KR100390565B1

KR100390565B1 - 만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 ｗｌ-1 균주

Info

Publication number: KR100390565B1
Application number: KR10-2000-0033822A
Authority: KR
Inventors: 조기행; 윤기홍; 김대원; 오화균; 오영필
Original assignee: 주식회사 씨티씨바이오
Priority date: 2000-06-20
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2003-07-07
Also published as: US20030190741A1; US6984406B2; DE60141138D1; KR20020000013A; EP1292669A4; ES2342767T3; AU2001274647A1; ATE455843T1; EP1292669B1; DK1292669T3; WO2001098462A1; EP1292669A1

Abstract

본 발명은 중성과 산성범위 산도에서 높은 활성을 나타내는 만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속(Bacillussp.) 균주에 관한 것으로 토양으로부터 분리한 만난 분해능이 있는 신규한 바실러스 속 WL-1 (Bacillussp. WL-1) 균주(KCTC 0800BP)는 유당과 밀기울이 함유된 배지에서 만난아제를 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으며 상기 생산된 만난아제는 중성과 산성범위의 산도에서 활성이 높아 사료첨가제로 유용할 뿐만 아니라 식품, 퇴비 및 펄프 제조시 헤미셀룰로즈 분해에 적합한 뛰어난 효과가 있다.

Description

만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 ＷＬ-1 균주{Novel Bacillus sp. WL-1 strain producing mannanase}

본 발명은 중성과 산성범위 산도에서 높은 활성을 나타내는 만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속(Bacillussp.) 균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 토양으로부터 분리한 신규한 바실러스 속 균주의 분리, 동정 및 상기 바실러스 속 균주를 배양하여 중성과 산성범위 산도에서 활성이 높아 단위동물의 사료첨가제로 유용한 만난아제를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

만난아제는 헤미셀룰로즈를 구성하는 주요성분인 만난 함유물질을 분해하는 효소로 그 용도가 증대되고 있는 효소 중의 하나이다. 헤미셀룰로즈는 식물 세포벽의 구성성분이며 셀룰로즈와 리그닌이 결합하여 존재하고 자연계에 셀룰로즈 다음으로 풍부한 다당류이다. 헤미셀룰로즈에는 콩과식물의 씨에 존재하는 갈락토만난, 아라비노갈락탄, 침엽수의 글루코만난, 갈락토글로코만난 등의 만난물질이 포함된다. 자일라나제 및 글루카나제와 함께 헤미셀룰라제에 속하는 만난아제의 이용 가능성 중 가장 중요한 것은 지구상의 재생가능한 식물자원인 헤미셀룰로즈를 당화하여 생물체가 이용가능한 탄소원으로 전환시키는 것이나 아직까지 현실화되지는 않은 상태이다. 현재 헤미셀룰라제가 실용화되고 있는 것들로는 커피, 초코렛, 코코아, 차, 시리얼 등의 식품가공과 펄프제조 등과 같은 산업적 응용을 들 수 있다.

식품과 사료에 사용되는 헤미셀룰로즈를 함유한 곡물을 헤미셀룰라제로 가공하면 식·사료용에 알맞은 형태로 전환되어 에너지 수율이 증진되고 점질도가 저하된다. 식품과 가축사료의 이용 가능한 에너지 함량이 높아진다면, 특히 사료에 있어서는 가축의 생산가를 낮출 수 있는 이점이 있다.

대두 단백질은 개, 고양이, 돼지, 물고기, 닭 등의 가축 사료로 사용된다. 주된 에너지원 성분은 아니지만 대두박은 필수아미노산을 갖는 우수한 단백질원이다. 대두박 성분 중 에너지원 성분인 탄수화물의 약 10% 정도는 갈락탄과 펜토산으로 되어 있다. 이러한 탄수화물은 단위 동물에 의해 상당량이 소화되지 않고 배설되는데 만난아제는 대두박의 에너지원이 되는 탄수화물 중 갈락탄을 저분자의 올리고당이나 단당으로 분해하여 단위동물이 쉽게 대사할 수 있도록 한다.

