的方法，正交试验设计见表3和表4，灭菌后按3%的接种量转接到发酵培养基中，30℃、180r/min摇床培养24h，测定β-甘露聚糖酶活性，结果见表4。
由表4可知，对发酵液β-甘露聚糖酶活力影响的主次因素依次为魔芋粉＞KH2PO4＞MgSO4＞酵母粉，经正交试验分析，最佳组合为A3B2C1D2，即菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶活的最佳培养基配方为魔芋粉2%，酵母粉2%，KH2PO4 0.4%，MgSO4 0.03%。
表3. 发酵培养基碳氮源和无机盐添加量正交试验因素水平
水平 A魔芋粉 B酵母膏 C KH<sub>2</sub>PO4 D MgSO<sub>4</sub>
1 1% 1.50% 0.40% 0.025%
2 1.5 2 0.5 0.03
3 2 2.5 0.6 0.035
（注：表中，A、B、C和D分别表示魔芋粉、酵母膏、KH2PO4和MgSO4 4个因素；1、2、3分别表示各个因素的3个不同添加量水平）
表4. 发酵培养基碳氮源和无机盐添加量正交试验结果
试验编号 A魔芋粉 B酵母膏 C KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> D MgSO<sub>4</sub> 酶活
Ⅰ 1 1 1 1 44.57289
Ⅱ 1 2 2 2 43.92898
Ⅲ 1 3 3 3 31.85164
Ⅳ 2 1 2 3 45.88422
Ⅴ 2 2 3 1 60.20235
Ⅵ 2 3 1 2 74.6816
Ⅶ 3 1 3 2 72.60793
Ⅷ 3 2 1 3 72.09973
Ⅸ 3 3 2 1 63.84822
K1 120.3535 163.065 191.3542 168.6235
K2 180.7682 176.2311 153.6614 191.2185
K3 208.5559 170.3815 164.6619 149.8356
R 88.20236 13.16603 37.69281 41.38293
（注：表中，A、B、C、D及1、2、3与表3中的一致；K1、K2和K3分别表示在1、2、3水平下，对应因素的试验结果之和；R表示极差）
d、发酵pH对酶产量的影响，在配方为魔芋粉2%，酵母膏2%，KH2PO4 0.4%，MgSO40.03%的培养基中，pH分别调节为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，灭菌后按3%的接种量接入HTGC-10种子液，30℃、190r/min摇床培养24h，测定β-甘露聚糖酶活性（图8），由图8可以看出，培养基最适发酵pH为6.0，在该条件下，β-甘露聚糖酶活性可以达到85.35U/mL。
将上述β-甘露聚糖酶发酵液喷雾干燥磨粉后，按照500mg/kg和1000mg/kg的添加量添加到夏季高温时期蛋鸡基础日粮（见表5）中，观察其对蛋鸡产蛋率的影响。
在某养鸡场选择体重及产蛋率接近的蛋鸡300只，随机分成3组，每组100只，处理1组只饲喂基础日粮，处理2组饲喂基础日粮+500mg/kg β-甘露聚糖酶干粉，处理3组饲喂基础日粮+1000mg/kg β-甘露聚糖酶干粉，试验共开展5周，结果见表6。由表6可知，在基础日粮中添加β-甘露聚糖酶干粉，可以显著提高蛋鸡的产蛋率，添加1000mg/kg的β-甘露聚糖酶，产蛋率可提高10.52%
表5.蛋鸡基础日粮组成
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表6. β-甘露聚糖酶对蛋鸡产蛋率的影响
项目 处理1 处理2 处理3
产蛋率% 71.04 76.23 78.51
结果表明，本发明从河南省南阳西峡县后塘沟村筛选的β-甘露聚糖酶生产菌株HTGC-10，经生理生化和16s rDNA鉴定为解淀粉芽孢杆菌，是一种益生菌，可以实现生产菌株与代谢产物混合应用，从而实现简化酶的纯化过程。且该菌株产酶活性高，其产β-甘露聚糖酶的最佳培养基配方为魔芋粉2%，酵母粉2%，KH2PO4 0.4%，MgSO4 0.03%，pH6.0，在该培养基中，29℃、190r/min摇床培养21h，产酶活性达到85.35U/mL，目前野生解淀粉芽孢杆菌还没有产β-甘露聚糖酶活力这么高的报道，因此，本发明增加了β-甘露聚糖酶高产菌株的种质资源，可有效用于产β-甘露聚糖酶的发酵，是水解甘露聚糖的一大创新，为抗生素的有效替代产品，产酶活性高达85.35U/mL，日粮中添加β-甘露聚糖酶干粉后，可以提高显著蛋鸡的产蛋率，是饲料生产上的一大创造，有显著的经济和社会效益。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10及其产β-甘露聚糖酶的发酵应用方法
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1357
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
cggctggctc ctaaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120
gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga acagatttgt 180
gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct gtccattgta gcacgtgtgt 240
agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 300
ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac taagatcaag ggttgcgctc 360
gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 420
cactctgccc ccgaagggga cgtcctatct ctaggattgt cagaggatgt caagacctgg 480
taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600
agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660
actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc gtcagttaca 720
gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac 780
acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctcccc 840
ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgagccc tttacgccca 900
ataattccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960
gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggtg ccgccctatt tgaacggcac ttgttcttcc 1020
ctaacaacag agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag 1080
actttcgtcc attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1140
tcagtcccag tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc 1200
cgttacctca ccaactagct aatgcgccgc gggtccatct gtaagtggta gccgaagcca 1260
ccttttatgt ctgaaccatg cggttcagac aaccatccgg tattagcccc ggtttcccgg 1320
agttatccca gtcttacagg caggttaccc acgtgtt 1357

Claims (5)

1.一株解淀粉芽孢杆菌HTGC-10，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2021年3月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22074，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10在制备产β-甘露聚糖酶发酵液中的应用。
3.权利要求2所述的产β-甘露聚糖酶发酵液在饲料中的应用。
4.权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10在制备产β-甘露聚糖酶发酵液中的应用方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌HTGC-10接入种子培养基，25-30℃，培养18-20h成种子液，然后，将种子液按发酵培养基体积3%的接种量接种到发酵培养基中，28-30℃，190r/min摇床培养20-22h，产酶活性达到85.35U/mL，即为产β-甘露聚糖酶的发酵液，应用时，用PBS缓冲液调pH6.0，温度55℃，以β-甘露聚糖酶干粉计，每1kg饲料中加入β-甘露聚糖酶干粉500-1000mg；
所述的种子培养基是由蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 5g加蒸馏水至1000mL制成；
所述的发酵培养基由质量计：魔芋粉2%、酵母粉2%、KH2PO4 0.4%、MgSO4 0.03%和余量为水混匀，121℃灭菌15min。
5.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌HTGC-10在制备产β-甘露聚糖酶发酵液中的应用方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌HTGC-10接入种子培养基，28℃，培养19h成种子液，然后，将种子液按发酵培养基体积3%的接种量接种到发酵培养基中，29℃，190r/min摇床培养21h，产酶活性达到85.35U/mL，即为产β-甘露聚糖酶的发酵液，喷雾干燥，制备β-甘露聚糖酶干粉，应用时，以β-甘露聚糖酶干粉计，每1kg饲料中加入β-甘露聚糖酶干粉800mg；
所述的种子培养基是由蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 5g加蒸馏水至1000mL制成；
所述的发酵培养基由质量计：魔芋粉2%、酵母粉2%、KH2PO4 0.4%、MgSO4 0.03%和余量为水混匀，121℃灭菌15min。
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