CN111040966B

CN111040966B - 一种地衣芽孢杆菌KD-1、其生产的β-甘露聚糖酶及其应用

Info

Publication number: CN111040966B
Application number: CN201911338211.5A
Authority: CN
Inventors: 张春晓; 陈晓波; 田庚; 高伟强
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111040966A

Abstract

本发明涉及一种可以生产耐高温和高稳定性的β‑甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌KD‑1，保藏编号为CGMCC No.18964，本发明还涉及该β‑甘露聚糖酶及其应用。本发明的β‑甘露聚糖酶最适pH 6.0，最适温度60℃；在pH 5.0～9.0和60～80℃，酶的稳定性良好，60℃、70℃和80℃酶的半衰期分别为5.5 h、4.3 h和4.2 h；10mmol/L的Cu²⁺和Mg²⁺明显促进β‑甘露聚糖酶活性，而Mn²⁺明显抑制酶活性，具有很大的应用潜力。

Description

一种地衣芽孢杆菌KD-1、其生产的β-甘露聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌KD-1及其生产的β-甘露聚糖酶，同时涉及该β-甘露聚糖酶的应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC.3.2.l.78）能够攻击甘露聚糖骨架的内部 β-1，4糖苷键，释放甘露寡糖。β-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、真菌、放线菌、植物和动物中。水解产物甘露寡糖（mannan-oligosaccharide，MOS）不仅能够刺激肠道正常菌群的增殖，抑制病原微生物的生长，对乳杆菌（Lactobacilli）和双歧杆菌（Bifidobacteria）生长有益，还具有多种生物学活性，如增强动物免疫、调节糖脂代谢、促生长和抗氧化等作用，MOS还通过调控肠道微生物增强了二甲双胍的降糖效果。

β-甘露聚糖酶在食品行业应用广泛，如在面团中添加β-甘露聚糖酶处理 15 min的 2.0%魔芋葡甘聚糖，能够显著抑制二硫键的断裂和二级结构的变化，防止面团的水分散失，维持面团的拉伸能力；β-甘露聚糖酶对降低咖啡和果汁的粘度也非常有效。此外，β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂应用于养殖业，起到消除抗营养因子的作用，对提高饲料利用率有重要贡献；在造纸工业中，与β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，不仅能够减少化学漂白剂的用量，减少环境污染，还能提高纸浆白度，改善纸浆性能；在纺织工业中能有效去除纺织品所粘附的多余染料，Singh 2019从Klebsiella pneumoniae SS11菌株中鉴定了一种热和碱稳定的β-甘露聚糖酶，用做洗涤剂添加剂，对于去除因甘露聚糖导致的食品染色效果非常好。

大部分β-甘露聚糖酶的最适温度为 40～75 ℃，但酶的半衰期有很大不同，如B. licheniformis DSM 13菌株的β-甘露聚糖酶50 ℃酶的半衰期 80 h，60 ℃酶的半衰期迅速下降，仅为3 min；嗜热枯草芽孢杆菌B. subtilis （TBS2）酶在60、70、80、90和100 ℃的半衰期分别为6 h、4.2 h、2 h、20 min和12 min；热和碱稳定的K. pneumoniae SS11 β-甘露聚糖酶，70 ℃时酶的半衰期为135.91 min，B. clausii S10的β-甘露聚糖酶，尽管其最适温度75 ℃，70℃ 孵育3 h，残余酶活性大于50%，而80 ℃酶的半衰期为0.5 h。

为了满足β-甘露聚糖酶在食品加工、功能性食品开发、养殖业、医药、造纸等领域的应用，开发耐高温、高稳定性的β-甘露聚糖酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以生产耐高温和高稳定性的β-甘露聚糖酶的地衣芽孢杆菌KD-1，同时提供该β-甘露聚糖酶及其在食品及养殖业中的应用。

本发明采用如下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）KD-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18964，保藏日期为2019年11月18日。

该地衣芽孢杆菌KD-1可产β-甘露聚糖酶。

该地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶的最适pH为6.0。

该地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶在pH 5.0～9.0时稳定，相对酶活性大于70%。

该地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶的最适温度为60 ℃。

该地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶在30～100 ℃时稳定，残余酶活性大于58%。

该地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶的热稳定性高，在80 ℃条件下，半衰期为4.2 h以上。

一种地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶。

进一步的，Cu²⁺ 和Mg²⁺ 具有促进β-甘露聚糖酶活性的作用。

一种上述β-甘露聚糖酶在食品及养殖业中的应用，特别是在饲料添加剂领域的应用。

本发明的有益效果在于：本发明从土壤中分离得到一株降解魔芋胶的地衣芽孢杆菌KD-1，并对其产β-甘露聚糖酶的酶学性质进行了研究，该β-甘露聚糖酶最适pH 6.0，最适反应温度60℃；在pH 5.0～9.0和60～80 ℃，酶的稳定性良好，60 ℃酶的半衰期（τ1/2）为5.5 h，70 ℃和80 ℃酶的半衰期（τ1/2）均超过4.2 h，在食品、养殖、医药、造纸、纺织等行业方面具广泛应用价值。