만난아제는 고초균을 비롯하여 애로모나스(Aeromonas), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속에 속하는 세균을 비롯하여 곰팡이, 효모 등의 미생물이 생산한다. 그리고 고등식물과 동물도 만난아제를 생산하는 것이 있다. 실제 만난아제 효소의 생산에 사용되고 있는 미생물은 주로 트리코더마 (Trichoderma), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속 곰팡이 균주들이며 곰팡이 유래의 만난아제는 산성 조건에서 최대 활성을 나타낸다. 그러나 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 만난아제가 작용하여야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이다. 따라서 pH 3.6 ∼ 5.5 부근에서 활성이 높은 곰팡이 유래의 만난아제보다는 산도가 중성 부근의 조건에서 활성이 높은 만난아제가 사료첨가용 효소로 요구되고 있다.

헤미셀룰로즈의 주요성분인 만난을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세가지 종류의 효소, 즉 엔도만난아제(endo-β-mannanase), 엑소만난아제 (exo-β-mannanase) 및 만노시다제(β-mannosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 엔도만난아제는 만노즈 중합도가 4개인 만노테트라오즈 이상의 중합도를 갖는 만난 다당류의 β-D-1,4-만노피라노실(β-D-1,4-mannopyranosyl) 결합을 무작위로 가수분해하는 반응을 촉매하며 만난물질을 가수분해하는데 주된 역할을 한다. 한편, 본 발명에서는 이들 효소중 첫 번째 엔도만난아제에 중점을 두었으며 이후 이 효소를 편의상 만난아제로 칭함을 전제해 둔다.

본 발명자들은 상기와 같은 사실을 감안하여 중성과 산성범위에서 활성이 높은 만난아제를 생산하는 새로운 바실러스 속 균주를 토양으로부터 분리하여 이를동정하였으며, 상기 분리·동정한 바실러스 속 균주가 유당과 밀기울 등이 함유된 배지에서 배양할 경우 만난아제를 다량 생산함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 만난아제를 생산하는 신규한 바실러스 속 균주를 토양으로부터 분리, 동정하여 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 토양으로부터 분리, 동정한 신규한 바실러스 속 균주를 배양하여 사료첨가용으로 유용한 만난아제를 대량 생산하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 만난아제의 가축사료용 첨가제로서의 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 토양으로부터 다수의 세균을 분리한 후 아카시아 열매수지가 함유된 평판배지에서 배양하면서 열매수지 물질의 분해환이 큰 균주를 선발한 후 선발 균주의 균학적 성질을 조사하고 이어서 선발한 균주가 생산하는 효소인 만난아제의 특성을 조사하고 배양배지 조성에 따른 선발균주의 만난아제 생산성을 조사한 후 상기 생산된 만난아제가 대두 부산물로 가축의 사료로 이용되는 대두박의 탄수화물을 분해하는 능력을 분석하여 사료첨가제로써 유용성을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1은 바실러스 속 WL-1(Bacillussp. WL-1) 균주가 생산하는 만난아제의 온도와 산도(pH)에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 바실러스 속 WL-1 균주를 부가 탄소원이 없는 LB 배지와 1% 밀기울과 1% 유당이 첨가된 LB 배지에 배양할 때 배양시간에 따른 균수와 배양액 내의 만난아제 활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 토양시료를 아카시아 열매 수지를 첨가한 LB 한천배지에서 배양하여 콜로니 주위에 열매수지 분해환이 생성된 균들을 선별하여 만난아제를 생산하는 미생물을 선발하고 선발된 이 균주를 바실러스 속 WL-1(Bacillussp. WL-1) 균주로 명명하는 단계; 상기 선발된 바실러스 속 WL-1 균주의 최적 생육온도를 조사하고 버기의 매뉴얼에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여 동정하는 단계; 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 효소인 만난아제의 최적 활성온도와 최적 활성pH를 조사하는 단계; 탄소원으로 유당과 밀기울의 양을 달리 첨가한 배지에서 바실러스 속 WL-1 균주를 배양하면서 만난아제 생산성에 미치는 각 탄소원의 영향을 조사하는 단계; 탄소원으로 유당과 밀기울을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지에서 각각 바실러스 속 WL-1 균주를 배양하면서 일정시간마다 균수와 만난아제의 활성을 측정하여 만난아제 생산성과 균체량의 관계를 배양시간에 따라 조사하는 단계; 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제 효소를 대두박(soybean meal)에 처리한 후 대두박의 만난물질 분해에 의한 환원당의 증가량을 조사하여 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제가 동물사료 첨가제로서의 적합성을 조사하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 사용한 LB 한천배지는 1L 당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 5 g, 박토아가 18 g을 함유한다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 토양으로부터 만난아제 생산균주의 분리