本发明β-甘露聚糖酶最适温度为60 ℃，与B. licheniformis DSM 13、B. subtilis WL-3和B. subtilis（TBS2）等菌株β-甘露聚糖酶的最适温度接近。尽管这些酶的最适温度一致，但酶的半衰期有很大不同，本发明的β-甘露聚糖酶在80 ℃ 孵育4.2 h 残余酶活性大于50%。相比之下，本发明得到的β-甘露聚糖酶，是目前报道高温下（如70 ℃和80 ℃）热稳定性最高的酶，酶的半衰期达4.2 h以上，具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌KD-1的刚果红染色结果。

图2为地衣芽孢杆菌KD-1的16S rDNA序列。

图3为基于16S rDNA序列构建的系统发育树。

图4为在60℃保温10 min，含0.5% 魔芋胶的不同pH缓冲液中，β-甘露聚糖酶酶活性的测定结果。

图5为将粗酶液在60℃不同pH缓冲液中，保温30 min后，β-甘露聚糖酶残余酶活性的测定结果。

图6为将粗酶液在60℃不同pH缓冲液中，保温2 h后，β-甘露聚糖酶残余酶活性的测定结果。

图7为不同温度下，β-甘露聚糖酶活性的测定结果。

图8为在60℃、70℃、80℃时，β-甘露聚糖酶活性随时间变化的结果。

图9为金属离子对β-甘露聚糖酶活性的影响结果。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。

一、地衣芽孢杆菌KD-1的分离和筛选

称5 g土样于无菌生理盐水中，土壤采自河北省石家庄市河北科技大学校园内，在37℃ 180 r/min摇床上培养2 h；取2 mL土壤悬液加入到富集培养基（魔芋胶5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，自然pH）中，37℃ 180 r/min摇床上培养12 h。富集培养的菌液进行梯度稀释后，取适量菌液涂布于初筛平板培养基（魔芋胶5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，琼脂20 g/L，自然pH）中，37℃倒置24 h，每个稀释梯度设置3个平行。培养24小时后，向平板中加入适量0.1% 刚果红染液，静置30 min，观察水解圈大小及透明度。

以魔芋胶为唯一碳源，并结合刚果红染色的方法，从初筛培养基中分离D/d 比值较大的菌株。纯化得到的菌株。菌落表面湿润，边缘不整齐，在初筛培养基上37℃ 培养 20h 后进行刚果红染色，结果如图1所示，D/d比值为1.67。

分离和纯化后得到地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）KD-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.18964，保藏日期为2019年11月18日。

二、地衣芽孢杆菌KD-1的分子鉴定

对菌株进行基因组DNA提取。以基因组DNA为模版，细菌16S rDNA通用引物16S F1：5’-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3’ 和16S R1：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTC -3’ ，使用HiFiTaq进行基因扩增。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，32个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物测序由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成。该菌株的16S rDNA测序结果如图2所示。

该序列在NCBI网站上进行 BLAST 比对，结果表明，该菌株与地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）一致性达99%。应用Mega6.0软件构建的系统发育树，结果如图3所示，该菌株与B.licheniformis ATCC 14580和CICC 10334在同一个进化分支上，表明三者亲缘关系最近，所以鉴定该菌株为地衣芽孢杆（B. licheniformis）。

三、地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶酶学性质

1、酶活性测定方法

（1）粗酶液的制备：将初筛得到的菌株接到种子培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10 g/L，自然pH）中，37 ℃ 180 r/min培养12 h。按10%的接种量转接到发酵培养基（魔芋胶5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L），同样条件下培养40 h。发酵液12000 r/min离心10 min，收集的上清液即为粗酶液。

（2）甘露糖标准曲线的制定：D-甘露糖标准曲线的制定：1 g/L D-甘露糖标准溶液的配制，取六支试管分别加入1 g/L甘露糖标准溶液0 mL，0.06 mL，0.12 mL，0.18 mL，0.24mL，0.3 mL，依次分别加入ddH₂O 0.3 mL，0.24 mL，0.18 mL，0.12 mL，0.06 mL，0 mL。再加入0.6 mL的DNS混匀，沸水浴5 min，冷却后利用SpectraMaxm i3x多功能酶标仪测定OD₅₄₀。以D-甘露糖质量（mg）为横坐标 x，以OD₅₄₀为纵坐标 y，绘制标准曲线。每组试验均设3次空白对照和3次重复试验，重复试验取平均值。

（3）β-甘露聚糖酶活性测定：将魔芋胶浸泡在75% 酒精中处理，烘干以除去魔芋胶中含有的还原糖使其变为精魔芋胶，在酶活性测定时作为底物使用。采用DNS法进行酶活性测定，将精魔芋胶溶于pH 6.0磷酸钠缓冲液中配制5 g/L的溶液作为底物，于0.27 mL底物中加入0.03 mL粗酶液，60 ℃水浴10 min，加入DNS试剂 0.6 mL，混匀后沸水浴5 min显色，立即以流动水冷却至室温，利用SpectraMaxm i3x多功能酶标仪测定540 nm处吸光值。