만난아제를 생산하는 미생물의 분리를 위해 토양시료 1 g 을 생리식염수 10 mL에 현탁하고, 현탁액의 적당량을 취하여 0.5% 아카시아 열매 수지를 첨가한 LB 한천배지에 도말한 후 37℃에서 배양하였다. 고체 한천배지에서 콜로니가 형성된 후 0.2% 콩고레드 용액으로 염색하고 그 콜로니 주위에 만난 분해환이 생성된 균들을 선별하는 방법으로 토양으로부터 만난아제를 생산하는 미생물을 다수 탐색하였다. 이들 균주중에서 중성에서 만난아제 활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 1 주 선발하였고 이 균주를 바실러스 속 WL-1 (Bacillussp. WL-1) 균주로 명명하였다.

실시예 2: 바실러스속 WL-1 균주의 동정 및 특성조사

상기 실시예 1에서 토양으로부터 분리한 본 발명 바실러스 속 WL-1(Bacillussp. WL-1) 균주를 다양한 온도에서 배양하면서 최적 생육온도를 조사하였다. 실험결과, 바실러스 속 WL-1 균주는 55℃ 이상에서는 자라지 못하였으나 20℃에서 50℃ 까지는 좋은 성장을 나타냈다. 또한 바실러스 속 WL-1 균주의 형태학적, 생화학적 특성을 조사해 본 결과, 표 1에서 나타난 바와 같았으며 버기의 매뉴얼(Bergy's manuals of determinative bacteriology)에 따라 바실러스 속 균주로 동정하였다. 본 발명에서 동정한 신규 균주 바실러스 속 WL-1 균주는 한국과학기술원 생명공학연구소내 유전자 은행에 2000년 6월 12일자로 기탁번호 KCTC 0800BP로 기탁하였다.

바실러스 속 WL-1 균주의 형태 및 생화학적 특징

구 분	반 응
세포형태(Shape)	간균
포자형성능(Endospore)	+
포자 형태(Spore shape)	타원형
포자 위치(Spore position)	중앙
운동성(motility)	+
그람염색(Gram staining)	+
증식온도(Growth temperature)	20∼50℃
카탈라아제 활성(Catalase)	+
옥시다아제(Oxidase)	+
베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase)	+
아르기닌 디하이드로라아제(Arginine dihydrolase)	-
라이신 디카르복시라아제(Lysine decarboxylase)	-
시트레이트 이용성(Citrate utilization)	+
인돌생성(Indole production)	-
젤라틴 가수분해(Gelatin hydrolysis)	+
전분 가수분해(Starch hydrolysis)	+
당발효에 의한 산생성글루코스(D-glucose), 프룩토스(D-fructose), 만노스(D-mannose)글리세롤(Glycerol), 아라비노스(L-arabinose), 이노시톨(Inositol)만니톨(Mannitol), 소비톨(Sorbitol), 말토스(Maltose)자일로스((D-xylose), 갈락토스(galactose), 람노스(Rhamnose),락토스(Lactose), 에리쓰리톨(Erythritol), 글루코네이트(Gluconate)	+++--
+: 양성 -:음성

실시예 3: 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제의 반응특성

본 발명 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제를 이용하여 아카시아 열매수지 유래의 갈락토만난을 가수분해하는데 있어서 반응온도와 pH에 따른 활성을 조사하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. 우선 배양상등액을 농축하고 황산 암모늄염(ammonium sulfate)으로 분획하여 침전물을 얻은 다음 50 mM Na·포스페이트(phosphate) 완충용액 (pH 6.5)에 현탁한 후 동일한 완충용액으로 투석하였다.분획된 단백질 중 만난아제 활성을 갖는 부분을 모아 조효소액으로 사용하여 반응온도와 pH를 달리하여 만난아제 활성을 측정하였다. 실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이 65℃와 pH 5.5 부근에서 최고의 효소 활성을 보였으며, pH 5.5에서 pH 7.0 까지의 범위에서 90% 이상의 활성을 나타내 본 발명 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제는 생리적 조건인 중성부근의 pH에서 우수한 활성을 지니는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 탄소원의 첨가에 의한 만난아제의 생산성 변화조사

미생물의 다당류 분해효소 생산은 배양액 중의 탄소원에 의해 영향을 받는 경우가 많다. 본 실시예에서는 여러 종류의 탄수화물을 배지에 각각 첨가하여 본 발명 바실러스 WL-1 균주의 만난아제 생산성을 조사한 결과 밀기울과 유당을 배지에 첨가하였을 때 만난아제 생산성이 증가한다는 사실을 확인하고, 배지내 밀기울과 유당의 첨가량이 바실러스 속 WL-1 균주의 만난아제 생산성에 미치는 영향을 검토하였다. 먼저 LB 배지를 대조구로 하여 LB 배지에 밀기울과 유당의 농도를 각각 달리하여 첨가한 액체배지에 바실러스 속 WL-1 균주를 접종하여 37℃에서 15시간 각각 액체배양한 후 배양상등액의 만난아제 활성을 조사하였다. 실험결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 밀기울의 경우 첨가량이 2.5%인 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으며 이때 효소 생산 증가는 대조구의 8.5배에 달하였다. 유당 경우에는 1.0%를 첨가하였을 때 효소 생산이 가장 많이 증가되어 대조구의 14배에 달하였다. 이와 같이 바실러스 속 WL-1 균주의 만난아제 생산은 유당과 밀기울에 의해 크게 증가됨을 알 수 있었다. 두 탄소원의 복합첨가에 의한 만난아제 생산성 증가를 조사하기 위해 LB 배지에 1.0%의 유당을 첨가한 배지를 기본 배지로하여 밀기울을 농도별로 첨가한 배지에서 바실러스 속 WL-1 균주를 배양하여 만난아제 활성을 조사한 결과 표 3에 나타난 바와 같이 밀기울을 1.0% 첨가한 배지에서 효소 생산이 최대로 증가하여 대조구의 24배에 달하였다.

밀기울과 유당의 첨가량이 효소 생산성에 미치는 영향

배지첨가성분	첨가량(%)	만난아제활성(unit/mL)	비교활성(%)
무첨가		1.9	100
밀기울	1.0%	8.8	450
	1.5%	13.6	693
	2.0%	14.3	728
	2.5%	16.9	864
	3.0%	16.7	850
유당	0.5%	20.6	1,050
	1.0%	28.3	1,443
	1.5%	22.4	1,143
	2.0%	23.7	1,207
	2.5%	22.8	1,164
	3.0%	23.4	1,193

밀기울과 유당의 복합첨가가 효소 생산성에 미치는 영향

배지첨가성분	밀기울첨가량(%)	만난아제 활성(unit/mL)	비교활성(%)
무첨가(LB 배지)		1.9	100
(유당 1% 함유 LB 배지)밀기울	0%	22.0	1,121
	0.5%	39.9	2,236
	1.0%	47.3	2,414
	1.5%	43.4	2,214
	2.0%	45.1	2,300