酶活性定义：在一定温度和pH下，以每分钟催化底物水解生成1 μmol D-甘露糖所需的酶量定义为一个酶活性单位（U）。

2、pH对酶活性及稳定性的影响

配制pH 2.0～12.0缓冲液，与等体积的粗酶液混合，60 ℃保温10 min，测定β-甘露聚糖酶活性，以未经处理的粗酶液作为空白对照。以最高酶活性为100%，分别计算不同pH的相对酶活性。

结果如图4所示，β-甘露聚糖酶的最适pH为pH 6.0，酶活性达到3.38 U/mL，在pH2.0 时保持 34% 的相对酶活性。在pH 3.0～6.0范围内，随pH值增大，相对酶活性提高；在pH 7.0～12.0范围内，随着pH值增大，相对酶活性降低，但在pH 12.0时仍保持49%的相对酶活性。β-甘露聚糖酶在pH 5.0～10.0范围内，保持较高酶活性（大于70%），说明该酶具有较广的pH 耐受范围（图4）。

取粗酶液分别在pH 2.0～12.0的缓冲液下等体积混合，在60 ℃条件下保温30min和2 h。取出酶液使其与质量分数为0.5 %的精魔芋胶底物（即称取0.5 g 精魔芋胶，溶于100 mL pH 6.0的磷酸钠缓冲溶液中）混合，测定β-甘露聚糖酶活性。以最高酶活性为100%，分别计算不同pH的相对酶活性，研究pH对酶稳定性的影响。该酶在60℃ 孵育30 min后，在pH 3.0～12.0之间酶具有较高的稳定性（图5），孵育2 h后，在pH 5.0～9.0之间具有较高的稳定性（大于70%的相对酶活性，图6），说明该酶具有广泛的 pH 耐受范围。

3、温度对酶活性及热稳定性影响

将粗酶液进行适当稀释，加入到质量分数为0.5 %的精魔芋胶底物中，置于不同温度（30 ℃，40 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃，65 ℃，70 ℃，80℃，90℃，100℃）下保温10 min，测定β-甘露聚糖酶活性。以最高酶活性为100%，分别计算不同温度的相对酶活性，确定该酶最适反应温度。酶的最适温度为60 ℃（图7），在30～100 ℃范围内，该酶都保持较高的酶活性，如在30 ℃和100 ℃，仍具有高于58% 的酶活性，属于耐高温酶。

粗酶液分别在温度60 ℃、70 ℃ 、80 ℃下各保温10 min、2 h、4 h、6 h和8 h，再进行适当稀释，在最适温度测定β-甘露聚糖酶活性，以最高酶活性为100%，分别计算不同温度的相对酶活性。60 ℃酶的半衰期（τ1/2）为 5.5 h，70 ℃和80 ℃酶的半衰期（τ1/2）均超过4.2 h（图8）；另外，该酶在100 ℃ 孵育10 min残余酶活性58%，孵育30 min，残余酶活性仍有31%，表明该酶的热稳定性非常高。

4、金属离子对酶活性的影响

粗酶液进行适当稀释后，分别与10 mmol/L K⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Cu²⁺、Mg²⁺等不同金属离子溶液等体积混合。在37 ℃条件下保温 1小时，以未加金属离子的粗酶液作为对照，测定β-甘露聚糖酶活性，以最高酶活性为100%，分别计算不同金属离子的相对酶活性。

Cu²⁺和Mg²⁺具有促进β-甘露聚糖酶活性的作用，分别使酶活性提高了40%和19%（图9），而其他离子，Mn²⁺、K⁺、Zn²⁺、Ca²⁺和Na⁺均对酶活性有不同程度的抑制作用，其中Mn²⁺对酶活性抑制程度最大，降低了51%的酶活性， Ca²⁺和Na⁺仅有微弱的抑制作用。

根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北科技大学

<120> 一种地衣芽孢杆菌KD-1、其生产的β-甘露聚糖酶及其应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> B. licheniformis

<400> 1

cgcgtggcgc tgctatacat gcagtcgagc ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt tcaatcataa aaggtggctt 180

ttagctacca cttgcagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag 420

aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa 1260

tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttggagcc agccgccgaa 1440

gtgacagaac tgg 1453

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌KD-1，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.18964。

2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌KD-1，其特征在于，其可产β-甘露聚糖酶。

3.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌KD-1，其特征在于，其生产的β-甘露聚糖酶在pH5.0～10.0时，相对酶活性大于70%。

4.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌KD-1，其特征在于，其生产的β-甘露聚糖酶在30～100 ℃时，相对酶活性大于58%。

5.一种由权利要求1所述地衣芽孢杆菌KD-1生产的β-甘露聚糖酶，其特征在于，该酶在60 ℃、70 ℃和80 ℃的半衰期分别为5.5 h、4.3 h和4.2 h。

6.根据权利要求5所述的β-甘露聚糖酶，其特征在于，Cu²⁺ 和Mg²⁺ 具有促进β-甘露聚糖酶活性的作用。

7.一种权利要求5或6所述的β-甘露聚糖酶在食品行业及养殖业中的应用。