실시예 5: 배양시간에 따른 바실러스 속 WL-1 균주의 만난아제 생산성 변화와 균체량과의 관계조사

유당 및 밀기울에 의한 만난아제의 생산성 증가와 균체량의 관계를 시간경과에 따라 확인하기 위하여 탄소원을 첨가하지 않은 LB 배지와 부가 탄소원으로 1%의 유당과 1%의 밀기울이 첨가된 LB 배지에 바실러스 속 WL-1 균주를 각각 접종하여 37℃에서 배플 플라스크(baffle flask)로 진탕배양하면서 일정시간 마다 균수와 만난아제의 활성을 측정하였다. 균수는 채취한 배양액을 희석한 후 LB 한천 배지에 도말, 배양하여 각 콜로니의 수를 측정하였고 배양액내에 존재하는 만난아제의 활성은 배양액을 원심분리한 후 상등액을 시료로하여 측정하였다. 실험결과, 바실러스속 WL-1 균주는 도 2에서 나타나 바와 같이 두 배지에서 모두 빠른 성장을 하여 접종 후 5 ∼ 6 시간만에 정지기에 이르러 계속 유지되었으나 18 시간 이후에 LB배지에서는 균수가 약간 감소하였다. 만난아제의 생산은 두 배지에서 현격한 차이를 나타내었는데 유당과 밀기울을 첨가한 경우 균의 성장과 배양시간의 연장에 따라 계속적으로 활성이 증가하여 배양 24시간후에는 189 unit/mL의 활성을 나타냈다. 그러나 부가 탄소원이 없는 LB 배지에서는 배양시간에 따른 활성증가도 미약하였고 최대 활성 수준도 2.0 unit/mL이었다. 따라서 유당과 밀기울을 1%씩 첨가한 배지에서는 이들을 첨가하지 않은 배지에 비해 바실러스 속 WL-1의 만난아제 생산성이 약 95 배의 증가하는 것으로 최종 확인되었다.

실시예 6: 바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제의 사료첨가상 유용성 조사

바실러스 속 WL-1 균주가 생산하는 만난아제가 사료첨가용 목적에 적합한지를 조사하기 위해서 대두의 부산물로 가축의 사료재료로 많이 사용되는 대두박을 대상으로 바실러스 속 WL-1 균주 유래의 만난아제를 처리한 후 효소활성에 의해 생성된 환원당의 양을 분석하였다. 바실러스 속 WL-1 균주를 유당 및 밀기울을 각각 1% 함유한 LB 배지에서 배양한 후 배양 상등액을 황산 암모니움염으로 침전시켜 조효소액을 제조하였다. 대두박 1 g에 만난아제 40 unit/mL이 되도록 첨가하고 반응조건은 단위동물의 소장의 생리적 조건인 pH 6.5, 반응온도 37℃로 하여 6시간동안 처리하였다. 실험결과, 표 4에 나타난 바와 같이 반응시간에 따라 대두박이 분해되어 반응액에 환원당 값은 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 살펴볼 때 바실러스 속 WL-1 균주 유래의 만난아제는 사료첨가 목적에 적합함을 알 수 있었다.

바실러스 속 WL-1이 생산하는 만난아제의 대두박 분해능

반응 시간(시간)	반응 후 생성된 환원당의 양(μmole)
0	0
1	132
2	170
3	196
4	211
5	224
6	248

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 토양으로부터 분리한 만난 분해능이 있는 신규한 바실러스 속 WL-1 (Bacillussp. WL-1) 균주(KCTC 0800BP)는 유당과 밀기울이 함유된 배지에서 만난아제를 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으며 상기 생산된 만난아제는 중성과 산성범위 산도에서 활성이 높아 사료첨가제로 유용할 뿐만 아니라 식품, 퇴비 및 펄프 제조시 헤미셀룰로즈 분해에 적합한 뛰어난 효과가 있으므로 사료산업, 비료산업, 제지산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

만난아제를 생산하는 토양으로부터 분리한 바실러스 속 WL-1(Bacillussp. WL-1) 균주 (기탁번호 KCTC 0800BP).
트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 5 g/L, 박토아가 18 g/L를 함유하는 LB 한천배지에 밀기울 1.0 ∼ 3.0% 또는 유당 0.5 ∼ 3.0%을 함유시킨 후 상기 제 1 항의 바실러스 속 WL-1 균주를 접종하고 배양함을 특징으로 하는 만난아제 생산방법
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